第十三章-生化药物和基因工程药物分析概论课件

生化药物和基因工程药物分析概论生化药物和基因工程药物分析概论1

一、药物分类

第一节概述第一节概述2

1．生化药物：

例：氨基酸、多肽、蛋白质、酶等。

1．生化药物：

例：氨基酸、多肽、蛋白质、酶32.基因工程药物：以DNA重组技术生产的蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞生长因子类药物。2.基因工程药物：4二、种类氨基酸、多肽与蛋白质类酶类与辅酶类多糖类脂质类核酸及其降解物和衍生物类药物1．生化药物二、种类氨基酸、多肽与蛋白质类酶类与辅酶类多糖类脂质类核酸及52．基因工程药物的种类

1）激素类及神经递质类药物：

人生长激素释放抑制因子、人胰岛素、人生长激素

2）细胞因子类药物：

人干扰素人白细胞介素、集落刺激因子、促红细胞生成素

3）酶类及凝血因子类药物

2．基因工程药物的种类

1）激素类及神经递质类药物：6

三、特点

1.生物体的基本生化成分

2.分子量大:分子量测定

3.结构难确证

4.全过程的质量控制：原料、生产过程、

最终产品

5.生物活性检查

三、特点

1.生物体的基本生化成分7

6.安全性检查

7.效价（含量）测定：

理化法：有效成分的含量

效价测定和酶活力测定：有效成分的生物活性6.安全性检查

7.效价（含量）测定：

8

生化药物和基因药物质量控制的项目：

来源与种类纯度

性状干燥失重或水分

鉴别炽灼残渣

氨酸组分分析生物活性

肽图热源试验

糖含量含量分析

第二节质量检验的基本程序与方法

生化药物和基因药物质量控制的项目：

9一、鉴别

理化鉴别法：化学鉴别法

紫外分光光度法

HPLC法

生化鉴别法：酶法

电泳法

等电聚焦法

生物鉴别法：家兔惊厥试验一、鉴别

理化鉴别法：化学鉴别法

10（一）理化鉴别法1.化学鉴别法：

例：溶菌酶-CONH-+Cu2+络合显色（一）理化鉴别法11

2.紫外分光光度法

溶剂：0.01mol/L盐酸例：三磷酸腺苷二钠浓度：20μg/ml判断：λmax：257±1nmA250/A260：0.17～0.27。3.HPLC法：

利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留时间和肽图谱的一致性进行鉴别。

124.酶法：

例：尿激酶的鉴别---气泡上升法

原理：4.酶法：13

方法：

取小试管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纤维蛋白原溶液，再依次加入牛纤维蛋白溶酶原溶液、牛凝血酶溶液，迅速摇匀，立即置37℃±0.5℃恒温水浴保温，记时。反应系统在30～40秒内凝结，凝结块内有气泡生成，15分钟内凝结块溶解，当凝结块溶解时，气泡逐渐上升。以0.9%氯化钠作空白，同法操作，凝结块在2小时内不溶。第十三章-生化药物和基因工程药物分析概论课件145.电泳法：以肝素鉴别为例。与国家肝素标准品对照，其移动位置相应。5.电泳法：以肝素鉴别为例。与国家肝素标准品对照，其移动位15

6.生物法：

利用生物体进行试验来鉴别药物。例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。利用胰岛素的降糖作用。给家兔大剂量注射胰岛素，家兔惊厥，迅速静注50%GS，惊厥停止。6.生物法：16（二）杂质检查

一般杂质检查

特殊杂质检查：原料药纯度分析

生产过程中杂质的检查

1.原料药纯度分析：

多糖类-----低聚糖、核酸、蛋白质

酶类药物-----酶催化反应基本产物的分析，具有一定活性的其他有关酶的检查。

（二）杂质检查17例：胰蛋白酶中糜蛋白酶的检查

选用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯作底物进行糜蛋白酶的限度检查。糜蛋白酶的限度为2500个胰蛋白酶单位中不得大于50单位，按每1mg胰蛋白酶为2500个单位和每1mg糜蛋白酶为1000单位，折算成重量，则糜蛋白酶的限度为5%（g/g）。

1:1000=x:50x=0.05（mg）L=0.05/1=5%

2.生产过程中杂质的检查例：胰蛋白酶中糜蛋白酶的检查

选用N-乙酰-L-酪氨18

（三）安全性试验

热源试验

异常毒性试验:急性毒性物质

过敏试验：异性蛋白

降压物质试验：导致血压降低的杂质、组

胺、类组胺

（三）安全性试验

热源试验

19

无菌试验：活菌

基因工程药物中可能杂质与污染物检查

来源于宿主细胞的残留DNA，外源性杂质

致突变试验

生殖毒性试验无菌试验：活菌

基因工程药物中可能杂质与污染物20（四）含量测定

生化药物和基因药物的含量表示方法：

百分含量：适用于结构明确的小分子药

物或经水解后变成小分子的

药物。

生物效价或酶活力单位：适用于酶类、

蛋白质类药物。

（四）含量测定

生化药物和基因药物的含量表示方法：

百分含量21含量测定方法：

理化分析法：

化学分析法：重量测定法、滴定分析法

电化学分析法

光谱分析法：比色法、紫外分光、荧光分光光法

色谱分析法：HPLC法：RP-HPLC、HPIEC、HPGFC、

灌注色谱法、HPCE法

酶法：酶活力测定法、酶分析法

电泳法

生物检定法含量测定方法：

理化分析法：

化学分析法：重量测22

1．电化学分析法

药物膜电极

生物组织膜电极

药物电极微生物电极

离子选择性电极法免疫电极

免疫场效应管

酶电极

第三节常用定量分析方法及其应用

1．电化学分析法药物膜电极

23

2.HPLC法

1）RP-HPLC：柱前衍生化自动测定氨基酸

柱：RP—18，柱温：48℃

流动相：A--0.05%TFA；B--乙腈-异丙醇（4：1）

梯度洗脱

荧光检测器：ex=280nm～340nm,em=430nm2.HPLC法

1）RP-HPLC24

测定：

样品---肽

样品水解：5.7mol/L盐酸，0.1%苯酚、通N2，

110℃，20h～24h。

样品干燥：真空

样品的衍生化：丹酰氯

水解剩余的衍生化试剂：0.4mol/LNaOH

进样测定

测定：

样品---肽

样品水解：5.7mol25第十三章-生化药物和基因工程药物分析概论课件26第十三章-生化药物和基因工程药物分析概论课件272）HPIEC

测定对象：蛋白质，多肽柱：离子交换键合相流动相：0.3mol/L～1.0mol/L的盐的缓冲液。梯度洗脱：盐的浓度增大。尽量避免使用卤素类盐特点：可回收活性蛋白。2）HPIEC28

3）HPGFC应用：蛋白质、多肽的分离及分子量测定。示例：重组人肿瘤坏死因子衍生物的分子量的测定柱：BeckmanUltraspherogelSEC3000流动相：0.1mmol/LKH2PO4:0.1mmol/LNa2SO4

（1:1）0.05%叠氮化钠第十三章-生化药物和基因工程药物分析概论课件29第十三章-生化药物和基因工程药物分析概论课件30第十三章-生化药物和基因工程药物分析概论课件312．酶活力测定法

1）基本原理：

酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越高。

2．酶活力测定法

1）基本原理：

酶活力是指酶催化32

酶反应速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示。

通常酶活力测定时，先制备酶反应进程曲线和酶浓度曲线。通过酶反应速度的测定，求得酶的浓度或含量。酶反应速度可以用单位时间反应底物的减少或产33酶反应进程曲线纵坐标为底物或产物的变化量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。

酶浓度曲线纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。

酶反应进程曲线纵坐标为底物或产物的变化量，横坐标为反应时间34

35酶活力测定的要求：测得的反应速度必须和酶浓度有线性的比例关系，这也是检验酶反应和测定系统是否适宜、正确的标准。

酶活力测定的要求：测得的反应速度必须和酶浓度有线性的比例关系362）酶促反应的条件及影响因素

底物的浓度：一般选用底物的浓度[S]=100Km。

pH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、

适宜的pH值的缓冲系统来控制pH。

温度：酶反应的温度通常选用25℃、30℃或

37℃，实验中温度变动应控制在±0.1℃以内。

辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要

相应的辅酶。2）酶促反应的条件及影响因素

底物的浓度：一般选用底物37空白和对照试验：

空白试验：是指杂质反应和自发反应引起的变化量，它提供的是未知因素的影响。空白值可以通过不加酶，或不加底物，或二者都加（酶预先经过失效处理）。

对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果，主要作为比较或标定的标准。

空白和对照试验：

空白试验：是指杂质反应和自发反应引383）测定方法：取样测定法：3）测定方法：39连续测定法：在反应过程中对反应系统进行直接连续检测。检测方法：紫外-可见分光光度法旋光法荧光分光光度法电化学测定法酶偶联测定法离子选择性电极测定法等。

连续测定法：在反应过程中对反应系统进行直接连续检测。40示例：胰蛋白酶效价测定

胰蛋白酶肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸）

水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键

供试品溶液：50～60单位/ml

底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯

浓度：A：0.575～.0585

N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯N-苯甲酰-L-精氨酸

示例：胰蛋白酶效价测定

胰蛋白酶肽键、酰氨键、酯键（41

253nm处的A随酶促反应递增，根据酶活力单位定义计算酶活力。

253nm处的A随酶促反应递增，根据酶42酶活性单位：在最适的条件下，每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量定为一个活性单位。

测定：

空白：底物溶液+0.001mol/LHCl

酶活性单位：在最适的条件下，每分钟能转化一个微摩尔底物的酶量43

每30sA的改变：0.015～0.018，呈线性关系的时间不得少于3min。每30sA的改变：0.015～0.018，呈线性关44

A每分钟改变0.003，相当于1个胰蛋白酶单位。

供试液的A每分钟改变

A每分钟改变0.003，相当于1个胰蛋白酶单位。

45相当于的单位数为每mg供试品中含胰蛋白酶单位数为相当于的单位数为46

重组人白细胞介素11的胰蛋白酶切肽图分析肽图分析是评价重组产品蛋白质结构及其生产工艺稳定性的重要方法,目前常用的方法有ＣＮＢｒ裂解ＳＤＳ-ＰＡＧＥ微量肽图法和胰蛋白酶切ＲＰＨＰＬＣ肽图法。第十三章-生化药物和基因工程药物分析概论课件47

1。酶切条件取浓度为3ｍｇ·ｍＬ-1的样品04ｍＬ对1%ＮＨ4ＨＣＯ3充分透析,然后取透析样品250μＬ至微量进样瓶,加03ｍｇ·ｍＬ-1ＴＰＣＫ处理的胰蛋白酶10μＬ混匀,于37℃温控自动进样器酶切,每80ｍｉｎ进样一针,进样量6μＬ,用Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ32色谱软件选择214ｎｍ进行分析,直至ｒｈＩＬ11完全酶解。按此方法摸索最佳酶切时间,在第14针后ｒｈＩＬ11已被完全酶切,酶切时间在18～22ｈ范围内肽图图谱基本一致,即确定最佳酶切条件为37℃保温20ｈ。1。酶切条件48

2。ＨＰＬＣ系统测试ＨＰＬＣ系统测试标准物质进样后呈3个峰,12次重复进样3个峰保留时间的ＲＳＤ分别为0.4%,0.6%和0.8%,峰面积的ＲＳＤ分别为0.7%,0.8%和0.8%。ｒｈＩＬ11对照品37℃酶切20ｈ后于4℃温控自动进样器连续进样5次,结果见图1。5个色谱图完全重叠在一起,所产生21个峰的保留时间、峰高和峰面积的ＲＳＤ均分别小于1.0%,5.4%和9.8%,表明本系统误差小,重复性好,可用于ｒｈＩＬ11的肽图分析。2。ＨＰＬＣ系统测试49

3批ｒｈＩＬ11制品的ＲＰＨＰＬＣ图谱完全一致,说明该厂ｒｈＩＬ11的生产工艺是稳定的;与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ11对照品比较有20个峰与对照品一致,但第6峰的峰高和峰面积均明显较小,且在第9和第10峰之间多一个峰,说明该厂ｒｈＩＬ11蛋白质结构与ＧＩ公司生产的ｒｈＩＬ11比较存在细小差别。

50第十三章-生化药物和基因工程药物分析概论课件51生化药物和基因工程药物分析概论生化药物和基因工程药物分析概论52

一、药物分类

第一节概述第一节概述53

1．生化药物：

例：氨基酸、多肽、蛋白质、酶等。

1．生化药物：

例：氨基酸、多肽、蛋白质、酶542.基因工程药物：以DNA重组技术生产的蛋白质、多肽、酶、激素、疫苗、单克隆抗体和细胞生长因子类药物。2.基因工程药物：55二、种类氨基酸、多肽与蛋白质类酶类与辅酶类多糖类脂质类核酸及其降解物和衍生物类药物1．生化药物二、种类氨基酸、多肽与蛋白质类酶类与辅酶类多糖类脂质类核酸及562．基因工程药物的种类

1）激素类及神经递质类药物：

人生长激素释放抑制因子、人胰岛素、人生长激素

2）细胞因子类药物：

人干扰素人白细胞介素、集落刺激因子、促红细胞生成素

3）酶类及凝血因子类药物

2．基因工程药物的种类

1）激素类及神经递质类药物：57

三、特点

1.生物体的基本生化成分

2.分子量大:分子量测定

3.结构难确证

4.全过程的质量控制：原料、生产过程、

最终产品

5.生物活性检查

三、特点

1.生物体的基本生化成分58

6.安全性检查

7.效价（含量）测定：

理化法：有效成分的含量

效价测定和酶活力测定：有效成分的生物活性6.安全性检查

7.效价（含量）测定：

59

生化药物和基因药物质量控制的项目：

来源与种类纯度

性状干燥失重或水分

鉴别炽灼残渣

氨酸组分分析生物活性

肽图热源试验

糖含量含量分析

第二节质量检验的基本程序与方法

生化药物和基因药物质量控制的项目：

60一、鉴别

理化鉴别法：化学鉴别法

紫外分光光度法

HPLC法

生化鉴别法：酶法

电泳法

等电聚焦法

生物鉴别法：家兔惊厥试验一、鉴别

理化鉴别法：化学鉴别法

61（一）理化鉴别法1.化学鉴别法：

例：溶菌酶-CONH-+Cu2+络合显色（一）理化鉴别法62

2.紫外分光光度法

溶剂：0.01mol/L盐酸例：三磷酸腺苷二钠浓度：20μg/ml判断：λmax：257±1nmA250/A260：0.17～0.27。3.HPLC法：

利用对照品溶液和供试品溶液色谱图的保留时间和肽图谱的一致性进行鉴别。

634.酶法：

例：尿激酶的鉴别---气泡上升法

原理：4.酶法：64

方法：

取小试管，加入尿激酶巴比妥溶液、牛纤维蛋白原溶液，再依次加入牛纤维蛋白溶酶原溶液、牛凝血酶溶液，迅速摇匀，立即置37℃±0.5℃恒温水浴保温，记时。反应系统在30～40秒内凝结，凝结块内有气泡生成，15分钟内凝结块溶解，当凝结块溶解时，气泡逐渐上升。以0.9%氯化钠作空白，同法操作，凝结块在2小时内不溶。第十三章-生化药物和基因工程药物分析概论课件655.电泳法：以肝素鉴别为例。与国家肝素标准品对照，其移动位置相应。5.电泳法：以肝素鉴别为例。与国家肝素标准品对照，其移动位66

6.生物法：

利用生物体进行试验来鉴别药物。例：家兔惊厥试验鉴别胰岛素。利用胰岛素的降糖作用。给家兔大剂量注射胰岛素，家兔惊厥，迅速静注50%GS，惊厥停止。6.生物法：67（二）杂质检查

一般杂质检查

特殊杂质检查：原料药纯度分析

生产过程中杂质的检查

1.原料药纯度分析：

多糖类-----低聚糖、核酸、蛋白质

酶类药物-----酶催化反应基本产物的分析，具有一定活性的其他有关酶的检查。

（二）杂质检查68例：胰蛋白酶中糜蛋白酶的检查

选用N-乙酰-L-酪氨酸乙酯作底物进行糜蛋白酶的限度检查。糜蛋白酶的限度为2500个胰蛋白酶单位中不得大于50单位，按每1mg胰蛋白酶为2500个单位和每1mg糜蛋白酶为1000单位，折算成重量，则糜蛋白酶的限度为5%（g/g）。

1:1000=x:50x=0.05（mg）L=0.05/1=5%

2.生产过程中杂质的检查例：胰蛋白酶中糜蛋白酶的检查

选用N-乙酰-L-酪氨69

（三）安全性试验

热源试验

异常毒性试验:急性毒性物质

过敏试验：异性蛋白

降压物质试验：导致血压降低的杂质、组

胺、类组胺

（三）安全性试验

热源试验

70

无菌试验：活菌

基因工程药物中可能杂质与污染物检查

来源于宿主细胞的残留DNA，外源性杂质

致突变试验

生殖毒性试验无菌试验：活菌

基因工程药物中可能杂质与污染物71（四）含量测定

生化药物和基因药物的含量表示方法：

百分含量：适用于结构明确的小分子药

物或经水解后变成小分子的

药物。

生物效价或酶活力单位：适用于酶类、

蛋白质类药物。

（四）含量测定

生化药物和基因药物的含量表示方法：

百分含量72含量测定方法：

理化分析法：

化学分析法：重量测定法、滴定分析法

电化学分析法

光谱分析法：比色法、紫外分光、荧光分光光法

色谱分析法：HPLC法：RP-HPLC、HPIEC、HPGFC、

灌注色谱法、HPCE法

酶法：酶活力测定法、酶分析法

电泳法

生物检定法含量测定方法：

理化分析法：

化学分析法：重量测73

1．电化学分析法

药物膜电极

生物组织膜电极

药物电极微生物电极

离子选择性电极法免疫电极

免疫场效应管

酶电极

第三节常用定量分析方法及其应用

1．电化学分析法药物膜电极

74

2.HPLC法

1）RP-HPLC：柱前衍生化自动测定氨基酸

柱：RP—18，柱温：48℃

流动相：A--0.05%TFA；B--乙腈-异丙醇（4：1）

梯度洗脱

荧光检测器：ex=280nm～340nm,em=430nm2.HPLC法

1）RP-HPLC75

测定：

样品---肽

样品水解：5.7mol/L盐酸，0.1%苯酚、通N2，

110℃，20h～24h。

样品干燥：真空

样品的衍生化：丹酰氯

水解剩余的衍生化试剂：0.4mol/LNaOH

进样测定

测定：

样品---肽

样品水解：5.7mol76第十三章-生化药物和基因工程药物分析概论课件77第十三章-生化药物和基因工程药物分析概论课件782）HPIEC

测定对象：蛋白质，多肽柱：离子交换键合相流动相：0.3mol/L～1.0mol/L的盐的缓冲液。梯度洗脱：盐的浓度增大。尽量避免使用卤素类盐特点：可回收活性蛋白。2）HPIEC79

3）HPGFC应用：蛋白质、多肽的分离及分子量测定。示例：重组人肿瘤坏死因子衍生物的分子量的测定柱：BeckmanUltraspherogelSEC3000流动相：0.1mmol/LKH2PO4:0.1mmol/LNa2SO4

（1:1）0.05%叠氮化钠第十三章-生化药物和基因工程药物分析概论课件80第十三章-生化药物和基因工程药物分析概论课件81第十三章-生化药物和基因工程药物分析概论课件822．酶活力测定法

1）基本原理：

酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力测定实质上是测定一个被酶所催化的化学反应速度。酶反应速度越快所表示的酶活力越高。

2．酶活力测定法

1）基本原理：

酶活力是指酶催化83

酶反应速度可以用单位时间反应底物的减少或产物的增加来表示。

通常酶活力测定时，先制备酶反应进程曲线和酶浓度曲线。通过酶反应速度的测定，求得酶的浓度或含量。酶反应速度可以用单位时间反应底物的减少或产84酶反应进程曲线纵坐标为底物或产物的变化量，横坐标为反应时间，曲线斜率表示反应速度。从酶反应进程曲线求得反应的初速度。

酶浓度曲线纵坐标为反应速度，横坐标为酶量。通过酶浓度曲线检验反应测定系统是否适宜。

酶反应进程曲线纵坐标为底物或产物的变化量，横坐标为反应时间85

86酶活力测定的要求：测得的反应速度必须和酶浓度有线性的比例关系，这也是检验酶反应和测定系统是否适宜、正确的标准。

酶活力测定的要求：测得的反应速度必须和酶浓度有线性的比例关系872）酶促反应的条件及影响因素

底物的浓度：一般选用底物的浓度[S]=100Km。

pH：选用一个适宜的缓冲离子和离子强度、

适宜的pH值的缓冲系统来控制pH。

温度：酶反应的温度通常选用25℃、30℃或

37℃，实验中温度变动应控制在±0.1℃以内。

辅助因子：有些酶需要金属离子，有些需要

相应的辅酶。2）酶促反应的条件及影响因素

底物的浓度：一般选用底物88空白和对照试验：

空白试验：是指杂质反应和自发反应引起的变化量，它提供的是未知因素的影响。空白值可以通过不加酶，或不加底物，或二者都加（酶预先经过失效处理）。

对照试验：是指用纯酶或标准酶制剂测得的结果，主要作为比较或标定的标准。

空白和对照试验：

空白试验：是指杂质反应和自发反应引893）测定方法：取样测定法：3）测定方法：90连续测定法：在反应过程中对反应系统进行直接连续检测。检测方法：紫外-可见分光光度法旋光法荧光分光光度法电化学测定法酶偶联测定法离子选择性电极测定法等。

连续测定法：在反应过程中对反应系统进行直接连续检测。91示例：胰蛋白酶效价测定

胰蛋白酶肽键、酰氨键、酯键（碱性氨基酸）

水解速率：酯键﹥酰氨键﹥肽键

供试品溶液：50～60单位/ml

底物溶液：N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯

浓度：