实验九 总RNA的提取

实验九总RNA的提取、定量与RT-PCR一、总RNA的提取与定量目的：从细胞中分离RNA是分子生物学实验经常进行的操作之一，所提取RNA的质量是进行其它实验的基础，如Northern杂交，目的基因cDNA的克隆，荧光定量，文库构建等。原理：在哺乳动物中，平均每个细胞内大约含有10-5gRNA，其中rRNA占总量的80%-85%，tRNA和核内小分子RNA占10-15%，而mRNA只占1-5%。rRNA由28S、18S、5S等几类组成，这些RNA分子根据密度和分子大小，通过密度梯度离心、凝胶电泳、离子交换层析进行分离。mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在细胞中含量少，绝大多数mRNA分子(除血红蛋白、有些组蛋白mRNA以外)，在3’端存在20-250个多聚腺苷酸(polyA)。利用此特点，用oligo(dT)亲和层析柱分离mRNA。RNA分离的方法有：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法，盐酸胍-有机溶剂法，氯化锂-尿素法，蛋白酶K-细胞质RNA提取法等、异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法等。目前常用的是Trizol法。Trizol试剂适用于从细胞和组织中快速分离RNA。TRIzol的主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8—羟基喹啉、0-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA选择性地进入无DNA和蛋白质的水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。Trizol试剂可用于小量样品(50〜100mg组织、5X106细胞)也适用于大量样品(31g组织、＞107细胞)。对人，动物，植物组织，细菌均适用，整个提取过程在一小时内即可完成。分离的总RNA无蛋白质和DNA污染，可用于Northernblot，dotblot，ployA筛选，体外翻译，RNase保护分析和分子克隆。在用于RT-PCR时如果两条引物存在于一个单一外显子内，建议用无RNase的DNaseI处理RNA样品，避免出现假阳性。共纯化的DNA可用作标准，比较不同样品RNA的得率，也可用于PCR和酶切。蛋白质可用于westernblotting0核酸的最大吸收波长为260nm，蛋白质为280nm，在波长260nm时，1OD值相当于双链DNA浓度为50gg/ml，单链DNA和RNA浓度为40gg/ml，单链寡核苷酸的含量为33gg/ml，可以据此来计算核酸样品的浓度，还可通过测定在260nm和280nm的OD值的比值(OD260/OD280)，估计核酸的纯度。纯净DNA的比值为1.8,RNA为2.0。若样品中含有酚和蛋白质将导致比值降低。270nm存在高吸收表明有酚的干扰。紫外分光光度法只能用于测定浓度大于0.25gg/ml的核酸溶液，对浓度更小的样品，可采用荧光分光光度法。仪器和主要试剂：紫外分光光度计、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管Trizol试剂氯仿异丙醇75%乙醇无RNase的水或0.5%SDS（溶液均需用DEPC处理过的水配制）实验方法：（一）RNA提取匀浆处理：a,组织将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1mlTrizol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过Trizol体积10%。b.单层培养细胞直接在培养板中加入Trizol裂解细胞，每10cm2面积加1ml，用移液器吸打几次。Trizol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。Trizol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。c,细胞悬液离心收集细胞，每5-10X106动物、植物、酵母细胞或1X107细菌细胞加入1mlTrizol，反复吸打。加Trizol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。（注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量RNA的前提；细胞数量与Trizol的比例，细胞的数量不能过多。）将匀浆样品在室温（15-30°C）放置5min，使核酸蛋白复合物完全分离。可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8C10000Xg离心10min，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。每使用1mlTrizol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min。（注意：此步振荡非常重要，建议在旋涡振荡器上进行。）2-8C10000Xg离心15min。样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用Trizol试剂的60%。把水相转移到新管中（如要分离DNA和蛋白质可保留有机相），用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTrizol加入0.5ml异丙醇，室温放置10min。2-8C10000g离心10min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。用75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1mlTrizol至少加1ml75%乙醇。2-8C不超过7500g离心5min，弃上清。室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，不要晾得过干，否则不易溶解，大约晾5-10min。加入25-200l无RNase的水，-70C保存。（二）紫外吸收检测RNA的浓度和纯度紫外分光光度计先用水在260nm和280nm两个波长下校零。取RNA样品5gl，用水稀释50~100倍，转入分光光度计的石英比色杯中。在260nm和280nm分别读出样品OD值。根据260nm时1OD单位的单链RNA=40%/ml和稀释倍数，可以计算出样品RNA的浓度和产量。若OD260/OD28。小于2，说明可能有DNA片段污染，可以考虑用无RNase的DNase处理样品，若小于1.8，说明样品中还可能含有蛋白质或酚，应再用酚氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化RNA。注意事项：从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA是可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加1mlTrizol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10^gRNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。匀浆后加氯仿之前样品可在-60〜-70°C保存至少一个月。RNA沉淀可保存在75%酒精中2-8C一个星期以上或-5--20C一年以上。预期产量：1mg组织或1X106细胞提取RNA分别为：肝和脾6-10^g，肾3-4^g，骨骼肌和脑组织1-1.5^g，胎盘1-4^g，上皮细胞8-15|!g，成纤维细胞5-7|ig。蛋白聚糖和多糖污染：沉淀RNA的过程中作以下改进可去除这些污染，步骤7中，每使用1mlTrizol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液（0.8mol/L柠檬酸钠和1.2mol/LNaCl）混合离心，按之前操作进行。这种方法可使蛋白聚糖和多糖留在溶液中，高效沉淀出纯RNA。从含有大量多糖的植物中提取RNA时应在匀浆后离心，并加上以上操作步骤。预防RNase污染措施：1）经常更换新手套，皮肤上常带有的细菌，霉菌可能成为RNase的来源。2）使用灭过菌的RNA专用塑料制品避免交叉污染。3）RNA在Trizol试剂中时不会被RNase污染，但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150C烘烤4小时，塑料制品可在0.5mol/LNaOH中浸泡10分钟，然后用水彻底清洗，高压灭菌，即可去除RNase。4）配制溶液应使用无RNase的水（将水加入处理过不含RNase的玻璃瓶中，加入DEPC至终浓度0.01%v/v，放置过夜，高压灭菌。注：DEPC有致癌之嫌，需小心操作。RNA的提取常见问题分析问题解析得率低样品裂解或匀浆处理不彻底RNA沉淀未完全溶解A260/A280<A.检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中1.65样品匀浆时加的试剂量太少匀浆样品时未在室温放置5分钟。吸取水相时混了有机相RNA沉淀未完全溶解。RNA降解A.组织取出后没有马上处理或冷冻待提取RNA的样品没有保存于-60至-70°C，而保存在了-5至-20°C细胞在胰酶处理时过度溶液或离心管未经RNase去除处理DNA污染A.样品匀浆时加的试剂量太少B.样品中含有有机溶剂(如乙醇,DMSO等)，强缓冲液或碱性溶液二、逆转录-聚合酶链反应(ReverseTranscription-PolymeraseChainReactionRT-PCR)原理：提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(dT)或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。反转录酶的选择Money鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37Co禽成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42CoThermusthermophilus、Thermusflavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA,以消除RNA模板的二级结构。MMLV反转录酶的RNaseH-突变体：商品名为Superscript和SuperScriptll。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNAo合成cDNA引物的选择随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。仪器和主要试剂：基因扩增仪(如PEGeneAmpPCRSystem2400或9700)、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管RNA提取试剂3.第一链cDNA合成试剂盒dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mmol/LTaqDNA聚合酶实验方法：总RNA的提取：见前述内容。cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以TAKARA公司提供的PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit试剂盒为例。在0.2ml微量离心管中，加入以下：总RNA1-5pgTOC\o"1-5"\h\zdNTP1plRandomprimer1pl补充适量的DEPCH2O使总体积达10pl。轻轻混匀、离心。PCR仪上65°C加热5min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。然后加入下列试剂的混合物：5xPrimeScriptbuffer4glRNaseinhibator0.5glRTase1glRNasefreeH2O4.5gl轻轻混匀，离心.30C孵育10min。42C孵育60min。于70C加热15min以终止反应，将管插入冰中。PCR：取0.5mlPCR管，依次加入下列试剂：TOC\o"1-5"\h\z第一链cDNA2gl上游引物(10pmol/L)2gl下游引物(10pmol/L)2gldNTP(2mmol/L)4gl10xPCRbuffer5glTaq酶(2U/妇)1gl加入适量的ddH2O,使总体积达50gl。轻轻混匀，离心。设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参(如G-3-PD)的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。电泳鉴定：进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带扫描分析。注意事项：在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G-3-PD(3-磷酸甘油醛脱氢酶)、p-Actin(p-肌动蛋白)等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标