γ-干扰素的抗肝纤维化动物实验和临床研究进展

γ-干扰素的抗肝纤维化动物实验和临床研究进展

γ-干扰素(IFN-γ)是在IFN-a发现8年后由Weellock发现，1982年美国γray等人分离克隆出IFN-γ基因。80年代中期，通过基因工程技术生产出重组人IFN-γ(rhIFN-γ)，它与天然的人IFN-γ不同之处仅是无糖基化，生物学效应与天然者无显著差异。IFN-γ的免疫调节功能较IFN-a强10～1000倍。1989年德国首先批准上市。初期，英国、德国用于治疗类风湿性关节炎，日本用于治疗肾癌，美国用于治疗慢性肉芽肿。目前IFN-γ已广泛应用临床，治疗：(1)自身免疫性疾病，例如类风湿性关节炎，系统性硬化，特发性皮炎，系统性红斑狼疮，哮喘，Rechcet’s病；(2)病毒性疾病，如慢性乙型肝炎，亚急性重症肝炎，尖锐湿疣，病毒性脑炎，呼吸道合胞病毒支气管肺炎，带状疱疹病毒性角膜炎，寻常疣等；(3)抗肿瘤作用(肾、肺、卵巢、乳房、肝等癌及血液系肿瘤)；(4)抗感染作用，可能是通过提高机体细胞与体液免疫而起作用。近年发现IFN-γ具有较强的抗肝纤维化作用，是肝纤维化发展中的一个关键调节因子，现就这方面略加讨论。

一、IFN-γ抗肝纤维化的动物实验研究

1.血吸虫病肝纤维化的动物模型：Czaja等(1989)报道曼氏血吸虫感染鼠肝纤维化动物模型，在感染后４周，每天肌注IFN-γ(5～10)×104U共４周，其后解剖发现肝总胶原量明显下降，用northernblot法分析可见Ⅰ型和Ⅲ型前胶原mRNA水平分别是未用IFN-γ组的32%和29%。浙江大学陈祥明等研究日本血吸虫病肝纤维化兔时发现经100×104UIFN-γ治疗后，门脉压显著低于未治疗组。贺永文等发现IFN-γ可减轻鼠血吸虫病肝纤维化程度。经IFN-γ治疗后，肝内各部位胶原的降解不均一，Lortat-Jacob等发现用IFN-γ治疗可使总胶原下降28%，经仔细分析胶原分布，发现IFN-γ对几乎不表达乙酸肝素硫酸盐的肉芽肿周围的纤维组织无作用，而富含乙酸肝素硫酸盐的间质胶原（小叶间隔）的含量下降了74%，这与IFN-γ受体有关，IFN-γ在肝内与乙酸肝素硫酸盐结合，因此只分布在乙酸肝素硫酸盐存在的部位。

2.四氯化碳(CCl4)诱导肝纤维化的动物模型：Rockey等(1994)用CCl4诱导鼠肝纤维化，在其同时用渗透泵的方法持续给予IFN-γ，结果显示给予IFN-γ的鼠肝内肝纤维化程度显著减轻，肝星状细胞(HSC)增殖受抑，数量减少，Ⅰ型前胶原和纤维粘连蛋白(FN)的mRNA水平下降。该研究显示IFN-γ能抑制CCl4诱导肝纤维化动物的HSC的激活和细胞外间质(ECM)的产生。CCl4诱导鼠肝纤维化模型用5×104UIFN-γ每天皮下注射，连续５天可见门脉压显著下降。原因可能是激活的HSC，即肌成纤维细胞(MF)，具有收缩功能，导致肝纤维化时门静脉压增高。Alpini等用25%CCl40.1ml腹腔注射，每周２次，5%的酒精作为饮用水制作的肝硬化小鼠模型，发现小鼠除了胶原大量增加外，胆管的数目也大量增加，正常鼠一个门静脉区只有一个肝内胆管，肝纤维化模型鼠则多个，定量结果分别为(0.62±0.04)%和(0.95±0.07)%，P＜0.05，认为胆管上皮细胞数目的大量增加在肝纤维化形成中也可能起一定作用。而(5～10)×104U的IFN-γ肌注每日一次，治疗10周可获较好的抗肝纤维化结果，组织学检查无肝硬化。另发现IFN-γ还可使胆管数和胆汁分泌减少。

3.二甲亚硝胺(DMN)诱导肝纤维化的动物模型：Baroni等用DMN诱导大鼠肝纤维化，将大鼠分为4组，DMN组(n＝19)；DMN+IFN-γ组(n＝19，IFN-γ5×104U/d)；IFN-γ组(n＝6)；生理盐水组(n＝6)。经处理后7或21天解剖。21天后形态学检查生理盐水与IFN-γ组均属正常肝组织，均作对照组(n＝12)。DMN组鼠２只死亡，３只发生腹水，体重下降80%，丙氨酸转氨酶(ALT)增高(126.8±15.1)，肝形态学检查呈小结节性肝硬化，总胶原为每mγ总蛋白(28.1±0.8)ng，肝内纤维组织面积为(13.7±2.1)%；DMN+IFN-γ组鼠没有死亡与腹水发生，体重下降61%，ALT亦增高(62.8±2.4，对照为26.4±1.0)，形态学检查病变较DMN组为轻，总胶原为mγ总蛋白(20.1±1.1)mγ，对照组为（14.5±1.0)mγ，肝纤维组织面积为(4.5±0.7)%。HSC转化、增殖和Ⅰ型前胶原、层粘连蛋白(LN)、FN的mRNA水平(northernblot法)及肝脏FN、LN的含量(用westernblot法)，均显示DMN组>DMN+IFN-γ组。该研究证明IFN-γ通过对HSC激活的抑制，减少ECM沉积。

4.其它肝纤维化动物模型：如酒精和免疫法等诱导的肝纤维化模型，Sakaida等用猪血清诱导大鼠肝纤维化，以5×103U/d的IFN-γ治疗，大鼠肝内羟脯氨酸含量降低，Ⅰ型和Ⅲ型前胶原表达受抑，活化的HSC，即MF数目减少，认为IFN-γ能通过抑制HSC的活化和增殖来抑制肝纤维化。

我们摸索多种肝纤维化动物模型，用DMN、CCl4制备的肝纤维化SD大鼠，以及用血吸虫感染新西兰兔制备的肝纤维化模型，经IFN-γ治疗后，肝纤维化程度、羟脯氨酸和透明质酸等显著下降，免疫组织化学结果HSC和MF数目减少，认为IFN-γ治疗肝纤维化有效。

二、IFN-γ抗肝纤维化的临床研究

1991年Saez-Royuela等报道用重组IFN-γ，每周以2×106U/m2(人体表面积)，分3次皮下注射，连用6个月，肝组织活动指数(HAI)从治疗前的7.7±1.6降至治后6.3±1.4，而肝纤维化程度分级由1.2±1.0降至0.7±1.0，仅有６例，统计学处理差异无显著性。同时有６例用IFN-a治疗。治前HAI为9.8±1.6，治后为5.7±3.7，而肝纤维化程度分级治疗前、后均为1.4±1，此提示IFN-a对治疗肝纤维化作用不大。1992年美国肝病年会上报道IFN-γ治疗慢性乙型肝炎后，血清PⅢP和Ⅳ型胶原(CⅣ)7S水平均有明显下降，称首次证明IFN-γ的临床疗效。1997年日本学者早坂章报道，用IFN-γ治疗慢性乙型肝炎10例，在给药前及用药结束后分别作肝活检，以a-SMA和TγFb1等指标的免疫组织化学进行对照。结果表明，用药后a-SMA和TγFb1染色减弱，而组织学有改善的病例，其血清PⅢP和CⅣ水平亦相应减低，提示肝内纤维合成受抑，分解亢进，IFN-γ治疗有效。浙江省已用国产IFN-γ治疗100多例慢性肝炎肝纤维化患者，3～6个月后，肝纤维化指标(HA，LN，CⅣ，PCⅢ)均明显下降。有10例治疗前、后肝活组织检查资料亦显示肝纤维化有好转。

三、常见副作用及其处理

多数报道IFN-γ治疗未见严重毒副作用，Rockey等(1992)发现大剂量IFN-γ对细胞活力无影响。Mallat等(1995)报道IFN-γ无细胞毒作用。但Morita等研究TNF-a，IFN-γ，IL-6，IFN-a/b和肝细胞生长因子(HγF)在体外对正常鼠肝细胞的影响时，发现只有IFN-γ具有肝细胞损伤作用，使乳酸脱氢酶含量增高。这是通过使肝细胞凋亡的形式来实现的，且可以被HγF抑制，而被TNF-a促进。国内IFN-γ主要用于类风湿性关节炎，曾由协和医院牵头，17家医院参与进行研究。其次用于尖锐湿疣和多种肿瘤，主要是肌注(半衰期6.0～8.0小时)，亦可胸腹腔注射及肿瘤周围多点注射等。常见副作用是发热，大多数是一过性发热，体温一般不超过38.5℃，一般3～4小时自然恢复。国外临床多为睡前给药，可缓解副反应，易于耐受。其他副作用有头痛、头晕、乏力和多汗等，但发生率较低。

亦有极少数患者出现高热(＞39℃)，甚至伴有寒战。在克隆伽玛进行临床试验时，有个别患者ALT一度轻度增高(1.74%)，停药后恢复，但另有９例原来ALT增高者，治疗后下降或恢复正常，可见γ-干扰素对肝功能基本无影响。此外尚有2.9%的患者出现恶心，3.2%出现皮疹，极个别出现白细胞减少(一般不低于3.0×109/L)，均自行恢复或减量、停药后恢复。尚未见肾功能受影响者。临床见脾增大，可能与免疫增强有关。

文献报道用IFN-a-2b或2a有致黄疸(胆红素血症)者，IFN-γ治疗在临床试验过程中尚未发现黄疸，有学者甚至认为轻度黄疸患者亦可试用IFN-γ，但亦应注意观察。

流感样副作用，是由于IFN-γ属于内源性致热源所致，一般使用3～5天后逐渐减轻乃至不再出现。为减轻副作用，开始使用时可阶段或间歇给药。另为减轻发热，可在注射前１小时使用消炎痛50mγ（口服或肛栓），对其他症状可对症处理。若患者不能耐受则应减量或暂停使用。

临床应严格选择对象，对小儿使用时亦应严密观察。下列情况者应慎用或禁用：(1)病毒性肝炎处于急性进展期，胆红素迅速上升或ALT很高者；(2)肝硬化失代偿期；(3)有重要脏器病变者(严重心、肾疾病，神经系统异常者)；(4)血细胞低于3.0×109/L，血小板低于30.0×109/L。

四、需解决的问题

IFN-γ治疗肝纤维化在临床应用方面存在治疗适应证，剂量与疗程，疗效判断标准等诸多问题，与肝纤维化程度(轻、中、重)、病程(早、中、晚)和病期(活动与静止)有关，与患者本身体内不同IFN-γ水平及其抗体有关。近几年研究(特别是治疗前后肝活检资料)显示，在慢性乙型肝炎、肝硬化、肝细胞肝癌患者的外周血单个核细胞(PBMC)体外IFN-γ诱生活性明显降低。研究显示，慢性肝炎(非活动期，ALT正常)、肝硬化患者肝脏、PBMC中的IFN-γmRNA和血清IFN-γ水平多低于正常人。而Missale等认为慢性丙肝患者血清sIL-2R增高，而IL-2和IFN-γ降低，在其肝内有较高的IL-2、IL-6、IL-10和IFN-γ的mRNA水平。Fukuma等用半定量RT-PCR法测肝内与PBMC内多种细胞因子mRNA，在慢性肝炎活动期(ALT升高)20例(乙、丙型肝炎各一半)，肝脏IFN-γmRNA为3.76±2.05，是健康对照者的23.5倍；血清IFN-γ(ELISA)为38.5±31.2，是健康对照者的5.4倍。有报道在慢性丙型肝炎患者肝脏内IFN-γmRNA水平与ALT成正相关。根据我们现掌握的资料初步认为，凡HBV“健康”携带者、酒精性肝病、