化学发光磁酶免疫课件

化学发光磁酶免疫上世纪60年代出现的放射免疫分析法是近代分析检测领域的一场革命，该法灵敏度和准确度高、特异性强，在相当长的一段时间内被广泛采用。但这种方法也存在以下一些缺点:1.由于采用具有放射性危害的I125为示踪物，在试剂的制造、应用和操作过程中，会对人体造成严重的伤害及对环境产生难以处理的污染。2.由于放射性同位素的危害，国家对医院开展放免分析方法作出了严格的限制和规定，制约了临床诊断医学的发展。3.由于放射性同位素半衰期的限制，决定了放射免疫分析试剂的有效期只有1~2个月。给试剂的制造、运输、用户的使用带来极大不便。化学发光免疫分析（Chemiluminescentimmunoassay,CLIA）是在上世纪70年代末由Halmann和Velan首先提出。该法与其他免疫分析方法如放射免疫分析法、荧光免疫分析法、酶免疫分析法相比，具有特异性好、敏感性高、线性范围宽和仪器设备要求简单等优点。化学发光免疫分析法作为一种非放射性标记的检测技术，克服了放射免疫分析中放射性污染的问题，发光试剂无毒无害，对操作人员不会造成健康侵害，试剂保存周期长。一、化学发光的原理简单来讲，某些物质（发光剂）在化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应的产物分子或反应的中间态分子中的电子跃迁到激发态，当电子从激发态回复到基态时，以发射光子的形式释放出能量，这一现象称为化学发光。化学发光酶免疫分析（chemiluminescenceenzymeimmunoassay，CLEIA）是用参与催化某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶(ALP)来标记抗原或抗体，在与待测标本中相应的抗原(抗体)发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把它们传送至计算机数据处理系统，计算出测定物的浓度。（一）辣根过氧化物酶标记的化学发光免疫分析

该分析系统采用辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶（HRP）标记抗体复合物，这时加入鲁米诺发光剂、H2O2和化学发光增强剂使产生化学发光。1．鲁米诺及其衍生物（二）碱性磷酸酶标记的化学发光免疫分析该分析系统以碱性磷酸酶标记抗体(或抗原)，在与反应体系中的待测标本和固相载体发生免疫反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，这时加入AMPPD发光剂，碱性磷酸酶使AMPPD脱去磷酸根基团而发光。AMPPD〔3-(2‘-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3“-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷〕磁性生物材料以其稳定的化学性质、功能化方便、可磁性富集分离及良好的生物相容性等特性，引起了人们的广泛重视和竞相研究，并被迅速引入生命科学领域的研究中。通常磁球与双手臂偶联剂的一端结合，偶联剂的另一端结合抗体，所形成的免疫磁球可用于捕获相应的抗原，利用磁性分离器可方便地对所形成的复合物富集分离，在通过合适的检测手段来检测待测物质，现在此项技术已被应用于很多分析方法当中。SuperParamagneticMicrospheres

MagneticSeparators1、表面修饰方便，2、生物相容性好3、良好的顺磁性免疫磁球表面的抗体可特异性极强地捕获相应待测物质（如细菌，抗原蛋白），这样磁性微球就变味具有生物活性的磁性材料（免疫磁球）。利用免疫磁球磁性内核的磁响应性，在外加磁场的作用下可方便地与其他杂质成分迅速分离，这样可以使分析检测过程变得简单和更易操作，因此免疫磁球是一种非常有前途的分析手段。二、化学发光磁酶免疫法的优点当免疫磁球被引入到定量分析方法中后，对分析方法的发展起了很大的推动作用。与目前常规使用的微孔板包被法相比，免疫磁球分析方法具有以下显著优点:（1）更好的选择性。1、相对于微孔板，免疫磁球有着大的多的活性比表面积，能提供更多的结合位点。2、可以在溶液中较为均一的分散，其表面所结合抗体的反应位点在溶液中充分暴露，从而显著减小抗原-抗体反应的空间位阻，有利于抗体与待检物质特异性结合，从而极大提高分析方法的选择性。（2）更快的反应速度，更高的灵敏度和检测区间

微孔板包被法中，靶物质通过分子布朗运动和扩散运动到微孔板的速度较慢，而免疫磁球可均匀分布在样品溶液中，更易于接近靶物质，从而加快抗体与靶物质的结合速度，另外化学发光底物比传统的TMB显色底物有着更高的灵敏度和具备更宽的线性范围。（3）易于分离和清洗

其具有良好的超顺磁性，容易被外加磁场所吸附，吸附后的磁球可以简便地与样品溶液分离。由于免疫磁球可以利用磁性分离器方便地对所形成的复合物富集分离，使得洗涤结果更彻底、干扰物浓度极大降低和靶物质浓度有效富集，进而提高分析方法的信噪比和灵敏度。化学发光磁酶免疫法综合了磁性分离技术简便，化学发光法灵敏度高、线性范围广、测定速度快，以及免疫法的特异性、