《细胞工程》第4章动物细胞培养工程课件

细胞工程CellEngineering细胞工程CellEngineering1Chapter4、动物细胞培养工程

4．1概述4．2生产用动物细胞系4．3培养液和培养环境4．4动物细胞培养工艺4．5动物细胞培养过程的放大与优化4．6动物细胞代谢工程4．7动物细胞工程产品制备及质控4．8动物细胞工程表达产品的应用Chapter4、动物细胞培养工程4．1概述24．5动物细胞培养过程的

放大与优化

4．5．1动物细胞培养工艺的研究4．5动物细胞培养过程的

放大与优化

3A、开发重要性：真核细胞表达产物糖基化，有疗效；动物细胞体外培养广泛应用于基因工程蛋白质与病毒疫苗等生产；动物细胞表达产品十分昂贵，开发周期长，研发成本高，技术难度大；如：美国，Immunex公司，已被Amgen公司兼并，生产治疗风湿性关节炎蛋白药物，2.6g/人、年×6154美元/g=16000美元，2002年，销售额达8.02亿美元，其中，被替代损失10亿，因为产量低，计划投入数亿美元，耗时3-5年，扩大规模、优化生产工艺，提高产量。B、主要内容：生产工艺的放大、生产工艺的稳定性和重复性。C、初步研究：首先必须较快建立一个基本（不要求是最优）的细胞培养工艺。A、开发重要性：44．5．2动物细胞培养工艺的优化A、影响蛋白质产量的关键参数，营养物耗尽；B、决定细胞浓度有毒废物的积累

的关键参数培养物理条件的恶化提高蛋白质表达水平C、细胞培养工艺细胞新陈代谢的控制优化策略流加工艺的优化4．5．2动物细胞培养工艺的优化A、影响蛋白质产量的关键参54．5．3动物细胞培养工艺的放大A、生物反应器尺寸放大鼓泡B、氧气的传输提高氧气传递的其它方法搅拌速率和搅拌器的设计C、混合剪切力和细胞损伤D、工业生产中的动物细胞培养4．5．3动物细胞培养工艺的放大A、生物反应器尺寸放大64．6动物细胞代谢工程4．6．1概述

A、生命的代谢活动是通过活细胞和细胞群的代谢网络进行的，后者由一系列酶催化的级联化学反应以及特异性的膜转移系统所构成。然后，活细胞这种自身固有的代谢网络相对实际应用而言，其遗传特性并非最佳，需要对细胞代谢途径进行修饰；4．6动物细胞代谢工程4．6．1概述7B、代谢控制发酵（metaboliccontrolfermentetion）——是指利用遗传学或生物化学方法，人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，使目的产物大量的生成、积累的发酵；C、在代谢控制发酵的理论基础上，提出和形成了“代谢工程”概念；B、代谢控制发酵8D、代谢工程（也称途径工程，pathwayengineering）——是指应用重组DNA技术和分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能和输送体系的功能，甚至改变产能系统的功能，以改变细胞某些方面代谢活性的整套工作（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作和目的代谢活性的实现）；即是指生物化学反应代谢网络有目的地被修饰。D、代谢工程94．6．2基本原理A、代谢网络理论细胞代谢网络由上万种酶催化的系列反应系统、膜传递系统、信号传递系统组成，并且既受精密调节，又互相协调；代谢网络分泌处的代谢产物称为节点。根据可变程度节点可分：柔性节点、刚性节点和半柔性节点；柔性和半柔性节点是代谢工程设计的主要对象，节点刚性程度在改选前要进行分析判断；4．6．2基本原理A、代谢网络理论10生物合成相关代谢调节和调节网络理论代谢工程代谢流及节点分析理论涉及碳源、呼吸系统和氧化还原重新设计主要内容中心代谢产物作用机制及相关代谢分析B、代谢流及中间产物分析——静态分析C、代谢控制分析——动态分析生物合成114．6．3代谢调节的基本类型及其机制A、代谢调节的基本类型直线式代谢的反馈控制协作式多价反馈控制合作反馈控制累积反馈控制顺序反馈控制同工酶控制4．6．3代谢调节的基本类型及其机制A、代谢调节的基本类型12B、酶合成及酶活性的调节机制末端代谢产物阻遏酶的阻遏酶合成的分解代谢物阻遏和酶的诱导酶的诱导与合成变构酶活性的调节同工多功能酶

B、酶合成及酶活性的调节机制134．6．4代谢工程的研究方法A、设计思路改变代谢流扩展代谢途径和构建新的代谢途径常规方法——分子生物、生化、物化代谢通量分析（MFA）—静态B、研究代谢控制分析（MCA）—动态

方法代谢网络生化系统理论（BST）—最优化原理

定量分析控制论模型（CM）—非线性途径分析——途径定位4．6．4代谢工程的研究方法A、设计思路改变代谢流14细胞代谢模型C、代谢模型的

发展与优化神经网络计算生物学方法遗传算法

D、逆代谢工程

154．7动物细胞工程产品制备及质控

4．7．1动物细胞工程产品制备

A、初级分离——离心、过滤、吸附

B、纯化——色谱法

C、制剂与冷冻干燥4．7动物细胞工程产品制备及质控4．7．1动物细胞工程164．7．2动物细胞工程产品的质量控制

PAGE

纯度SDS

液相色谱

A、物化指标测定含量

B、安全性评介分子量

C、稳定性

4．7．2动物细胞工程产品的质量控制174．8动物细胞工程表达产品的应用

4．8．1重组蛋白药物

4．8动物细胞工程表达产品的应用4．8．1重组蛋白药物18《细胞工程》第4章动物细胞培养工程课件19《细胞工程》第4章动物细胞培养工程课件20

A、组织型纤溶酶原活化剂（t-PA）突变体

Tenecteplase，商品名TNKaseTM，急性心肌梗死病人溶栓治疗，人t-PA基因位于8号染色体p12-q11.2，全长36594bp，14个外显子，13个内含子，

t-PA由527个氨基酸，单链糖蛋白，开始酵母表达，不能分离纯化

t-PA突变体，由双链糖蛋白，现用CHO细胞高效表达成功（参见下图）

A、组织型纤溶酶原活化剂（t-PA）突变体21《细胞工程》第4章动物细胞培养工程课件22B、β-干扰素（IFN-β）

最早，为一种在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，普遍存在于个体脾、肝、肾、淋巴细胞、骨髓，被多因素诱发，现为一组多功能细胞因子，具有抗病毒、肿瘤活性，调节免疫反应，控制细胞生长与分化，

B、β-干扰素（IFN-β）最早，为一种在同种细胞23天然IFN-β——刺激体外培养人成纤维细胞，大肠杆菌表达，活性低，不稳定，

Cys17形成二硫键，缺少N-Met，无糖基化重组IFN-β

点突变改造，使Cys17变为中性氨基酸，如：丝、酪氨酸，商品名为：IFN-β-1bCHO细胞表达，与天然一样，天然糖基化，分离简单。

天然IFN-β——刺激体外培养人成纤维细胞，24C、新型红细胞生成刺激蛋白（NESP）D、血友病——缺少凝血因子Ⅶ（FⅦ）或含量过低疾病C、新型红细胞生成刺激蛋白（NESP）25《细胞工程》第4章动物细胞培养工程课件264．8．2MAb药物（参见下图）

——因为体内同一抗原具多个表位，刺激机体产生不同抗体（多克隆抗体）杂交瘤技术能将多克隆抗体纯化为具有高度均一性，抗原识别专一性的MAb，降低抗原识别交叉反应；

4．8．2MAb药物（参见下图）——因为体内同27《细胞工程》第4章动物细胞培养工程课件28《细胞工程》第4章动物细胞培养工程课件29《细胞工程》第4章动物细胞培养工程课件304．8．3基因工程与亚单位疫苗

4．8．3基因工程与亚单位疫苗31A、乙肝疫苗（参见下图）

衣壳——衣壳表面抗原（HBsAg），核心抗原

——核心抗原（HBcAg）、e抗原（HBeAg）和核酸

第一代疫苗，血中提取，弱反应，10%不产生反应，

81-82年，美法，85年，中国第二代疫苗，在哺乳细胞或CHO细胞表达，81年，法美，91、92年，中国第三代疫苗，PreS抗原（重要作用），CHO细胞表达

A、乙肝疫苗（参见下图）衣壳——衣壳表面抗原（32《细胞工程》第4章动物细胞培养工程课件33B、艾滋病疫苗（参见下图）

CHO表达疫苗——理论上，有致瘤性昆虫细胞表达疫苗——昆虫细胞-杆状病毒表达系统（安全性好，容量大，表达效率高）

B、艾滋病疫苗（参见下图）CHO表达疫苗——理论上，有致瘤34《细胞工程》第4章动物细胞培养工程课件35C、肿瘤疫苗

灭活自体肿瘤细胞

对细胞因子基因修饰，主动加强疫苗免疫原性

免疫同种异体的肿瘤细胞

树突状细胞（抗原提呈细胞）体内外诱导CTL生成（细胞毒性T淋巴细胞）激发特异性抗肿瘤免疫功能C、肿瘤疫苗灭活自体肿瘤细胞36（注射用曲妥珠单抗，原产地英文商品名:赫赛汀）

（注射用曲妥珠单抗，原产地英文商品名:赫赛汀）37（Zevalin泽娃灵是世界上第一个放射性标记的单克隆抗体，2002年在美国上市，被批准用于难治复发B细胞非霍奇金淋巴瘤的治疗。）

（Zevalin泽娃灵是世界上第一个放射性标记的单克隆抗体，384．8．4基因治疗产品

基因治疗（genetherapy）——是指把外界的正常基因或治疗基因通过载体转入特定靶细胞，以最终预防或改变特殊疾病状态的治疗方法。基因的转移可通过物理或化学的方法，也可通过各种病毒或非病毒载体的介导，还可通过改造细胞（造血干细胞、成纤维细胞、骨髓肌细胞、肝细胞、神经细胞）进行细胞治疗。

4．8．4基因治疗产品基因治疗（genethe39A、神经系统疾病的基因或细胞治疗：

A、神经系统疾病的基因或细胞治疗：40《细胞工程》第4章动物细胞培养工程课件41B、造血干细胞治疗癌症HSC基因（参见下图）

B、造血干细胞治疗癌症HSC基因（参见下图）42胰岛素依赖型（I）C、细胞、基因代谢治疗糖尿病紊乱非胰岛素依赖型（II）

43【习题】1、名词解释，并简要说明它们间关系：

单抗与疫苗悬浮培养与贴壁培养流加工艺与灌流工艺CHO与HNKtPA与EPO（NESP）艾滋病疫苗与肿瘤疫苗基因治疗与细胞治疗CNTF与HSC2、简述乙肝疫苗发展历程？试规划肝癌疫苗的发展策略？【习题】44演讲完毕，谢谢观看！演讲完毕，谢谢观看！45细胞工程CellEngineering细胞工程CellEngineering46Chapter4、动物细胞培养工程

4．1概述4．2生产用动物细胞系4．3培养液和培养环境4．4动物细胞培养工艺4．5动物细胞培养过程的放大与优化4．6动物细胞代谢工程4．7动物细胞工程产品制备及质控4．8动物细胞工程表达产品的应用Chapter4、动物细胞培养工程4．1概述474．5动物细胞培养过程的

放大与优化

4．5．1动物细胞培养工艺的研究4．5动物细胞培养过程的

放大与优化

48A、开发重要性：真核细胞表达产物糖基化，有疗效；动物细胞体外培养广泛应用于基因工程蛋白质与病毒疫苗等生产；动物细胞表达产品十分昂贵，开发周期长，研发成本高，技术难度大；如：美国，Immunex公司，已被Amgen公司兼并，生产治疗风湿性关节炎蛋白药物，2.6g/人、年×6154美元/g=16000美元，2002年，销售额达8.02亿美元，其中，被替代损失10亿，因为产量低，计划投入数亿美元，耗时3-5年，扩大规模、优化生产工艺，提高产量。B、主要内容：生产工艺的放大、生产工艺的稳定性和重复性。C、初步研究：首先必须较快建立一个基本（不要求是最优）的细胞培养工艺。A、开发重要性：494．5．2动物细胞培养工艺的优化A、影响蛋白质产量的关键参数，营养物耗尽；B、决定细胞浓度有毒废物的积累

的关键参数培养物理条件的恶化提高蛋白质表达水平C、细胞培养工艺细胞新陈代谢的控制优化策略流加工艺的优化4．5．2动物细胞培养工艺的优化A、影响蛋白质产量的关键参504．5．3动物细胞培养工艺的放大A、生物反应器尺寸放大鼓泡B、氧气的传输提高氧气传递的其它方法搅拌速率和搅拌器的设计C、混合剪切力和细胞损伤D、工业生产中的动物细胞培养4．5．3动物细胞培养工艺的放大A、生物反应器尺寸放大514．6动物细胞代谢工程4．6．1概述

A、生命的代谢活动是通过活细胞和细胞群的代谢网络进行的，后者由一系列酶催化的级联化学反应以及特异性的膜转移系统所构成。然后，活细胞这种自身固有的代谢网络相对实际应用而言，其遗传特性并非最佳，需要对细胞代谢途径进行修饰；4．6动物细胞代谢工程4．6．1概述52B、代谢控制发酵（metaboliccontrolfermentetion）——是指利用遗传学或生物化学方法，人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，使目的产物大量的生成、积累的发酵；C、在代谢控制发酵的理论基础上，提出和形成了“代谢工程”概念；B、代谢控制发酵53D、代谢工程（也称途径工程，pathwayengineering）——是指应用重组DNA技术和分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能和输送体系的功能，甚至改变产能系统的功能，以改变细胞某些方面代谢活性的整套工作（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作和目的代谢活性的实现）；即是指生物化学反应代谢网络有目的地被修饰。D、代谢工程544．6．2基本原理A、代谢网络理论细胞代谢网络由上万种酶催化的系列反应系统、膜传递系统、信号传递系统组成，并且既受精密调节，又互相协调；代谢网络分泌处的代谢产物称为节点。根据可变程度节点可分：柔性节点、刚性节点和半柔性节点；柔性和半柔性节点是代谢工程设计的主要对象，节点刚性程度在改选前要进行分析判断；4．6．2基本原理A、代谢网络理论55生物合成相关代谢调节和调节网络理论代谢工程代谢流及节点分析理论涉及碳源、呼吸系统和氧化还原重新设计主要内容中心代谢产物作用机制及相关代谢分析B、代谢流及中间产物分析——静态分析C、代谢控制分析——动态分析生物合成564．6．3代谢调节的基本类型及其机制A、代谢调节的基本类型直线式代谢的反馈控制协作式多价反馈控制合作反馈控制累积反馈控制顺序反馈控制同工酶控制4．6．3代谢调节的基本类型及其机制A、代谢调节的基本类型57B、酶合成及酶活性的调节机制末端代谢产物阻遏酶的阻遏酶合成的分解代谢物阻遏和酶的诱导酶的诱导与合成变构酶活性的调节同工多功能酶

B、酶合成及酶活性的调节机制584．6．4代谢工程的研究方法A、设计思路改变代谢流扩展代谢途径和构建新的代谢途径常规方法——分子生物、生化、物化代谢通量分析（MFA）—静态B、研究代谢控制分析（MCA）—动态

方法代谢网络生化系统理论（BST）—最优化原理

定量分析控制论模型（CM）—非线性途径分析——途径定位4．6．4代谢工程的研究方法A、设计思路改变代谢流59细胞代谢模型C、代谢模型的

发展与优化神经网络计算生物学方法遗传算法

D、逆代谢工程

604．7动物细胞工程产品制备及质控

4．7．1动物细胞工程产品制备

A、初级分离——离心、过滤、吸附

B、纯化——色谱法

C、制剂与冷冻干燥4．7动物细胞工程产品制备及质控4．7．1动物细胞工程614．7．2动物细胞工程产品的质量控制

PAGE

纯度SDS

液相色谱

A、物化指标测定含量

B、安全性评介分子量

C、稳定性

4．7．2动物细胞工程产品的质量控制624．8动物细胞工程表达产品的应用

4．8．1重组蛋白药物

4．8动物细胞工程表达产品的应用4．8．1重组蛋白药物63《细胞工程》第4章动物细胞培养工程课件64《细胞工程》第4章动物细胞培养工程课件65

A、组织型纤溶酶原活化剂（t-PA）突变体

Tenecteplase，商品名TNKaseTM，急性心肌梗死病人溶栓治疗，人t-PA基因位于8号染色体p12-q11.2，全长36594bp，14个外显子，13个内含子，

t-PA由527个氨基酸，单链糖蛋白，开始酵母表达，不能分离纯化

t-PA突变体，由双链糖蛋白，现用CHO细胞高效表达成功（参见下图）

A、组织型纤溶酶原活化剂（t-PA）突变体66《细胞工程》第4章动物细胞培养工程课件67B、β-干扰素（IFN-β）

最早，为一种在同种细胞上具有广谱抗病毒活性的蛋白质，普遍存在于个体脾、肝、肾、淋巴细胞、骨髓，被多因素诱发，现为一组多功能细胞因子，具有抗病毒、肿瘤活性，调节免疫反应，控制细胞生长与分化，

B、β-干扰素（IFN-β）最早，为一种在同种细胞68天然IFN-β——刺激体外培养人成纤维细胞，大肠杆菌表达，活性低，不稳定，

Cys17形成二硫键，缺少N-Met，无糖基化重组IFN-β

点突变改造，使Cys17变为中性氨基酸，如：丝、酪氨酸，商品名为：IFN-β-1bCHO细胞表达，与天然一样，天然糖基化，分离简单。

天然IFN-β——刺激体外培养人成纤维细胞，69C、新型红细胞生成刺激蛋白（NESP）D、血友病——缺少凝血因子Ⅶ（FⅦ）或含量过低疾病C、新型红细胞生成刺激蛋白（NESP）70《细胞工程》第4章动物细胞培养工程课件714．8．2MAb药物（参见下图）

——因为体内同一抗原具多个表位，刺激机体产生不同抗体（多克隆抗体）杂交瘤技术能将多克隆抗体纯化为具有高度均一性，抗原识别专一性的MAb，降低抗原识别交叉反应；

4．8．2MAb药物（参见下图）——因为体内同72《细胞工程》第4章动物细胞培养工程课件73《细胞工程》第4章动物细胞培养工程课件74《细胞工程》第4章动物细胞培养工程课件754．8．3基因工程与亚单位疫苗

4．8．3基因工程与亚单位疫苗76A、乙肝疫苗（参见下图）

衣壳——衣壳表面抗原（HBsAg），核心抗原

——核心抗原（HBcAg）、e抗原（HBeAg）和核酸

第一代疫苗，血中提取，弱反应，10%不产生反应，

81-82年，美法，85年，中国第二代疫苗，在哺乳细胞或CHO细胞表达，81年，法美，91、92年，中国第三代疫苗，PreS抗原（重要作用），CHO细胞表达

A、乙肝疫苗（参见下图）衣壳——衣壳表面抗原（77《细胞工程》第4章动物细胞培养工程课件78B、艾滋病疫苗（参见下图）

CHO表达疫苗——理论上，有致瘤性昆虫细胞表达疫苗——昆虫细胞-杆状病毒表达系统（安全性好，容量大，表达效率高）

B