流式细胞仪基本原理及应用课件

流式细胞仪在临床检测和临床科研中的应用李柏青蚌埠医学院免疫学教研室流式细胞仪在临床检测和临床科研中的应用李柏青-2-流式细胞仪和流式细胞术－概述流式细胞仪的工作原理和测量参数流式细胞仪在临床检测和科研中的应用免疫学检测和科研应用血液病检测和科研应用肿瘤学检测和科研应用流式细胞仪的基本工作原理以及在基础和临床科研中的应用-2-流式细胞仪和流式细胞术－概述流式细胞仪的基本工作原理以-3-一、流式细胞仪和流式细胞术的基本概念流式细胞仪(FlowCytometer，FCM):是集合光电子物理，光电测量技术，液流技术，计算机技术等现代高科技技术为一体的细胞测量和分析仪器。-3-一、流式细胞仪和流式细胞术的基本概念流式细胞仪(Flo-4-一、流式细胞仪和流式细胞术的基本概念流式细胞术(FlowCytometry，FCM):是应用流式细胞仪，对处于快速流动液体中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速测量和定量分析，以及分选的技术。-4-一、流式细胞仪和流式细胞术的基本概念流式细胞术(Flo-5-一、流式细胞仪和流式细胞术－特点多参数测量和分析（散射光和荧光）；快速测量和分析每秒可达1000-10000个细胞分选纯度可达99%以上。获取的数据分析结果更具有统计学意义；通常测量的对象如各种细胞细胞必须处在单个细胞悬液中。此外，也可测量微生物等生物颗粒，或者工合成微球非生物颗粒，-5-一、流式细胞仪和流式细胞术－特点多参数测量和分析（散射-6-台式机——FACSCalibur双激光

488nm 635nm四荧光参数分选、浓缩系统-6-台式机——FACSCalibur双激光77-8-大型机——FACSVantageSE科研型八荧光参数高速分选多路分选-8-大型机——FACSVantageSE-9-

流式细胞仪与荧光显微镜比较

流式细胞仪荧光显微镜

流动的细胞静止的细胞样本数量大数量少高速分选样本难以再利用细胞群体特征量分布可揭示细胞内部结构信息-9-流式细胞仪与荧光显微镜比较流式细胞仪-10-二、流式细胞仪的工作原理和测量参数光路系统：

激光光源，光路系统（透镜、滤光片）电子系统：光电倍增管（PMT），补偿电路液流系统：

鞘液系统，样品流动系统数据系统：计算机，数据测量和分析软件。细胞分选系统（一）流式细胞仪的结构

-10-二、流式细胞仪的工作原理和测量参数光路系统：（一）-11-流式细胞仪－光路系统激光(Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照激光波长:488nm,635nm光收集系统是由若干组透镜,滤波片,小孔组成，将产生的光信号引导至检测器-11-流式细胞仪－光路系统激光(Laser)是一种相干光-12-光路系统-12-光路系统-13-InjectorTip-13-Injector-14-InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid-14-InjectorFluorescencesigna-15-流式细胞仪－光学系统激发光源与荧光标记物-15-流式细胞仪－光学系统激发光源与荧光标记物-16-光学检测信号-16-光学检测信号-17-流式细胞仪的光学系统FACSCalibur-17-流式细胞仪的光学系统FACSCalibur-18-流式细胞仪－液流系统-18-流式细胞仪－液流系统-19-液流系统：鞘液系统＋样品流动系统-19-液流系统：鞘液系统＋样品流动系统-20-流式细胞仪的电子系统

信号检测和分析当细胞携带荧光素,通过激光照射区,受到激发产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号荧光信号由光电接收器接收，转变为电脉冲信号，电脉冲信号经A/D转换成数字信号数字信号传送到计算机，进行储存、作图和统计分析-20-流式细胞仪的电子系统信号检测和分析-21-数据系统-21-数据系统-22-（二）流式细胞仪可检测的细胞参数细胞结构细胞大小细胞颗粒性程度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量细胞功能细胞表面蛋白抗原细胞胞浆内蛋白性抗原细胞内细胞因子细胞增殖细胞内钙离子浓度二、流式细胞仪的工作原理和测量参数-22-（二）流式细胞仪可检测的细胞参数细胞结构细胞功能二-23-（二）流式细胞仪可检测的细胞的参数：

散射光信号前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

入射光的前向

(5)散射光信号,可反映：细胞相对大小及其表面积侧向角散射光（SSC,SideScatter）

入射光90角的散射光信号，可反映：细胞颗粒性程度

（胞内成分和构造和表面结构的复杂性）-23-（二）流式细胞仪可检测的细胞的参数：

-24-散射光信号前向角散射光－FSCFALSSensorLaser-24-散射光信号前向角散射光－FSCFALSSensor-25-散射光信号侧向角散射光－SSCFALSSensor90LSSensorLaser-25-散射光信号侧向角散射光－SSCFALSSensor-26-流式细胞的基本信息:“形态”-26-流式细胞的基本信息:“形态”-27--27--28-外周全血细胞（红细胞溶解后）

以散射光表示的双参数点图-28-外周全血细胞（红细胞溶解后）

-29-外周全血细胞（红细胞溶解后）

以散射光表示的双参数点图中性粒细胞单核细胞淋巴细胞-29-外周全血细胞（红细胞溶解后）

-30-（二）流式细胞检测细胞参数:

特征信息－荧光（Fluorescence）信号荧光素吸收激光（激发光波长）能量荧光素将吸收能量释放，转换为释放较入射光波长更长的光量子（发射光波长）荧光素与特异抗体结合（荧光抗体）荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生荧光信号越强 荧光素与细胞核酸结合，荧光强度反映核酸含量-30-（二）流式细胞检测细胞参数:

特征信息－荧光（F-31-（二）流式细胞检测细胞参数:

特征信息－荧光（Fluorescence）信号Forwardscatter(FSC)Sidescatter(SSC)FL1（第一荧光）-FITC(异硫氰酸荧光素）FL2（第二荧光）-PE（藻红蛋白）FL3（第三荧光）-PerCP,PeCy5等PL4（第四荧光）-APC（藻青蛋白）-31-（二）流式细胞检测细胞参数:

特征信息－荧光（F-32-荧光信号FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)-32-荧光信号FluorescenceFALSSenso-33--33--34-荧光信号双色直接染色-34-荧光信号双色直接染色-35-（三）流式细胞仪分析数据常见图形：

（二维）点陈图(DotPlot)适用于：双参数分析-35-（三）流式细胞仪分析数据常见图形：

（二维）点陈图-36-（三）流式细胞仪分析数据常见图形：

直方图(HistogramPlot)适用于：单参数分析仅需要观察某个荧光强度的变化-36-（三）流式细胞仪分析数据常见图形：

直方图(Hi-37-流式细胞术检测细胞的荧光标记方法单标：

一种单抗:FL1,FSC,SSC（三参数）双标：两种单抗：FL1,FL1,FSC,SSC（四参数）三标：三种单抗：FL1,FL2,FL3,FSC,SSC（五参数）四标－四种荧光标记抗体：四种单抗：FL1,FL2,FL3,FL4,FSC,SSC（六参数）-37-流式细胞术检测细胞的荧光标记方法单标：-38-淋巴细胞亚群分析细胞凋亡

肿瘤学移植免疫三流式细胞仪在临床检测和科研中的应用血小板其它-38-淋巴细胞亚群分析细胞凋亡肿瘤学移植免疫三-39-淋巴细胞亚群分析-39-淋巴细胞亚群分析-40-AdhesionMetabolic-40-AdhesionMetabolic-41--41--42--42--43-

T淋巴细胞淋巴细胞亚群检测：

Tcells,Tsubsets,NKcells,Bcells-43-T淋巴细胞淋巴细胞亚群检测：-44-淋巴细胞亚群T淋巴细胞(CD3+)名称功能CD3+CD4+辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti)辅助和诱导细胞免疫和体液免疫CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-辅助性T细胞(Th)诱导性T细胞(Ti)辅助细胞免疫和体液免疫诱导细胞免疫和体液免疫CD3+CD8+抑制性/杀伤性T细胞(Ts/Tc)抑制免疫反应/杀伤异源细胞CD3+CD8+CD28-CD3+CD4+CD29-抑制性T细胞(Ts)杀伤性T细胞(Tc)抑制细胞和体液免疫细胞毒性T细胞CD3+CD4+CD8+活化的T细胞在T细胞恶性增生时升高CD3+CD4-CD8-有调节功能的T细胞,其表达/T细胞受体(TCR/)CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO-幼稚的/静止的T淋巴细胞当免疫系统没有能力更新辅助性或抑制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此细胞亚群较低CD45RA-CD45RO+记忆性T淋巴细胞病菌感染时升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+活化的T细胞,感染时升高感染时升高-44-淋巴细胞亚群T淋巴细胞(CD3+)名称功能-45-淋巴细胞亚群活化T淋巴细胞名称功能CD3+HLA-DR+活化T细胞CD4+HLA-DR+活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞CD4+CD25+活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+CD25+CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞在病毒感染的患者中增加;其增加意味着HIV患者的预后较差B淋巴细胞(19+)CD19+CD23+活化的B细胞过敏患者中升高CD19+CD5+在自身免疫性疾病中升高CD19+CD5+CD23+慢性B细胞白血病及单克隆B淋巴细胞NK细胞CD3+CD(16+56)+自身免疫性疾病时降低,而病毒感染时升高CD3+CD57+CMV(巨细胞病毒)感染的强烈征兆-45-淋巴细胞亚群活化T淋巴细胞名称功-46-淋巴细胞亚群与疾病疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫性疾病系统性红斑狼疮类风湿性关节炎自身免疫性溶血性贫血重症肌无力免疫缺陷病爱滋病病毒感染传染性单核细胞增多症慢性活动性肝炎活动性肝硬化肿瘤消化道癌,肝癌,肺癌再生障碍性贫血粒细胞减少症-46-淋巴细胞亚群与疾病疾病CD3CD4CD8-47-淋巴细胞亚群检测意义疾病机理研究

疾病辅助诊断移植后免疫检测治疗方案的确定及疗效评价CD25高于正常值5-10%,表明即将或已发生排斥CD4/CD8比值下降提示并发凶险感染

<0.2时,必须停用免疫抑制剂CD2+HLA-DR+增加5-10%,且不伴有CD25的增加,提示巨细胞病毒感染慢性疲劳,感染后综合征,纤维肌痛,类风湿性关节炎,过敏等

疾病预防-47-淋巴细胞亚群检测意义疾病机理研究疾病辅助诊断移植后-48-淋巴细胞亚群检测意义

Control（n=20)ActiveSLE(n=17)StableSLE(n=13)CD370.4±5.8765.8±10.968.5±8.95CD435.0±5.7022.1±4.15**34.5±4.23CD827.9±5.7345.7±9.58**32.7±9.01CD4/CD81.27±0.140.43±0.12**1.05±0.26*NK17.8±5.484.37±3.31**7.59±5.01**鉴别活动期和非活动期SLE-48-淋巴细胞亚群检测意义Control（n=20)A-49-HIVANDAIDS-49-HIVANDAIDS-50-Th1/Th2细胞-50-Th1/Th2细胞-51-Th1/Th2细胞Th1型细胞因子介导细胞免疫反应引起迟发型过敏反应、巨噬细胞活化、局部炎症刺激来源：病毒、某些细菌Th2型介导体液免疫反应引起B细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、促进I型变态反应（过敏反应）刺激来源：多细胞寄生虫、过敏原-51-Th1/Th2细胞Th1型细胞因子介导细胞免疫反应-52-Th1/Th2细胞PMA+Ionomycin刺激4-6hr-52-Th1/Th2细胞PMA+Ionomycin刺激4-53-流式细胞仪检测胞内细胞因子

新鲜分离PBMC

加PMA＋Io刺激后6h测定胞内细胞因子IL-4和IFN-g

检测免疫细胞表型和结合检测胞内细胞因子：操作和分析方法；

-53-流式细胞仪检测胞内细胞因子新鲜分离PBMC检测免-54-四色标记胞内因子FCM检测-54-四色标记胞内因子FCM检测-55-Th1/Th2失衡相关疾病嗜酸性细胞增多和IgE升高相关疾病

Ommen’sSyndrome(Ommen’s综合征)HyperosinophilicSyndrome(高嗜曙红细胞综合征)Kimura’sDisease(Kimura’s疾病)Well’sSyndrome(Well’s综合征)传染病

病毒性疾病

人类免疫缺陷性病毒感染和爱滋病(AIDS)

麻疹

呼吸道合胞体病毒感染

慢性活动性乙型肝炎病毒感染

分枝杆菌和其它细菌感染

麻疯病/肺结核

鸟结核分枝杆菌复合感染滑膜炎反应性关节炎

淋病和梅毒

-55-Th1/Th2失衡相关疾病嗜酸性细胞增多和IgE升高-56-Th1/Th2失衡相关疾病寄生虫病

原寄生虫感染：皮肤和内脏利什曼病

蠕虫病：丝虫病和血吸虫病真菌性疾病

过敏性支气管肺霉菌病

念珠菌病

隐球菌病

类球孢子菌病球孢子菌病

组织胞浆菌病恶性肿瘤

皮肤基底细胞和鳞细胞癌

SezarySyndrome(Sezary综合征)

淋巴瘤

EBV相关的B细胞和非何杰金氏淋巴瘤

何杰金氏淋巴瘤

大细胞退行性(CD30+)淋巴瘤

多发性骨髓瘤和Castleman’s综合征

卡氏肉瘤-56-Th1/Th2失衡相关疾病寄生虫病www.gotof-57-Th1/Th2失衡相关疾病变应性疾病

皮肤性哮喘

变应性哮喘

春季结膜炎炎性和自身免疫性疾病

巨细胞(暂时性的)动脉炎

系统性红斑狼疮

类风湿性关节炎

自身免疫性甲状腺疾病

类肉瘤病

银屑病(牛皮癣)IgA肾病

多发性硬化-57-Th1/Th2失衡相关疾病变应性疾病www.goto-58-Th1/Th2细胞检测意义疾病治疗发病机制研究使用Th1和Th2相关的细胞因子

IFN-治疗麻疯病

用抗Th1和Th2相关细胞因子或其受体的抗体

抗IL-4抗体治疗真菌和寄生虫感染

使用调节Th2/Th2细胞因子平衡的药物:

萨力多胺(Thaliodomide)治疗巨细胞动脉炎疾病治疗监测-58-Th1/Th2细胞检测意义疾病治疗发病机制研究使用T-59-

肿瘤学-59-肿瘤学-60-肿瘤发生发展-60-肿瘤发生发展-61-02004006008001000PI荧光强度(DNA含量)DNA含量分析2N4NCountsG0/G1G2/MS异倍体-61-02004006008001000PI荧光-62-DNA含量分析70%人类癌症中存在着异倍体或细胞周期的改变1.RossJS.DNAPloidyandCellCycleAnalysisinPathology.NewYork:Igaku-Shoin;1996:47-60DNA倍体和S期比例--指导治疗[2]卵巢癌，乳腺癌，结肠癌，子宫内膜癌，原发部位不明的癌症--早期(I/II期)DNA倍体和DNA指数--预后长期和无病生存期[2]卵巢癌--晚期2.TheRecommendMedicareNationalCoveragePolicyforFlowCytometry.HCFAWebsite,1999-62-DNA含量分析70%人类癌症中存在着异倍体或细胞周期-63-P53/Bcl-2-63-P53/B-64-P53乳腺癌

与病理学分级有关,并与乳腺癌的淋巴结转移显著相关大肠肿瘤

早期发现大肠癌胃癌

与预后相关肝细胞癌

与组织分级,肿瘤预后,转移及肿瘤大小密切相关-64-P53乳腺癌与病理学分级有关,并与乳腺癌-65-Bcl-2Bcl-2在正常组织中的表达

造血系统细胞—淋巴,单核细胞等受激素或生长因子调节的腺上皮—前列腺上皮,子宫内膜等干细胞或增值细胞—皮肤的基底细胞,肠上皮寿命长的分裂细胞—神经元胚胎组织Bcl-2在肿瘤组织中的表达

肾脏肿瘤—肾癌,肾盂乳头瘤,Wilms瘤,肾嗜酸细胞瘤前列腺癌

B细胞性淋巴瘤乳腺癌(43%)

甲状腺癌-65-Bcl-2Bcl-2在正常组织中的表达造血-66-nm23nm23与多种肿瘤的转移及预后相关

肝细胞癌甲状腺肿瘤乳腺癌结肠癌肉瘤-66-nm23nm23与多种肿瘤的转移及预后相关-67-CD44(CD44s/CD44v)-67-CD44(CD44s/CD44v)www.gotof-68-肿瘤多药耐药性(MDR)检测P-gp在肿瘤组织中的表达

乳腺癌,膀胱癌,胃癌,食管癌,卵巢癌,前列腺癌等化疗前高表达化疗后高表达

肾细胞癌,结肠癌,肝癌,肾上腺皮质癌,胰腺癌等化疗前低表达

非何杰金氏淋巴瘤,成神经细胞瘤,急性髓白血病等化疗不敏感化疗敏感化疗不敏感-68-肿瘤多药耐药性(MDR)检测P-gp在肿瘤组织中的表-69-乳腺癌石蜡切片脱腊ER(雌激素受体)ER抗体染色酶解流式检测固定(多聚甲醛)破膜(70%甲醇)细胞-69-乳腺癌石蜡切片脱腊ER(雌激素受体)ER抗体染色酶解-70-Cyclin(细胞周期蛋白)-70-Cyclin(细胞周期蛋白)www.gotofcm.-71-细胞凋亡-71-细胞凋亡-72-细胞凋亡分析

-72-细胞凋亡分析-73-DNA断裂-73-DNA断裂-74-乳腺癌Fas/FasL与疾病慢性病毒性肝炎恶性肿瘤细胞-黑色素瘤、结肠癌、肺癌、肝癌等脑缺血后细胞凋亡自身免疫性疾病—系统性红斑狼疮Fas/FasL(CD95/CD95L)-74-乳腺癌Fas/FasL与疾病慢性病毒性肝炎恶性肿瘤细-75-乳腺癌Caspases早期细胞凋亡AnnexinV/PI-75-乳腺癌Caspases早期细胞凋亡AnnexinV-76-移植免疫-76-移植免疫-77-CD25高于正常值5-10%,表明即将或已发生排斥CD4/CD8比值下降提示并发凶险感染

<0.2时,必须停用免疫抑制剂CD2+HLA-DR+增加5-10%,且不伴有CD25的增加提示巨细胞病毒感染移植后免疫监测-77-CD25高于正常值5-10%,表明即将或已发生排斥-78-血小板-78-血小板-79-血小板活化静止血小板活化血小板-79-血小板活化静止血小板活化血小板www.gotofcm-80-血小板活化-80-血小板活化-81-网织血小板ITP(特发性血小板减少症)化疗鉴别诊断骨髓移植-81-网织血小板ITP(特发性血小板减少症)化疗鉴别诊断骨-82-血小板计数新标准(间接双平台法)R=红细胞数/血小板数(流式细胞术)血小板数=红细胞数(血球仪)/R(国际血液学标准化委员会(ICSH)/国际实验血液学协会(ISLH)2001)

灵敏度高(1-400x109/L)，重复性好，室内/室外变异系数均很小尤其应用于血小板预输注病人的检测(阈值:20x109/L)-82-血小板计数新标准(间接双平台法)R=红细胞数/血-83-其它-83-其它-84-HLA-B27-84-HLA-B27-85-正常人患者HLA-B27-85-正常人患者HLA-B27www.gotofcm.c-86-细胞介导的细胞毒作用活靶细胞死靶细胞替代51Cr释放实验-86-细胞介导的细胞毒作用活-87-HLA-B27检测CalibrationbeadsHLA-B27calibrationbeadsDecisionmarkerHLA—B27FITC（MFI)

-87-HLA-B27检测Calibrationbeads-88-流式临床应用发展白血病/淋巴瘤免疫分型HIV感染的CD4绝对计数CD34绝对计数/异体移植的免疫重建抗原特异性T细胞检测树突状细胞（DC）循环微转移肿瘤细胞IIIIIIIVMartiGE,MaryaliceSS,etal.IntroductiontoFlowcytometry.SeminarsinHematology,2001;38(2):93-99-88-流式临床应用发展白血病-89-

流式微球分析

CytometricBeadArray（CBA）-89-

流式微球分析CytometricBeadAr-90-CBA与ELISA相比优点

“多元”和“同步”检测

样本量少

灵敏度相似稳定性好

-90-CBA与ELISA相比优点

91

以上有不当之处，请大家给与批评指正，谢谢大家！91流式细胞仪在临床检测和临床科研中的应用李柏青蚌埠医学院免疫学教研室流式细胞仪在临床检测和临床科研中的应用李柏青-93-流式细胞仪和流式细胞术－概述流式细胞仪的工作原理和测量参数流式细胞仪在临床检测和科研中的应用免疫学检测和科研应用血液病检测和科研应用肿瘤学检测和科研应用流式细胞仪的基本工作原理以及在基础和临床科研中的应用-2-流式细胞仪和流式细胞术－概述流式细胞仪的基本工作原理以-94-一、流式细胞仪和流式细胞术的基本概念流式细胞仪(FlowCytometer，FCM):是集合光电子物理，光电测量技术，液流技术，计算机技术等现代高科技技术为一体的细胞测量和分析仪器。-3-一、流式细胞仪和流式细胞术的基本概念流式细胞仪(Flo-95-一、流式细胞仪和流式细胞术的基本概念流式细胞术(FlowCytometry，FCM):是应用流式细胞仪，对处于快速流动液体中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速测量和定量分析，以及分选的技术。-4-一、流式细胞仪和流式细胞术的基本概念流式细胞术(Flo-96-一、流式细胞仪和流式细胞术－特点多参数测量和分析（散射光和荧光）；快速测量和分析每秒可达1000-10000个细胞分选纯度可达99%以上。获取的数据分析结果更具有统计学意义；通常测量的对象如各种细胞细胞必须处在单个细胞悬液中。此外，也可测量微生物等生物颗粒，或者工合成微球非生物颗粒，-5-一、流式细胞仪和流式细胞术－特点多参数测量和分析（散射-97-台式机——FACSCalibur双激光

488nm 635nm四荧光参数分选、浓缩系统-6-台式机——FACSCalibur双激光987-99-大型机——FACSVantageSE科研型八荧光参数高速分选多路分选-8-大型机——FACSVantageSE-100-

流式细胞仪与荧光显微镜比较

流式细胞仪荧光显微镜

流动的细胞静止的细胞样本数量大数量少高速分选样本难以再利用细胞群体特征量分布可揭示细胞内部结构信息-9-流式细胞仪与荧光显微镜比较流式细胞仪-101-二、流式细胞仪的工作原理和测量参数光路系统：

激光光源，光路系统（透镜、滤光片）电子系统：光电倍增管（PMT），补偿电路液流系统：

鞘液系统，样品流动系统数据系统：计算机，数据测量和分析软件。细胞分选系统（一）流式细胞仪的结构

-10-二、流式细胞仪的工作原理和测量参数光路系统：（一）-102-流式细胞仪－光路系统激光(Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照激光波长:488nm,635nm光收集系统是由若干组透镜,滤波片,小孔组成，将产生的光信号引导至检测器-11-流式细胞仪－光路系统激光(Laser)是一种相干光-103-光路系统-12-光路系统-104-InjectorTip-13-Injector-105-InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid-14-InjectorFluorescencesigna-106-流式细胞仪－光学系统激发光源与荧光标记物-15-流式细胞仪－光学系统激发光源与荧光标记物-107-光学检测信号-16-光学检测信号-108-流式细胞仪的光学系统FACSCalibur-17-流式细胞仪的光学系统FACSCalibur-109-流式细胞仪－液流系统-18-流式细胞仪－液流系统-110-液流系统：鞘液系统＋样品流动系统-19-液流系统：鞘液系统＋样品流动系统-111-流式细胞仪的电子系统

信号检测和分析当细胞携带荧光素,通过激光照射区,受到激发产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号荧光信号由光电接收器接收，转变为电脉冲信号，电脉冲信号经A/D转换成数字信号数字信号传送到计算机，进行储存、作图和统计分析-20-流式细胞仪的电子系统信号检测和分析-112-数据系统-21-数据系统-113-（二）流式细胞仪可检测的细胞参数细胞结构细胞大小细胞颗粒性程度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量细胞功能细胞表面蛋白抗原细胞胞浆内蛋白性抗原细胞内细胞因子细胞增殖细胞内钙离子浓度二、流式细胞仪的工作原理和测量参数-22-（二）流式细胞仪可检测的细胞参数细胞结构细胞功能二-114-（二）流式细胞仪可检测的细胞的参数：

散射光信号前向角散射光（FSC,ForwardScatter）

入射光的前向

(5)散射光信号,可反映：细胞相对大小及其表面积侧向角散射光（SSC,SideScatter）

入射光90角的散射光信号，可反映：细胞颗粒性程度

（胞内成分和构造和表面结构的复杂性）-23-（二）流式细胞仪可检测的细胞的参数：

-115-散射光信号前向角散射光－FSCFALSSensorLaser-24-散射光信号前向角散射光－FSCFALSSensor-116-散射光信号侧向角散射光－SSCFALSSensor90LSSensorLaser-25-散射光信号侧向角散射光－SSCFALSSensor-117-流式细胞的基本信息:“形态”-26-流式细胞的基本信息:“形态”-118--27--119-外周全血细胞（红细胞溶解后）

以散射光表示的双参数点图-28-外周全血细胞（红细胞溶解后）

-120-外周全血细胞（红细胞溶解后）

以散射光表示的双参数点图中性粒细胞单核细胞淋巴细胞-29-外周全血细胞（红细胞溶解后）

-121-（二）流式细胞检测细胞参数:

特征信息－荧光（Fluorescence）信号荧光素吸收激光（激发光波长）能量荧光素将吸收能量释放，转换为释放较入射光波长更长的光量子（发射光波长）荧光素与特异抗体结合（荧光抗体）荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生荧光信号越强 荧光素与细胞核酸结合，荧光强度反映核酸含量-30-（二）流式细胞检测细胞参数:

特征信息－荧光（F-122-（二）流式细胞检测细胞参数:

特征信息－荧光（Fluorescence）信号Forwardscatter(FSC)Sidescatter(SSC)FL1（第一荧光）-FITC(异硫氰酸荧光素）FL2（第二荧光）-PE（藻红蛋白）FL3（第三荧光）-PerCP,PeCy5等PL4（第四荧光）-APC（藻青蛋白）-31-（二）流式细胞检测细胞参数:

特征信息－荧光（F-123-荧光信号FluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)-32-荧光信号FluorescenceFALSSenso-124--33--125-荧光信号双色直接染色-34-荧光信号双色直接染色-126-（三）流式细胞仪分析数据常见图形：

（二维）点陈图(DotPlot)适用于：双参数分析-35-（三）流式细胞仪分析数据常见图形：

（二维）点陈图-127-（三）流式细胞仪分析数据常见图形：

直方图(HistogramPlot)适用于：单参数分析仅需要观察某个荧光强度的变化-36-（三）流式细胞仪分析数据常见图形：

直方图(Hi-128-流式细胞术检测细胞的荧光标记方法单标：

一种单抗:FL1,FSC,SSC（三参数）双标：两种单抗：FL1,FL1,FSC,SSC（四参数）三标：三种单抗：FL1,FL2,FL3,FSC,SSC（五参数）四标－四种荧光标记抗体：四种单抗：FL1,FL2,FL3,FL4,FSC,SSC（六参数）-37-流式细胞术检测细胞的荧光标记方法单标：-129-淋巴细胞亚群分析细胞凋亡

肿瘤学移植免疫三流式细胞仪在临床检测和科研中的应用血小板其它-38-淋巴细胞亚群分析细胞凋亡肿瘤学移植免疫三-130-淋巴细胞亚群分析-39-淋巴细胞亚群分析-131-AdhesionMetabolic-40-AdhesionMetabolic-132--41--133--42--134-

T淋巴细胞淋巴细胞亚群检测：

Tcells,Tsubsets,NKcells,Bcells-43-T淋巴细胞淋巴细胞亚群检测：-135-淋巴细胞亚群T淋巴细胞(CD3+)名称功能CD3+CD4+辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti)辅助和诱导细胞免疫和体液免疫CD3+CD4+CD29+CD3+CD4+CD29-辅助性T细胞(Th)诱导性T细胞(Ti)辅助细胞免疫和体液免疫诱导细胞免疫和体液免疫CD3+CD8+抑制性/杀伤性T细胞(Ts/Tc)抑制免疫反应/杀伤异源细胞CD3+CD8+CD28-CD3+CD4+CD29-抑制性T细胞(Ts)杀伤性T细胞(Tc)抑制细胞和体液免疫细胞毒性T细胞CD3+CD4+CD8+活化的T细胞在T细胞恶性增生时升高CD3+CD4-CD8-有调节功能的T细胞,其表达/T细胞受体(TCR/)CD4+/CD8+比值CD45RA+CD45RO-幼稚的/静止的T淋巴细胞当免疫系统没有能力更新辅助性或抑制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此细胞亚群较低CD45RA-CD45RO+记忆性T淋巴细胞病菌感染时升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低CD45RA+CD45RO+活化的T细胞,感染时升高感染时升高-44-淋巴细胞亚群T淋巴细胞(CD3+)名称功能-136-淋巴细胞亚群活化T淋巴细胞名称功能CD3+HLA-DR+活化T细胞CD4+HLA-DR+活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞CD4+CD25+活化的辅助性/诱导性T细胞CD8+CD25+CD8+CD38+HLA-DR+活化的抑制性/杀伤性T细胞在病毒感染的患者中增加;其增加意味着HIV患者的预后较差B淋巴细胞(19+)CD19+CD23+活化的B细胞过敏患者中升高CD19+CD5+在自身免疫性疾病中升高CD19+CD5+CD23+慢性B细胞白血病及单克隆B淋巴细胞NK细胞CD3+CD(16+56)+自身免疫性疾病时降低,而病毒感染时升高CD3+CD57+CMV(巨细胞病毒)感染的强烈征兆-45-淋巴细胞亚群活化T淋巴细胞名称功-137-淋巴细胞亚群与疾病疾病CD3CD4CD8CD4/CD8NK自身免疫性疾病系统性红斑狼疮类风湿性关节炎自身免疫性溶血性贫血重症肌无力免疫缺陷病爱滋病病毒感染传染性单核细胞增多症慢性活动性肝炎活动性肝硬化肿瘤消化道癌,肝癌,肺癌再生障碍性贫血粒细胞减少症-46-淋巴细胞亚群与疾病疾病CD3CD4CD8-138-淋巴细胞亚群检测意义疾病机理研究

疾病辅助诊断移植后免疫检测治疗方案的确定及疗效评价CD25高于正常值5-10%,表明即将或已发生排斥CD4/CD8比值下降提示并发凶险感染

<0.2时,必须停用免疫抑制剂CD2+HLA-DR+增加5-10%,且不伴有CD25的增加,提示巨细胞病毒感染慢性疲劳,感染后综合征,纤维肌痛,类风湿性关节炎,过敏等

疾病预防-47-淋巴细胞亚群检测意义疾病机理研究疾病辅助诊断移植后-139-淋巴细胞亚群检测意义

Control（n=20)ActiveSLE(n=17)StableSLE(n=13)CD370.4±5.8765.8±10.968.5±8.95CD435.0±5.7022.1±4.15**34.5±4.23CD827.9±5.7345.7±9.58**32.7±9.01CD4/CD81.27±0.140.43±0.12**1.05±0.26*NK17.8±5.484.37±3.31**7.59±5.01**鉴别活动期和非活动期SLE-48-淋巴细胞亚群检测意义Control（n=20)A-140-HIVANDAIDS-49-HIVANDAIDS-141-Th1/Th2细胞-50-Th1/Th2细胞-142-Th1/Th2细胞Th1型细胞因子介导细胞免疫反应引起迟发型过敏反应、巨噬细胞活化、局部炎症刺激来源：病毒、某些细菌Th2型介导体液免疫反应引起B细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、促进I型变态反应（过敏反应）刺激来源：多细胞寄生虫、过敏原-51-Th1/Th2细胞Th1型细胞因子介导细胞免疫反应-143-Th1/Th2细胞PMA+Ionomycin刺激4-6hr-52-Th1/Th2细胞PMA+Ionomycin刺激4-144-流式细胞仪检测胞内细胞因子

新鲜分离PBMC

加PMA＋Io刺激后6h测定胞内细胞因子IL-4和IFN-g

检测免疫细胞表型和结合检测胞内细胞因子：操作和分析方法；

-53-流式细胞仪检测胞内细胞因子新鲜分离PBMC检测免-145-四色标记胞内因子FCM检测-54-四色标记胞内因子FCM检测-146-Th1/Th2失衡相关疾病嗜酸性细胞增多和IgE升高相关疾病

Ommen’sSyndrome(Ommen’s综合征)HyperosinophilicSyndrome(高嗜曙红细胞综合征)Kimura’sDisease(Kimura’s疾病)Well’sSyndrome(Well’s综合征)传染病

病毒性疾病

人类免疫缺陷性病毒感染和爱滋病(AIDS)

麻疹

呼吸道合胞体病毒感染

慢性活动性乙型肝炎病毒感染

分枝杆菌和其它细菌感染

麻疯病/肺结核

鸟结核分枝杆菌复合感染滑膜炎反应性关节炎

淋病和梅毒

-55-Th1/Th2失衡相关疾病嗜酸性细胞增多和IgE升高-147-Th1/Th2失衡相关疾病寄生虫病

原寄生虫感染：皮肤和内脏利什曼病

蠕虫病：丝虫病和血吸虫病真菌性疾病

过敏性支气管肺霉菌病

念珠菌病

隐球菌病

类球孢子菌病球孢子菌病

组织胞浆菌病恶性肿瘤

皮肤基底细胞和鳞细胞癌

SezarySyndrome(Sezary综合征)

淋巴瘤

EBV相关的B细胞和非何杰金氏淋巴瘤

何杰金氏淋巴瘤

大细胞退行性(CD30+)淋巴瘤

多发性骨髓瘤和Castleman’s综合征

卡氏肉瘤-56-Th1/Th2失衡相关疾病寄生虫病www.gotof-148-Th1/Th2失衡相关疾病变应性疾病

皮肤性哮喘

变应性哮喘

春季结膜炎炎性和自身免疫性疾病

巨细胞(暂时性的)动脉炎

系统性红斑狼疮

类风湿性关节炎

自身免疫性甲状腺疾病

类肉瘤病

银屑病(牛皮癣)IgA肾病

多发性硬化-57-Th1/Th2失衡相关疾病变应性疾病www.goto-149-Th1/Th2细胞检测意义疾病治疗发病机制研究使用Th1和Th2相关的细胞因子

IFN-治疗麻疯病

用抗Th1和Th2相关细胞因子或其受体的抗体

抗IL-4抗体治疗真菌和寄生虫感染

使用调节Th2/Th2细胞因子平衡的药物:

萨力多胺(Thaliodomide)治疗巨细胞动脉炎疾病治疗监测-58-Th1/Th2细胞检测意义疾病治疗发病机制研究使用T-150-

肿瘤学-59-肿瘤学-151-肿瘤发生发展-60-肿瘤发生发展-152-02004006008001000PI荧光强度(DNA含量)DNA含量分析2N4NCountsG0/G1G2/MS异倍体-61-02004006008001000PI荧光-153-DNA含量分析70%人类癌症中存在着异倍体或细胞周期的改变1.RossJS.DNAPloidyandCellCycleAnalysisinPathology.NewYork:Igaku-Shoin;1996:47-60DNA倍体和S期比例--指导治疗[2]卵巢癌，乳腺癌，结肠癌，子宫内膜癌，原发部位不明的癌症--早期(I/II期)DNA倍体和DNA指数--预后长期和无病生存期[2]卵巢癌--晚期2.TheRecommendMedicareNationalCoveragePolicyforFlowCytometry.HCFAWebsite,1999-62-DNA含量分析70%人类癌症中存在着异倍体或细胞周期-154-P53/Bcl-2-63-P53/B-155-P53乳腺癌

与病理学分级有关,并与乳腺癌的淋巴结转移显著相关大肠肿瘤

早期发现大肠癌胃癌

与预后相关肝细胞癌

与组织分级,肿瘤预后,转移及肿瘤大小密切相关-64-P53乳腺癌与病理学分级有关,并与乳腺癌-156-Bcl-2Bcl-2在正常组织中的表达

造血系统细胞—淋巴,单核细胞等受激素或生长因子调节的腺上皮—前列腺上皮,子宫内膜等干细胞或增值细胞—皮肤的基底细胞,肠上皮