DNA克隆与组装技术课件

DNA克隆与组装技术1DNA克隆与组装技术1提纲非典型酶切连接技术二PCR技术三同源重组技术四单链退火技术五典型酶切连接技术一2022/12/162提纲非典型酶切连接技术二PCR技术三同源重组技术四单链退火技典型酶切连接技术一连接处存在疤痕多片段连接效率低依赖于序列缺点方法成熟简单方便优点2022/12/163典型酶切连接技术一连接处存在疤痕缺点方法成熟优点2022/1非典型酶切连接技术二BioBrickTM技术GoldenGatecloning技术2022/12/164非典型酶切连接技术二BioBrickTM技术2022/12/BioBrickTM技术Xba1Spe1连接处存在疤痕缺点2022/12/165BioBrickTM技术Xba1Spe1连接处存在疤痕缺点2GoldenGatecloning技术对序列有一定依赖性缺点2022/12/166GoldenGatecloning技术对序列有一定依赖自从20世纪90年代PCR(Polymerasechainreaction)技术被用于基因合成以来，一系列依赖于PCR的DNA克隆和组装技术也逐渐发展起来了。例如重叠延伸PCR(OverlapextensionPCR，OE-PCR)和环形聚合酶延伸克隆(Circularpolymeraseextensioncloning，CPEC)技术，这些技术都可以解决上述典型和非典型酶切连接对于序列依赖的问题，达到无痕、非序列依赖性的效果。PCR技术三2022/12/167自从20世纪90年代PCR(PolymeraseOE-PCR技术依赖于聚合酶保真度组装长度有限缺点无痕连接不依赖序列优点2022/12/168OE-PCR技术依赖于聚合酶保真度缺点无痕连接优点2022/CPEC技术2022/12/169CPEC技术2022/12/129同源重组是指含有重叠序列的DNA分子之间或分子内部的重新组合，其已经广泛应用于分子生物学研究中。当操作较大的DNA分子时，DNA体外组装就会变得较为困难，这时就需要体内大片段DNA组装方法，例如目前最常用的酿酒酵母体内的转化耦联重组技术(Transformation-associatedrecombination，TAR)和大肠杆菌体内的Red/Rec同源重组技术。同源重组技术四2022/12/1610同源重组是指含有重叠序列的DNA分子之间或分子内部的重新TAR技术(transformationassistedrecombination)2022/12/1611TAR技术(transformationassistedRed/Rec技术是一种基于λ噬菌体Red操纵子和Rec噬菌体RecE/RecT同源重组系统的DNA克隆技术。Red同源重组系统主要由Exo、Beta、Gam蛋白组成，分别由λ噬菌体exo、bet、gam基因编码。其中，Exo具有5′→3′双链核酸外切酶活性，能够形成末端DNA单链；Beta是单链结合蛋白，能够促进DNA分子间退火；Gam能够阻止单链DNA片段的降解，提高单链DNA分子的稳定性，从而间接提高同源重组的效率。Rec同源重组系统中除上述Gam蛋白外，Rec噬菌体编码的RecE和RecT蛋白也能高效促进同源重组。Red/Rec技术2022/12/1612Red/Rec技术是一种基于λ噬菌体Red操纵子和2022/12/16132022/12/1213单链退火拼接技术，即所谓的Chew-back组装，是指创造DNA分子之间的重叠区，通过连接或聚合的思想实现分子间的拼接。这种技术既跳出了限制酶的使用，利用DNA外切酶产生了较长的黏性末端；又应用等级化组装模式很好地规避了逐级添加的耗时耗力与一次性组装可能不正确的拼接，使得无论在组装的DNA片段数目还是尺度上变得更为高效。例如目前最常用的Gibsonassembly和SLIC技术。单链退火技术五2022/12/1614单链退火拼接技术，即所谓的Chew-back组装，是指创J.CraigVenter研究所的DanielG.Gibson描述了一种强大的基于外切核酸酶的方法，可以无缝地以正确的顺序组装DNA，即GibsonAssembly。该反应使用三种酶活性在等温条件下进行：5'外切核酸酶产生长突出端，聚合酶填充退火的单链区域的间隙，DNA连接酶密封退火和填充间隙的缺口。该方法已被广泛采用，并且是全世界合成生物学项目的主要工具。GibsonAssembly技术组装片段自身不能含有重复片段缺点多条长片段一次组装高效易操作优点2022/12/1615J.CraigVenter研究所的DanielG.G2022/12/16162022/12/1216SLIC是一种不依赖于序列和连接反应的克隆方法，主要利用T4DNA聚合酶在无dNTPs存在的情况下发挥3′→5′核酸外切酶活性，将DNA片段消化产生含有末端重叠序列的5′黏性末端，然后DNA片段之间或DNA片段与载体之间依靠重叠序列退火(RecA可提高重组效率)，形成环状中间体，最后直接转化大肠杆菌感受态细胞，利用大肠杆菌本身的修复系统修复成完整的环状重组质粒(图8)。SLIC技术2022/12/1617SLIC是一种不依赖于序列和连接反应的克隆方法，主要利用比较两种方法2022/12/1618比较两种方法2022/12/1218技术优点缺点传统内切酶连接方法成熟，简单方便连接处存在疤痕，多片段连接效率低，依赖于序列Biobrick模块化便捷存在疤痕，较依赖于序列GoldenGatecloning高效，无痕，多片段一次连接较依赖于序列OE-PCR高效，无痕依赖于保真率，组装片段大小受限OPEC同上同上TAR最高效，组装片段最长的技术片段过大，或存在重复片段时，易断裂缺失，GC含量不能过高Red/Rec高效，可组装中等尺度大片段同上GibsonAssembly高效，无痕，大片段一次组装存在重复片段时难以组装SLIC高效，无痕片段大小不能太大总结2022/12/1619技术优点缺点传统内切酶连接方法成熟，简单方便连接处存在疤痕，主要参考文献史晏榕等，DNA克隆和组装技术研究进展，《微生物学通报》，2015,Vol.42,No.11,2229-2237;赵鹃等，合成生物学中的DNA组装技术，《生命科学》

2013,Vol.25,No.11,983-992;李雷等，DNA组装新方法的研究进展，《生物工程学报》2013.Vol.29,No.8,1113-1122;DanielG.GibsonetalOne-stepassemblyinyeastof25overlappingDNAfragmentstoformacompletesyntheticMycoplasmagenitaliumgenome,PNAS(2008)vol.105no.5120404–20409;CarolaEngleretal,GoldenGateShuffling:AOne-PotDNAShufflingMethodBasedonTypeIIsRestrictionEnzymes,Plosone(May2009)Volume4Issue5;JiayuanQuanetal,CircularPolymeraseExtensionCloningofComplexGeneLibrariesandPathways,PlosoneJuly2009Volume4Issue7;2022/12/1620主要参考文献史晏榕等，DNA克隆和组装技术研究进展，《欢迎提出宝贵意见2022/12/1621欢迎提出宝贵意见2022/12/1221DNA克隆与组装技术22DNA克隆与组装技术1提纲非典型酶切连接技术二PCR技术三同源重组技术四单链退火技术五典型酶切连接技术一2022/12/1623提纲非典型酶切连接技术二PCR技术三同源重组技术四单链退火技典型酶切连接技术一连接处存在疤痕多片段连接效率低依赖于序列缺点方法成熟简单方便优点2022/12/1624典型酶切连接技术一连接处存在疤痕缺点方法成熟优点2022/1非典型酶切连接技术二BioBrickTM技术GoldenGatecloning技术2022/12/1625非典型酶切连接技术二BioBrickTM技术2022/12/BioBrickTM技术Xba1Spe1连接处存在疤痕缺点2022/12/1626BioBrickTM技术Xba1Spe1连接处存在疤痕缺点2GoldenGatecloning技术对序列有一定依赖性缺点2022/12/1627GoldenGatecloning技术对序列有一定依赖自从20世纪90年代PCR(Polymerasechainreaction)技术被用于基因合成以来，一系列依赖于PCR的DNA克隆和组装技术也逐渐发展起来了。例如重叠延伸PCR(OverlapextensionPCR，OE-PCR)和环形聚合酶延伸克隆(Circularpolymeraseextensioncloning，CPEC)技术，这些技术都可以解决上述典型和非典型酶切连接对于序列依赖的问题，达到无痕、非序列依赖性的效果。PCR技术三2022/12/1628自从20世纪90年代PCR(PolymeraseOE-PCR技术依赖于聚合酶保真度组装长度有限缺点无痕连接不依赖序列优点2022/12/1629OE-PCR技术依赖于聚合酶保真度缺点无痕连接优点2022/CPEC技术2022/12/1630CPEC技术2022/12/129同源重组是指含有重叠序列的DNA分子之间或分子内部的重新组合，其已经广泛应用于分子生物学研究中。当操作较大的DNA分子时，DNA体外组装就会变得较为困难，这时就需要体内大片段DNA组装方法，例如目前最常用的酿酒酵母体内的转化耦联重组技术(Transformation-associatedrecombination，TAR)和大肠杆菌体内的Red/Rec同源重组技术。同源重组技术四2022/12/1631同源重组是指含有重叠序列的DNA分子之间或分子内部的重新TAR技术(transformationassistedrecombination)2022/12/1632TAR技术(transformationassistedRed/Rec技术是一种基于λ噬菌体Red操纵子和Rec噬菌体RecE/RecT同源重组系统的DNA克隆技术。Red同源重组系统主要由Exo、Beta、Gam蛋白组成，分别由λ噬菌体exo、bet、gam基因编码。其中，Exo具有5′→3′双链核酸外切酶活性，能够形成末端DNA单链；Beta是单链结合蛋白，能够促进DNA分子间退火；Gam能够阻止单链DNA片段的降解，提高单链DNA分子的稳定性，从而间接提高同源重组的效率。Rec同源重组系统中除上述Gam蛋白外，Rec噬菌体编码的RecE和RecT蛋白也能高效促进同源重组。Red/Rec技术2022/12/1633Red/Rec技术是一种基于λ噬菌体Red操纵子和2022/12/16342022/12/1213单链退火拼接技术，即所谓的Chew-back组装，是指创造DNA分子之间的重叠区，通过连接或聚合的思想实现分子间的拼接。这种技术既跳出了限制酶的使用，利用DNA外切酶产生了较长的黏性末端；又应用等级化组装模式很好地规避了逐级添加的耗时耗力与一次性组装可能不正确的拼接，使得无论在组装的DNA片段数目还是尺度上变得更为高效。例如目前最常用的Gibsonassembly和SLIC技术。单链退火技术五2022/12/1635单链退火拼接技术，即所谓的Chew-back组装，是指创J.CraigVenter研究所的DanielG.Gibson描述了一种强大的基于外切核酸酶的方法，可以无缝地以正确的顺序组装DNA，即GibsonAssembly。该反应使用三种酶活性在等温条件下进行：5'外切核酸酶产生长突出端，聚合酶填充退火的单链区域的间隙，DNA连接酶密封退火和填充间隙的缺口。该方法已被广泛采用，并且是全世界合成生物学项目的主要工具。GibsonAssembly技术组装片段自身不能含有重复片段缺点多条长片段一次组装高效易操作优点2022/12/1636J.CraigVenter研究所的DanielG.G2022/12/16372022/12/1216SLIC是一种不依赖于序列和连接反应的克隆方法，主要利用T4DNA聚合酶在无dNTPs存在的情况下发挥3′→5′核酸外切酶活性，将DNA片段消化产生含有末端重叠序列的5′黏性末端，然后DNA片段之间或DNA片段与载体之间依靠重叠序列退火(RecA可提高重组效率)，形成环状中间体，最后直接转化大肠杆菌感受态细胞，利用大肠杆菌本身的修复系统修复成完整的环状重组质粒(图8)。SLIC技术2022/12/1638SLIC是一种不依赖于序列和连接反应的克隆方法，主要利用比较两种方法2022/12/1639比较两种方法2022/12/1218技术优点缺点传统内切酶连接方法成熟，简单方便连接处存在疤痕，多片段连接效率低，依赖于序列Biobrick模块化便捷存在疤痕，较依赖于序列GoldenGatecloning高效，无痕，多片段一次连接较依赖于序列OE-PCR高效，无痕依赖于保真率，组装片段大小受限OPEC同上同上TAR最高效，组装片段最长的技术片段过大，或存在重复片段时，易断裂缺失，GC含量不能过高Red/Rec高效，可组装中等尺度大片段同上GibsonAssembly高效，无痕，大片段一次组装存在重复片段时难以组装SLIC高效，无痕片段大小不能太大总结2022/12/1640技术优点缺点传统内切酶连接方法成熟，简单方便连接处存在疤痕，主要参考文献史晏榕等，DNA克隆和组装技术研究进展，《