第十二章遗传工程幻灯片讲义课件

第12章遗传工程

第12章遗传工程1本章教学时数：2学时。本章重点：基因工程的基本流程。本章难点：分子标记和基因图谱；研究基因功能的方法本章教学时数：2学时。2§1

遗传工程概述

遗传工程：细胞工程酶工程发酵工程基因工程§1遗传工程概述遗传工程：3遗传工程的概念遗传工程（geneticengineering），也称生物工程（biologicalengineering）。是指利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或更适合人类需求的产品的遗传学手段。遗传工程的概念遗传工程（geneticengineer4广义遗传工程和狭义遗传工程：广义：包括细胞工程、基因工程、酶工程和发酵工程等。狭义：基因工程。广义遗传工程和狭义遗传工程：广义：包括细胞工程、基因工程、酶5细胞工程在离体（invitro）条件下以细胞为基本单位，借助人工培养基，对生物细胞进行培养、繁殖，或者使其发生变异，从而改良生物品种、创造新品种、加速繁育，或利用细胞培养生产有用物质的过程。细胞工程包括细胞培养、细胞融合、细胞器转移、生物体的克隆与规模化繁殖等。细胞工程在离体（invitro）条件下以细胞为基本单位，6第一个哺乳动物的克隆——Dolly羊第一个哺乳动物的克隆——Dolly羊7酶工程利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需要的产品。是酶学理论与化工技术相结合的新技术体系。酶工程利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转8发酵工程利用微生物与现代化工程技术相结合，工厂化生产人类需要的物质的一种技术体系。目前医用抗生素、农用抗生素绝大部分都是发酵工程产品。发酵工程利用微生物与现代化工程技术相结合，工厂化生产人类需9基因工程利用人工方法在体外（invitro）切割、拼接、重组生物的遗传物质，获得重组DNA分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改良。基因工程操作的对象是DNA分子。又称为重组DNA技术基因工程利用人工方法在体外（invitro）切割、拼接、重10重组DNA技术流程重组DNA技术流程11§２基因工程的工具酶内切核酸酶(endonuclease)DNA连接酶(ligase)DNA聚合酶（DNApolymerase）RNA聚合酶（RNApolymerase）反转录酶（reversetranscriptase）最重要的工具酶是限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）§２基因工程的工具酶内切核酸酶(endonuclease)12限制性内切核酸酶或称限制性酶(restrictionenzyme),是基因工程最重要的工具。在细菌中这些酶的功能是降解外来DNA分子，以限制(restriction)或阻止病毒侵染。这类酶能识别双链DNA分子中特异的核苷酸序列，并在特定的位置将双连DNA分子切断。限制性内切核酸酶或称限制性酶(restrictionenz13EcoRⅠEcoRⅠ14限制性内切核酸酶的命名原则：根据分离出这种酶的细菌在分类学上的属名、种名和菌株名来命名。名称的第一个字母是该细菌的属名的第一个字母，大写，斜体。名称的第二、三个字母是该细菌种名的前两个字母，小写，斜体。名称的第四个字母是菌株的名称，大写或小写，正体。如果没有菌株名称就不写。名称最后的是罗马数字，表示从这种细菌中分离出来的酶的序号，如从某个菌株中分离出来的第一种酶为Ⅰ，第二种酶为Ⅱ，等等。限制性内切核酸酶的命名原则：根据分离出这种酶的细菌在分类学上15如EcoRⅠ来自大肠杆菌（Escherichiacoli）R菌株，读作echo-r-one；HindⅢ来自流感噬血杆菌（Hemophilusinfluenzae）d菌株,读作hind-three如EcoRⅠ来自大肠杆菌（Escherichiacoli）16限制酶的分类限制性核酸内切酶的工作分为2个步骤：识别特定的DNA序列在特定的位置切割DNA分子根据其作用特点,可以将限制性酶分为三种类型：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型。在基因工程中用途最广泛的是Ⅱ型限制酶。限制酶的分类限制性核酸内切酶的工作分为2个步骤：17Ⅰ型限制酶有特定的识别序列但切割位置远离识别位置有的种类可以在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割DNA分子在基因工程中没有什么用途Ⅰ型限制酶有特定的识别序列18Ⅲ型限制酶有特定的识别序列切割位置在识别序列3’端相距20bp处，可以产生各种类型的单链末端。Ⅲ型限制酶在基因工程中有特定的用途，但总体来说，用途不大。Ⅲ型限制酶有特定的识别序列19Ⅱ型限制酶在DNA上有特定的识别序列而且其切割位点就在识别序列内部基因工程中用途最广识别序列是对称的，在一条链中从5’到3’方向的序列与其互补链从5’到3’方向的序列完全相同，称为回纹对称序列(palindrome)。Ⅱ型限制酶在DNA上有特定的识别序列20酶切与连接酶切与连接21常见内切酶常见内切酶22DNA连接酶(DNAligase)共价连接5′－磷酸和3′－OH，形成磷酸二酯键(3′－

5′phosphodiesterbond)

，封闭DNA双链上的缺刻(nick)。DNA连接酶(DNAligase)共价连接5′－磷酸和3′23反转录酶

reversetranscriptase反转录酶

reversetranscriptase24

§3载体(vector)将外源DNA片段运送进宿主细胞(hostcell)进行扩增或表达的运载工具称为载体。载体也是DNA分子。§3载体(vector)将外源DNA片段运送进宿主细胞25常用载体：细菌质粒、噬菌体、病毒等。

都要经过人工改造。细菌人工染色体（BAC）酵母菌人工染色体（YAC）人类人工染色体（HAC）常用载体：细菌质粒、噬菌体、病毒等。26载体的基本条件①有独立的复制原点(ori)，能独立地自我复制，而且能带动外源DNA一起复制。②具有多种限制性酶的切点，用于连接外源DNA片段。③载体上的限制酶酶切位点对于任何一种限制酶来说只能有一个。④具有一个选择标记基因。载体的基本条件①有独立的复制原点(ori)，能独立地自我复制27质粒载体

①分子量小(2.69kb),但能携带较大的外源片段；②拷贝数多,在每个宿主细胞可达500个；③酶切位点多，克隆方便；④具有α-互补显色表型,便于检测。

质粒载体

①分子量小(2.69kb),但能携带较大的外源片段28互补显色反应

互补显色反应29λ噬菌体（30kb）

λ噬菌体（30kb）30粘粒（cosmid）载体（45kb）粘粒（cosmid）载体（45kb）31细菌人工染色体BAC（300kb）

bacterialartificialchromosome来源于F因子细菌人工染色体BAC（300kb）

bacterialar32YAC（1Mb）

yeastartificialchromosomeYAC（1Mb）

yeastartificialchro33Ti质粒Ti质粒是根癌农杆菌的染色体外遗传物质双链闭合环状DNA，150～200kb植物基因工程常用的载体Ti质粒Ti质粒是根癌农杆菌的染色体外遗传物质34Ti质粒结构T-DNATransferDNA是农杆菌侵入植物细胞时从Ti质粒上转移到植物细胞的一段DNAT-DNA两端个有一段25bp的同向重复序列，是T-DNA的边缘区LB；RB在同一条单链的LB和RB内各形成一个缺口，单链T-DNA进入植物细胞Ti质粒结构T-DNA35§4

基因的分离与鉴定

从基因库中分离基因聚合酶链式反应(PCR)扩增基因人工合成基因T－DNA标签法

§4基因的分离与鉴定从基因库中分离基因36(一)从基因库中分离基因

1．构建基因库

2．筛选基因库

3．阳性克隆的分析与鉴定

(一)从基因库中分离基因1．构建基因库371．构建基因库

基因库(library)是一组DNA或cDNA序列克隆的集合体。创建基因文库的目的是从特定的材料中分离目的DNA片段或基因。把所有的基因集中在一个库中，采用一定的方法在库中筛选目的基因。同时也便于基因的长期保存。1．构建基因库基因库(library)是一组DNA或cD38基因组文库GenomicDNAlibrary使用与切割载体相同的限制酶，将供体生物的基因组DNA切割成许多片段将所有片段连接到载体上，构成一个重组DNA群体这个群体包含全基因组的遗传信息基因组文库GenomicDNAlibrary使用与切割39cDNA文库cDNAlibrary以mRNA为模板，经反转录酶合成互补DNA(complementaryDNA，cDNA)将双链cDNA与适当载体连接转化到宿主细胞内进行扩增，建成cDNA文库cDNA文库cDNAlibrary40基因组文库与cDNA文库的比较：基因组文库包含基因组的所有基因cDNA文库只包括某一特定细胞类型、某一组织、或某一发育时期的表达序列分离特定基因，cDNA库比较方便研究调控序列，必须基因组文库基因组文库与cDNA文库的比较：基因组文库包含基因组的所有41从基因库中筛选特定的克隆

一个基因文库中有几万个克隆，目的基因到底在哪个克隆上呢？根据待选基因相关信息确定筛选方法和条件。最常用的方法是利用一段核苷酸序列作探针，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，筛选基因库从基因库中筛选特定的克隆一个基因文库中有几万个克隆，目的基42DNA探针（probe）探针是一段能够与待选目的基因互补的核酸序列DNA、cDNA、寡聚核苷酸单链、双链同位素标记、荧光标记、颜色标记DNA探针（probe）探针是一段能够与待选目的基因互补的43筛选文库质粒基因库筛选细菌混合液在培养在平板上转移到尼龙膜上裂解细菌变性DNA标记探针杂交漂洗放射自显影或荧光检测挑取对应菌落、培养抽提质粒筛选文库质粒基因库筛选44阳性克隆的分析与鉴定

从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能最后得到目的基因测序自动测序仪功能分析预测软件阳性克隆的分析与鉴定从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一45核酸序列测定的原理核酸序列测定的原理46磷酸二脂键磷酸二脂键47测序电泳图谱测序电泳图谱48核酸序列分析与功能预测同源性比较

同源基因是指那些起源相同、序列相似的基因。可从核酸及蛋白质两种水平比较基因间的同源性。将测出的核酸序列同杂交的探针序列进行比较将得到的序列发到BLAST等DNAData库的网址上比较核酸序列分析与功能预测同源性比较49开放阅读框（openreadingframe,ORF）分析开放阅读框：一段能编码一条多肽链，并具有翻译起始信号（ATG）和终止信号(TAA、TAG或TGA)的核苷酸序列。来自cDNA库的序列可直接进行0RF分析，比较其与其他序列的同源性来确定其身份。来自核基因库的序列，因大多数真核生物基因含有内含子。开放阅读框（openreadingframe,ORF）50开放阅读框（openreadingframe,ORF）分析开放阅读框（openreadingframe,ORF）51

TGCTCGCTCCTACGAATCCTGCCCCTGAGTAACAATGACTGACTTTTAATTTGTTTGCAG61CTAGGGTGGGGATCGAGATGGTGATCTTGGAGCAGCCACAGCTGCTCCTTCTTCTTCTTC121TTCTTGTAGCAGCTGCAGCTGCAACCGGCGCCACAGCAGCCGACGACGAGTTGGAGTGTC181CCTCCTCCATCTTCGGTAAGTAGCAAAGCACAGTATGACATTCACGAATGCATGTCATGA241TCTATCACTCCCTTTGTCTTCGCTACATTACATACTCTGCCTGTGTTTACCTACTGTACC301CGTCTTCAATTCAATTTGCTGTTGGCTCCCGCGCTTTCCCGAAGCCGCGTGTAGTAGTAT361CATAAAAGTAGGAGTAGATCTTTAATTTGCCCGGCGAAAACTGCTCCTAGTGGTAGATCT421TTGGCTCGGATCGGAGAAGATATTGTAGCTGTACTCTGATCGAGAGCATGCATGCTTGTT481AATCCGATCGAGCGTATTCCTCTGAGTTTGTTATGCTCTGATATTGTAATTGTGGCTGGA541TAATTTTCAAGAAAAAAAAATCGGTTACATACATGCATTTGCACTAATTAACTAGATTGT601GCATCAACAGATCACGCTGTGAACTCTCAAGGCGCCATTCAGTTCCCCGTGTTCCACAAG661AAGCACCAATGCCTCCGCCCATGGTCTGTCCGTGCAACCCAGGCATCCTCGACCGGAGCA721TCAGGAGCAGGAAAAGGAGGAGGATTGAACAATCTACAGGAAGAGGAGATCACTTCATCA781AGTAGTACAAAAATCGACGTGATCGAAGACAGCAGCATCAACGACTTCCTGTTCCTAATG841GCCGTCAGTCTGGGCAAGCCACCGGTTGTGAACCTGGTGGCGATCGACACGGGATCCACC901CTCTCGTGGGTGCAATGCCAGCCGTGCGCGGTGCACTGCCACACGCAGTCCGCGAAGGCC961GGCCCGATATTCGATCCCGGCAGATCCTACACATCCCGGCGAGTTCGCTGCTCGTCGGTC1021AAGTGCGGCGAGCTGAGGTACGATCTGCGGCTCCAGCAAGCCAATTGCATGGAGAAGGAA1081GACAGCTGCACGTACAGCGTCACGTACGGGAACGGGTGGGCGTACAGCGTGGGCAAGATG1141GTGACAGACACGCTGAGGATTGGGGACTCGTTTATGGATCTCATGTTCGGGTGCAGCATG1201GATGTCAAGTACAGCGAATTCGAGGCCGGCATCTTTGGTTTCGGCAGCAGCAGCTTCTCT1261TTCTTCGAGCAGCTGGCAGGGTACCCTGATATTCTGAGTTACAAGGCATTAAGCTACTGC1321TTGCCCACTGACGAGACCAAGCCCGGATACATGATCCTGGGAAGATACGACCGTGCCGCC1381ATGGATGGGGGTTACACTCCTCTCTTCCGGTCAATCAACAGGCCAACCTACTCACTGACG1441ATGGAGATGCTTATCGCCAACGGGCAGAGATTGGTGACATCGTCTTCGGAGATGATCGTC1501GATTCCGGGGCCCAGAGGACGTCCCTGTGGCCTTCCACTTTTGCTCTCCTTGACAAGACC1561ATCACGCAGGCAATGTCGTCGATTGGGTATCACCGGACATCAAGAGCGCGCCAAGAATCA1621TACATCTGCTACTTATCGGAGCACGACTATTCTGGTTGGAACGGCACCATCACGCCCTTC1681TCCAACTGGTCCGCCTTGCCTCTGCTGGAGATCGGCTTCGCCGGCGGTGCTGCACTCGCT1741TTGCCACCCAGAAACGTCTTCTACAACGATCCACACCGCGGTTTGTGCATGACCTTTGCT1801CAGAATCCTGCTCTCAGGTCTCAGATACTGGGGAACAGGGTTACTCGATCCTTCGGAACA1861ACCTTCGACATCCAGGGGAAACAATTCGGCTTCAAATATGCCGTTTGCTGATCGTCGATT1921ATTCCTCATCCTATGATATCTTATAGCTTGCGGGTACGTACCAAGTATATATCAAACTAA1981TTGCATACATGCTCTCCCTCCCTCTGTCCATGCATGTCCTCGTTTCATTGCAAATCTGCA2041TCGATCAATCCAGTTACTGATAATTCCTCCTTATTAACTTAGGCTGATCGATCCATTGCT2101TCTCGTGTGTATATTATGCAGGTCGATTAATTAGCTGGTTTGCCCAAATAACTGATCGGA2161TTGGAGTCTTCTCCCGCGCTACACTACCCCTAGCTGCGATCGTATCACAAGCTAGCGGTA2221CTTGATTTGGGACCTAATTCGTTCAAAAAAAACTTGGCAGCTTAATTTGGGACCTAGTAG2281CTAGCTGAGCCACTACTAGATGTTTACGTACCAGCTATCCGTCGTTTGTTTGTGTCTCCT2341GTGCTTGTGCT2351bpTGCTCGCTCCTACGAATCCTGC52(二)聚合酶链式反应(PCR)扩增基因

利用PCR方法可以在数小时内使目的DNA片段扩增到数百万个拷贝。基本原理：根据待扩增基因的部分序列合成成对引物，在体外合成两个引物之间的DNA序列。(二)聚合酶链式反应(PCR)扩增基因利用PCR方法可以53聚合酶链式反应

(PCR，polymerasechainreaction)聚合酶链式反应

(PCR，polymerasechain54PCR反应根据待扩增基因序列合成两个引物，10-20bp,分别与待扩增基因二条链的两端互补。在DNA模板变性成单链后，两个引物分别与单链DNA复性，在耐热的Taqpolymerse及4种脱氧核苷酸存在下，由引物引导合成DNA新链。3个步骤：变性94-95℃,双链变性成单链复性50-70℃,两个引物分别与单链DNA互补延伸72℃,在引物Taq酶的作用下从5'→3'的方向合成模板DNA的互补链。PCR反应根据待扩增基因序列合成两个引物，10-20bp,分55PCR反应常有25－35个循环经过25个循环以后，理论上原来一个分子DNA可以扩增为106个拷贝。仅用少量的模板DNA分子，可以得到大量扩增产物。通常可以扩增5kb左右的DNA片段。性能更好的Taq酶可以扩增长达40kb的DNA片段。PCR扩增的DNA序列经过核酸序列测定分析后，可作为基因工程的目的基因。PCR反应常有25－35个循环56PCR循环数与产物拷贝数之间的关系PCR循环数与产物拷贝数之间的关系57PCR技术的关键人工合成寡核苷酸片段（引物）耐热的TaqDNApolymerase

（来自Thermusaquaticus，94kDa）PCR技术的关键人工合成寡核苷酸片段（引物）58PCR方法已成为分子生物学研究常规手段而且还用于遗传、发育、进化、疾病诊断、法医学等领域PCR技术的发明是现代生物学发展史上的又一个里程碑发明人获得了1993年诺贝尔化学奖PCR方法已成为分子生物学研究常规手段59（三）人工合成基因根据已知的基因序列，或根据氨基酸序列推测DNA序列将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。（三）人工合成基因根据已知的基因序列，或根据氨基酸序列推测60首先化学合成多个含有80－100个核苷酸的寡聚核苷酸每个寡聚核苷酸片段之间有19－24个核苷酸的重叠序列再将各个寡聚核苷酸等量(摩尔浓度)混合，在DNA聚合酶(或Taq酶)作用下，各寡聚核苷酸又作为引物合成新链，使单链部分补齐成为双链。再用两个PCR引物，经PCR扩增出DNA片段。若将两个DNA片段放在一起，经SOE-PCR(sequenceoverlappedextension，SOE)扩增出完整的基因片段首先化学合成多个含有80－100个核苷酸的寡聚核苷酸61（四）T－DNA标签克隆基因利用T－DNA插入创造突变体获得突变体的纯合材料分析突变体性状与T－DNA的共分离关系PCR获得T－DNA的侧翼基因组序列用所得序列作探针筛选基因文库，获得目标基因或克隆再作进一步的分析（四）T－DNA标签克隆基因利用T－DNA插入创造突变体62T－DNA标签克隆基因的基本原理构建T－DNA载体转化植物（T1，T－DNA杂合体）筛选T2，获得突变体寻找与T－DNA共分离的个体让其自交，产生纯合体PCR获得T－DNA两侧的基因组序列利用侧翼DNA序列作探针从DNA文库中钓取基因基因功能验证（遗传互补测验，用分离的野生基因转化突变体，恢复功能）T－DNA标签克隆基因的基本原理构建T－DNA载体63重组DNA分子的构建用相同的内切酶酶解目的基因与载体将载体与目的基因混合用DNAligase连接重组DNA分子的构建用相同的内切酶酶解目的基因与载体64重组DNA分子的构建重组DNA分子的构建65§5外源基因导入宿主细胞将目的基因与载体连接，构建重组DNA分子重组DNA分子必须导入宿主细胞才能扩增或表达§5外源基因导入宿主细胞将目的基因与载体连接，构建重组D66重组DNA导入原核生物原核生物基因工程的受体通常是大肠杆菌导入方式多用转化法也有用结合的方法重组DNA导入原核生物原核生物基因工程的受体通常是大肠杆菌67重组DNA导入植物1、根癌农杆菌转化技术2、基因枪法重组DNA导入植物1、根癌农杆菌转化技术68根癌农杆菌转化技术根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens)根癌农杆菌介导的植物转化是应用得最早而广泛的一种植物转化方法。双子叶植物、单子叶植物都可以用。根癌农杆菌转化技术根癌农杆菌69将目的基因与花椰菜花叶病毒35S启动子及终止子组成嵌合DNA分子插入到Ti衍生质粒的RB与LB之间构成重组质粒转化根瘤土壤杆菌细胞重组根瘤土壤杆菌感染植物细胞使质粒的部分DNA与目的基因一起整合到植物染色体上，实现遗传转化

将目的基因与花椰菜花叶病毒35S启动子及终止子组成嵌合DNA70植物转基因过程植物转基因过程71基因枪法基因枪（genegun）法，又称微粒轰击法（microprojectilebombartment，biolistics）依赖高速的金属微粒将外源基因导入植物细胞优点：无宿主限制，可用于任何基因型的材料缺点：转化频率低，结果重复性差，多拷贝导入导致基因沉默，实验成本高基因枪法基因枪（genegun）法，又称微粒轰击法（mic72基因工程的应用1、生物科学基础研究的重要手段2、改良植物3、改良动物4、基因工程工业5、疾病诊断与基因治疗6、环境保护基因工程的应用1、生物科学基础研究的重要手段73生物科学基础研究的重要手段基因结构的重叠现象和不连续性mRNA的剪辑转座因子基因表达的调控生物与环境信号的识别癌变机理生物科学基础研究的重要手段基因结构的重叠现象和不连续性74改良植物抗虫植物抗除草剂植物1996年开始转基因作物投入生产2003年，抗虫作物1000万hm2

抗除草剂作物5000万hm2美国转基因棉花80％；全球50％我国进口的大豆绝大部分是转基因大豆改良植物抗虫植物75改良动物比转基因植物发展慢原因：涉及社会伦理和宗教问题在技术上动物细胞的再生能力克隆羊Dolly转基因鱼是比较成功的将重组DNA导入受体合子细胞核中，借助于母体环境实现转基因动物生产改良动物比转基因植物发展慢76基因工程工业生产工业、农业、药用蛋白质转移花色基因或特异性状，改变花卉的花色和外观，提高观赏价值基因工程工业生产工业、农业、药用蛋白质77人工生产胰岛素人工生产胰岛素78疾病诊断和基因治疗正常基因替代缺陷基因修复突变基因制造疾病诊断试剂盒生产疫苗

用酵母菌生产人乙肝疫苗是第一个真核生物基因工程的商业化产品有人设想将蜘蛛丝弹性蛋白基因转入植物，生产弹性蛛丝蛋白，治疗人类软骨细胞增生疾病诊断和基因治疗正常基因替代缺陷基因79基因工程用于环境保护利用转基因微生物降解污染物如：油船事故的处理基因工程用于环境保护利用转基因微生物降解污染物80转基因生物的安全性对环境的安全性对人类健康的安全性宗教及伦理问题风险未知既不能夸大风险，也不能掉以轻心国家有完善的安全性评价程序和一系列的政策法规转基因生物的安全性对环境的安全性81第12章遗传工程

第12章遗传工程82本章教学时数：2学时。本章重点：基因工程的基本流程。本章难点：分子标记和基因图谱；研究基因功能的方法本章教学时数：2学时。83§1

遗传工程概述

遗传工程：细胞工程酶工程发酵工程基因工程§1遗传工程概述遗传工程：84遗传工程的概念遗传工程（geneticengineering），也称生物工程（biologicalengineering）。是指利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或更适合人类需求的产品的遗传学手段。遗传工程的概念遗传工程（geneticengineer85广义遗传工程和狭义遗传工程：广义：包括细胞工程、基因工程、酶工程和发酵工程等。狭义：基因工程。广义遗传工程和狭义遗传工程：广义：包括细胞工程、基因工程、酶86细胞工程在离体（invitro）条件下以细胞为基本单位，借助人工培养基，对生物细胞进行培养、繁殖，或者使其发生变异，从而改良生物品种、创造新品种、加速繁育，或利用细胞培养生产有用物质的过程。细胞工程包括细胞培养、细胞融合、细胞器转移、生物体的克隆与规模化繁殖等。细胞工程在离体（invitro）条件下以细胞为基本单位，87第一个哺乳动物的克隆——Dolly羊第一个哺乳动物的克隆——Dolly羊88酶工程利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转化成所需要的产品。是酶学理论与化工技术相结合的新技术体系。酶工程利用酶的催化作用，在一定的生物反应器中，将相应的原料转89发酵工程利用微生物与现代化工程技术相结合，工厂化生产人类需要的物质的一种技术体系。目前医用抗生素、农用抗生素绝大部分都是发酵工程产品。发酵工程利用微生物与现代化工程技术相结合，工厂化生产人类需90基因工程利用人工方法在体外（invitro）切割、拼接、重组生物的遗传物质，获得重组DNA分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改良。基因工程操作的对象是DNA分子。又称为重组DNA技术基因工程利用人工方法在体外（invitro）切割、拼接、重91重组DNA技术流程重组DNA技术流程92§２基因工程的工具酶内切核酸酶(endonuclease)DNA连接酶(ligase)DNA聚合酶（DNApolymerase）RNA聚合酶（RNApolymerase）反转录酶（reversetranscriptase）最重要的工具酶是限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）§２基因工程的工具酶内切核酸酶(endonuclease)93限制性内切核酸酶或称限制性酶(restrictionenzyme),是基因工程最重要的工具。在细菌中这些酶的功能是降解外来DNA分子，以限制(restriction)或阻止病毒侵染。这类酶能识别双链DNA分子中特异的核苷酸序列，并在特定的位置将双连DNA分子切断。限制性内切核酸酶或称限制性酶(restrictionenz94EcoRⅠEcoRⅠ95限制性内切核酸酶的命名原则：根据分离出这种酶的细菌在分类学上的属名、种名和菌株名来命名。名称的第一个字母是该细菌的属名的第一个字母，大写，斜体。名称的第二、三个字母是该细菌种名的前两个字母，小写，斜体。名称的第四个字母是菌株的名称，大写或小写，正体。如果没有菌株名称就不写。名称最后的是罗马数字，表示从这种细菌中分离出来的酶的序号，如从某个菌株中分离出来的第一种酶为Ⅰ，第二种酶为Ⅱ，等等。限制性内切核酸酶的命名原则：根据分离出这种酶的细菌在分类学上96如EcoRⅠ来自大肠杆菌（Escherichiacoli）R菌株，读作echo-r-one；HindⅢ来自流感噬血杆菌（Hemophilusinfluenzae）d菌株,读作hind-three如EcoRⅠ来自大肠杆菌（Escherichiacoli）97限制酶的分类限制性核酸内切酶的工作分为2个步骤：识别特定的DNA序列在特定的位置切割DNA分子根据其作用特点,可以将限制性酶分为三种类型：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型。在基因工程中用途最广泛的是Ⅱ型限制酶。限制酶的分类限制性核酸内切酶的工作分为2个步骤：98Ⅰ型限制酶有特定的识别序列但切割位置远离识别位置有的种类可以在同识别序列相距1000bp的位置上随机切割DNA分子在基因工程中没有什么用途Ⅰ型限制酶有特定的识别序列99Ⅲ型限制酶有特定的识别序列切割位置在识别序列3’端相距20bp处，可以产生各种类型的单链末端。Ⅲ型限制酶在基因工程中有特定的用途，但总体来说，用途不大。Ⅲ型限制酶有特定的识别序列100Ⅱ型限制酶在DNA上有特定的识别序列而且其切割位点就在识别序列内部基因工程中用途最广识别序列是对称的，在一条链中从5’到3’方向的序列与其互补链从5’到3’方向的序列完全相同，称为回纹对称序列(palindrome)。Ⅱ型限制酶在DNA上有特定的识别序列101酶切与连接酶切与连接102常见内切酶常见内切酶103DNA连接酶(DNAligase)共价连接5′－磷酸和3′－OH，形成磷酸二酯键(3′－

5′phosphodiesterbond)

，封闭DNA双链上的缺刻(nick)。DNA连接酶(DNAligase)共价连接5′－磷酸和3′104反转录酶

reversetranscriptase反转录酶

reversetranscriptase105

§3载体(vector)将外源DNA片段运送进宿主细胞(hostcell)进行扩增或表达的运载工具称为载体。载体也是DNA分子。§3载体(vector)将外源DNA片段运送进宿主细胞106常用载体：细菌质粒、噬菌体、病毒等。

都要经过人工改造。细菌人工染色体（BAC）酵母菌人工染色体（YAC）人类人工染色体（HAC）常用载体：细菌质粒、噬菌体、病毒等。107载体的基本条件①有独立的复制原点(ori)，能独立地自我复制，而且能带动外源DNA一起复制。②具有多种限制性酶的切点，用于连接外源DNA片段。③载体上的限制酶酶切位点对于任何一种限制酶来说只能有一个。④具有一个选择标记基因。载体的基本条件①有独立的复制原点(ori)，能独立地自我复制108质粒载体

①分子量小(2.69kb),但能携带较大的外源片段；②拷贝数多,在每个宿主细胞可达500个；③酶切位点多，克隆方便；④具有α-互补显色表型,便于检测。

质粒载体

①分子量小(2.69kb),但能携带较大的外源片段109互补显色反应

互补显色反应110λ噬菌体（30kb）

λ噬菌体（30kb）111粘粒（cosmid）载体（45kb）粘粒（cosmid）载体（45kb）112细菌人工染色体BAC（300kb）

bacterialartificialchromosome来源于F因子细菌人工染色体BAC（300kb）

bacterialar113YAC（1Mb）

yeastartificialchromosomeYAC（1Mb）

yeastartificialchro114Ti质粒Ti质粒是根癌农杆菌的染色体外遗传物质双链闭合环状DNA，150～200kb植物基因工程常用的载体Ti质粒Ti质粒是根癌农杆菌的染色体外遗传物质115Ti质粒结构T-DNATransferDNA是农杆菌侵入植物细胞时从Ti质粒上转移到植物细胞的一段DNAT-DNA两端个有一段25bp的同向重复序列，是T-DNA的边缘区LB；RB在同一条单链的LB和RB内各形成一个缺口，单链T-DNA进入植物细胞Ti质粒结构T-DNA116§4

基因的分离与鉴定

从基因库中分离基因聚合酶链式反应(PCR)扩增基因人工合成基因T－DNA标签法

§4基因的分离与鉴定从基因库中分离基因117(一)从基因库中分离基因

1．构建基因库

2．筛选基因库

3．阳性克隆的分析与鉴定

(一)从基因库中分离基因1．构建基因库1181．构建基因库

基因库(library)是一组DNA或cDNA序列克隆的集合体。创建基因文库的目的是从特定的材料中分离目的DNA片段或基因。把所有的基因集中在一个库中，采用一定的方法在库中筛选目的基因。同时也便于基因的长期保存。1．构建基因库基因库(library)是一组DNA或cD119基因组文库GenomicDNAlibrary使用与切割载体相同的限制酶，将供体生物的基因组DNA切割成许多片段将所有片段连接到载体上，构成一个重组DNA群体这个群体包含全基因组的遗传信息基因组文库GenomicDNAlibrary使用与切割120cDNA文库cDNAlibrary以mRNA为模板，经反转录酶合成互补DNA(complementaryDNA，cDNA)将双链cDNA与适当载体连接转化到宿主细胞内进行扩增，建成cDNA文库cDNA文库cDNAlibrary121基因组文库与cDNA文库的比较：基因组文库包含基因组的所有基因cDNA文库只包括某一特定细胞类型、某一组织、或某一发育时期的表达序列分离特定基因，cDNA库比较方便研究调控序列，必须基因组文库基因组文库与cDNA文库的比较：基因组文库包含基因组的所有122从基因库中筛选特定的克隆

一个基因文库中有几万个克隆，目的基因到底在哪个克隆上呢？根据待选基因相关信息确定筛选方法和条件。最常用的方法是利用一段核苷酸序列作探针，用放射性同位素或非放射性同位素标记探针，筛选基因库从基因库中筛选特定的克隆一个基因文库中有几万个克隆，目的基123DNA探针（probe）探针是一段能够与待选目的基因互补的核酸序列DNA、cDNA、寡聚核苷酸单链、双链同位素标记、荧光标记、颜色标记DNA探针（probe）探针是一段能够与待选目的基因互补的124筛选文库质粒基因库筛选细菌混合液在培养在平板上转移到尼龙膜上裂解细菌变性DNA标记探针杂交漂洗放射自显影或荧光检测挑取对应菌落、培养抽提质粒筛选文库质粒基因库筛选125阳性克隆的分析与鉴定

从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能最后得到目的基因测序自动测序仪功能分析预测软件阳性克隆的分析与鉴定从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一126核酸序列测定的原理核酸序列测定的原理127磷酸二脂键磷酸二脂键128测序电泳图谱测序电泳图谱129核酸序列分析与功能预测同源性比较

同源基因是指那些起源相同、序列相似的基因。可从核酸及蛋白质两种水平比较基因间的同源性。将测出的核酸序列同杂交的探针序列进行比较将得到的序列发到BLAST等DNAData库的网址上比较核酸序列分析与功能预测同源性比较130开放阅读框（openreadingframe,ORF）分析开放阅读框：一段能编码一条多肽链，并具有翻译起始信号（ATG）和终止信号(TAA、TAG或TGA)的核苷酸序列。来自cDNA库的序列可直接进行0RF分析，比较其与其他序列的同源性来确定其身份。来自核基因库的序列，因大多数真核生物基因含有内含子。开放阅读框（openreadingframe,ORF）131开放阅读框（openreadingframe,ORF）分析开放阅读框（openreadingframe,ORF）132

TGCTCGCTCCTACGAATCCTGCCCCTGAGTAACAATGACTGACTTTTAATTTGTTTGCAG61CTAGGGTGGGGATCGAGATGGTGATCTTGGAGCAGCCACAGCTGCTCCTTCTTCTTCTTC121TTCTTGTAGCAGCTGCAGCTGCAACCGGCGCCACAGCAGCCGACGACGAGTTGGAGTGTC181CCTCCTCCATCTTCGGTAAGTAGCAAAGCACAGTATGACATTCACGAATGCATGTCATGA241TCTATCACTCCCTTTGTCTTCGCTACATTACATACTCTGCCTGTGTTTACCTACTGTACC301CGTCTTCAATTCAATTTGCTGTTGGCTCCCGCGCTTTCCCGAAGCCGCGTGTAGTAGTAT361CATAAAAGTAGGAGTAGATCTTTAATTTGCCCGGCGAAAACTGCTCCTAGTGGTAGATCT421TTGGCTCGGATCGGAGAAGATATTGTAGCTGTACTCTGATCGAGAGCATGCATGCTTGTT481AATCCGATCGAGCGTATTCCTCTGAGTTTGTTATGCTCTGATATTGTAATTGTGGCTGGA541TAATTTTCAAGAAAAAAAAATCGGTTACATACATGCATTTGCACTAATTAACTAGATTGT601GCATCAACAGATCACGCTGTGAACTCTCAAGGCGCCATTCAGTTCCCCGTGTTCCACAAG661AAGCACCAATGCCTCCGCCCATGGTCTGTCCGTGCAACCCAGGCATCCTCGACCGGAGCA721TCAGGAGCAGGAAAAGGAGGAGGATTGAACAATCTACAGGAAGAGGAGATCACTTCATCA781AGTAGTACAAAAATCGACGTGATCGAAGACAGCAGCATCAACGACTTCCTGTTCCTAATG841GCCGTCAGTCTGGGCAAGCCACCGGTTGTGAACCTGGTGGCGATCGACACGGGATCCACC901CTCTCGTGGGTGCAATGCCAGCCGTGCGCGGTGCACTGCCACACGCAGTCCGCGAAGGCC961GGCCCGATATTCGATCCCGGCAGATCCTACACATCCCGGCGAGTTCGCTGCTCGTCGGTC1021AAGTGCGGCGAGCTGAGGTACGATCTGCGGCTCCAGCAAGCCAATTGCATGGAGAAGGAA1081GACAGCTGCACGTACAGCGTCACGTACGGGAACGGGTGGGCGTACAGCGTGGGCAAGATG1141GTGACAGACACGCTGAGGATTGGGGACTCGTTTATGGATCTCATGTTCGGGTGCAGCATG1201GATGTCAAGTACAGCGAATTCGAGGCCGGCATCTTTGGTTTCGGCAGCAGCAGCTTCTCT1261TTCTTCGAGCAGCTGGCAGGGTACCCTGATATTCTGAGTTACAAGGCATTAAGCTACTGC1321TTGCCCACTGACGAGACCAAGCCCGGATACATGATCCTGGGAAGATACGACCGTGCCGCC1381ATGGATGGGGGTTACACTCCTCTCTTCCGGTCAATCAACAGGCCAACCTACTCACTGACG1441ATGGAGATGCTTATCGCCAACGGGCAGAGATTGGTGACATCGTCTTCGGAGATGATCGTC1501GATTCCGGGGCCCAGAGGACGTCCCTGTGGCCTTCCACTTTTGCTCTCCTTGACAAGACC1561ATCACGCAGGCAATGTCGTCGATTGGGTATCACCGGACATCAAGAGCGCGCCAAGAATCA1621TACATCTGCTACTTATCGGAGCACGACTATTCTGGTTGGAACGGCACCATCACGCCCTTC1681TCCAACTGGTCCGCCTTGCCTCTGCTGGAGATCGGCTTCGCCGGCGGTGCTGCACTCGCT1741TTGCCACCCAGAAACGTCTTCTACAACGATCCACACCGCGGTTTGTGCATGACCTTTGCT1801CAGAATCCTGCTCTCAGGTCTCAGATACTGGGGAACAGGGTTACTCGATCCTTCGGAACA1861ACCTTCGACATCCAGGGGAAACAATTCGGCTTCAAATATGCCGTTTGCTGATCGTCGATT1921ATTCCTCATCCTATGATATCTTATAGCTTGCGGGTACGTACCAAGTATATATCAAACTAA1981TTGCATACATGCTCTCCCTCCCTCTGTCCATGCATGTCCTCGTTTCATTGCAAATCTGCA2041TCGATCAATCCAGTTACTGATAATTCCTCCTTATTAACTTAGGCTGATCGATCCATTGCT2101TCTCGTGTGTATATTATGCAGGTCGATTAATTAGCTGGTTTGCCCAAATAACTGATCGGA2161TTGGAGTCTTCTCCCGCGCTACACTACCCCTAGCTGCGATCGTATCACAAGCTAGCGGTA2221CTTGATTTGGGACCTAATTCGTTCAAAAAAAACTTGGCAGCTTAATTTGGGACCTAGTAG2281CTAGCTGAGCCACTACTAGATGTTTACGTACCAGCTATCCGTCGTTTGTTTGTGTCTCCT2341GTGCTTGTGCT2351bpTGCTCGCTCCTACGAATCCTGC133(二)聚合酶链式反应(PCR)扩增基因

利用PCR方法可以在数小时内使目的DNA片段扩增到数百万个拷贝。基本原理：根据待扩增基因的部分序列合成成对引物，在体外合成两个引物之间的DNA序列。(二)聚合酶链式反应(PCR)扩增基因利用PCR方法可以134聚合酶链式反应

(PCR，polymerasechainreaction)聚合酶链式反应

(PCR，polymerasechain135PCR反应根据待扩增基因序列合成两个引物，10-20bp,分别与待扩增基因二条链的两端互补。在DNA模板变性成单链后，两个引物分别与单链DNA复性，在耐热的Taqpolymerse及4种脱氧核苷酸存在下，由引物引导合成DNA新链。3个步骤：变性94-95℃,双链变性成单链复性50-70℃,两个引物分别与单链DNA互补延伸72℃,在引物Taq酶的作用下从5'→3'的方向合成模板DNA的互补链。PCR反应根据待扩增基因序列合成两个引物，10-20bp,分136PCR反应常有25－35个循环经过25个循环以后，理论上原来一个分子DNA可以扩增为106个拷贝。仅用少量的模板DNA分子，可以得到大量扩增产物。通常可以扩增5kb左右的DNA片段。性能更好的Taq酶可以扩增长达40kb的DNA片段。PCR扩增的DNA序列经过核酸序列测定分析后，可作为基因工程的目的基因。PCR反应常有25－35个循环137PCR循环数与产物拷贝数之间的关系PCR循环数与产物拷贝数之间的关系138PCR技术的关键人工合成寡核苷酸片段（引物）耐热的TaqDNApolymerase

（来自Thermusaquaticus，94kDa）PCR技术的关键人工合成寡核苷酸片段（引物）139PCR方法已成为分子生物学研究常规手段而且还用于遗传、发育、进化、疾病诊断、法医学等领域PCR技术的发明是现代生物学发展史上的又一个里程碑发明人获得了1993年诺贝尔化学奖PCR方法已成为分子生物学研究常规手段140（三）人工合成基因根据已知的基因序列，或根据氨基酸序列推测DNA序列将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。（三）人工合成基因根据已知的基因序列，或根据氨基酸序列推测141首先化学合成多个含有80－100个核苷酸的寡聚核苷酸每个寡聚核苷酸片段之间有19－24个核苷酸的重叠序列再将各个寡聚核苷酸等量(摩尔浓度)混合，在DNA聚