低分子量肝素的抗过敏作用

低分子量肝素的抗过敏作用*摘要：目的：研究低分子量肝素(lowmolecularweightheparin,LMWH)的抗过敏作用。方法：用卵白蛋白(ovalbumin,OA)免疫豚鼠造成过敏模型，观察LMWH对OA所致的豚鼠离体回肠平滑肌收缩的影响；在大鼠颅骨骨膜接种抗血清使肥大细胞被动致敏，观察LMWH对OA引起肥大细胞脱颗粒的影响；以4-氨基毗啶诱发小鼠舔体反应，观察LMWH对舔体反应的影响；以冰醋酸使小鼠毛细血管通透性增加，观察LMWH对通透性的影响。结果：LMWH16000u.L-1(P<0.01)和8000u.L-1(P<0.05)均能显著降低OA所致的致敏豚鼠离体回肠平滑肌收缩高度；LMWH200，50和12.5u.kg-1(PV0.01)均能明显抑制颅骨骨膜肥大细胞脱颗粒；LMWH60u.kg-1(P<0.01)和30u.kg-1(P<0.05)均能显著减少4-氨基毗啶诱发的小鼠舔体反应次数，并能抑制冰醋酸所致的小鼠毛细血管通透性增加。结论：LMWH对多种动物模型具有抗过敏的作用，这种作用可能与其抑制肥大细胞脱颗粒和抗炎作用有关。关键词：低分子量肝素；过敏反应；肥大细胞TheeffectsoflowmolecularweightheparinonallergicresponseWangQingli(WangQL)

(DepartmentofPharmacology,ShandongMedicalUniversity,Jinan250012)

ShangXueyuan(ShangXY)(DepartmentofPharmacology,ShandongMedicalUniversity,Jinan250012)

JiJianbo(JiJB)(DepartmentofPharmacology,ShandongMedicalUniversity,Jinan250012)ABSTRACT:OBJECTIVE：Tostudytheeffectsoflowmolecularweightheparin(LMWH)onallergicresponse.METHODS:Guinea-pigsweresensitizedbyovalbumin(OA)andtheeffectsofLMWHontheconstrictionofileumsmoothmuscleinducedbyOAwereobservedinvitro;TheeffectsofLMWHonthedegranulationofpericraniummastcellinducedbyOAwereobservedthroughthepassiveanaphylaxisratmodelwhichwasmadebyvaccinatingantiserumatpericranium;Lickingresponsewasinducedby4-aminopyridine(4-AP)scatscruffinmice,thentheeffectofLMWHonlickingresponsewasstudiedthecapillarypemeabiltyincreasinginducedbyglactalaceticacidandtheeffectofLMWHoncapillarypemeabilitywerestudied.RESULTS:LMWH16000and8000u-L-1couldsignificantlyinhibittheconstrictionoftheisolatedileumsmoothmuscleofovalbumin(OA)-sensitizedguineapigsinducedbyOAinvitro(P<0.01,P<0.05vsvehicle);LMWH200,50and12.5u-kg-1ipcouldmarkedlyinhibitthedegranulationofpericraniumMCinrats(P<0.01vsvehicle),LMWH60and30u-kg-1ipcouldsigificantlydepressthelickingresponseinducedby4-aminopyridineandtheincreasingofcapillarypermeabilityinducedbyaceticacidinmice（PV0.01,PV0.05vsvehicle）.CONCLUSION:LMWHinthedosagesusedinthepresentstudypossessedanti-allergicactivityinseveralanimalmodels,andtheactivitywaslikelyrelatedtoitsinhibitoryeffectsonthedegranulationofMCandtoitsantiinflammatoryeffects.KEYWORDS：lowmolecularweightheparin,allergicresponse,mastcell▲肝素类药物除作为抗凝药应用于临床外，还具有多种非抗凝活性，如免疫调节、抑制细胞生长、抗肿瘤、抗艾滋病、抗炎等⑴。最近研究发现肝素类药物能抑制房尘螨提取物（house-dustmiteextract）等过敏原和组织胺引起的过敏性哮喘反应和抗原引起的皮肤和肺的急性过敏反应学〜力。低分子量肝素（LMWH）是近年发展起来的一类新型生化药物，是肝素以不同的工艺分级或降解而成的低分子量的组分或片段，Mr约3000〜8000，较未分级肝素具有明显的优越性［4〜5】。本研究通过多种动物模型研究了LMWH抗过敏反应方面的作用，为临床应用提供实验资料。1材料1.1药品与试剂LMWH匚"5500（本校生化制药教研室），地塞米松（dexamethasone,Dex，济南永宁制药股份有限公司），冰醋酸（HAc，上海试剂一厂），吸附百日咳菌苗白喉破伤风类毒素混合制剂（卫生部上海生物制品研究所）；卵白蛋白（ovalbumin,OA），4-氨基毗啶（4-aminopyridine,4-AP），依文思蓝（均为Sigma产品），用前以NS配成所需浓度。1.2动物豚鼠（175±25）g；Wistar大鼠（125±25）g；昆明种小鼠（20±2）g,均由山东医科大学实验动物中心提供。1.3仪器台式自动平衡记录仪（中国上海）；U2000分光光度计（日本产）；Olmpus显微镜（日本产）。2方法LMWH对OA引起致敏豚鼠离体回肠平滑肌过敏性收缩的影响⑹豚鼠imOA50mg.ml-1溶液0.4ml，同时ip1ml致敏。30d后制备肠段进行离体实验。充氧，负荷1g，36°C保温，按随机顺序分别给以NS（等容量），LMWH高、低剂量或Dex使浴液终末药物浓度分别达到16000，8000u.L-1和200mg.L-1。均于药后5min加OA0.2mg记录收缩高度（mm），并按下式计算收缩抑制率（%）。LMWH对大鼠颅骨骨膜肥大细胞（mastcell,MC）脱颗粒的影响［6〜8】2.2.1制备抗血清大鼠两后腿imOA10mg.kg-1，同时ip吸附百日咳菌苗白喉破伤风类毒素混合制剂2ml.只-1。2周后颈总动脉取血制备抗血清，-20°C保存，用前以NS稀释成1：20备用。2.2.2脱颗粒实验取大鼠随机分成5组，第1天分别ip,NS（等容量），LMWH200，50，12.5u.kg-i和Dex2.5mg.kg-i。药后30min，ip戊巴比妥麻醉动物，将1：20抗血清0.15ml接种于大鼠颅顶皮下。第2天药后30min抗原攻击，ivOA1mg（溶于2.5mg.ml-1的依文思蓝溶液1ml中）。30min后颈总动脉放血处死动物，剪去颅顶部皮肤，取下颅盖骨，立即浸于无水乙醇中，1h后移置无水甲醇中固定过夜，1.8mg.ml-1的中性红无水乙醇液染色30min，自来水冲洗，小心分离骨膜，平铺于玻片上，干燥后，显微镜下直接观察进行MC计数，计算每1mm2的MC数，计算脱颗粒率。LMWH对4-AP诱发小鼠舔体反应的影响⑴取小鼠，随机分成4组。实验日分别ipNS（等容量），LMWH60，30u.kg-1或Dex3mg.kg-1。药后30min，动物颈背部sc4-AP1mg.kg-1，记录动物发生舔体反应的潜伏期和10min内的舔体次数。LMWH对HAc所致的小鼠毛细血管通透性增加的影响小鼠40只，随机分成4组，实验日分别ipNS（等容量），LMWH60，30u.kg-1或Dex3mg.kg-1。30min后，ip1mol.L-1HAc溶液10ml.kg-1。30min后，iv50mg.ml-1依文思蓝10ml.kg-1。20min后，颈椎脱臼处死动物，剪开腹部皮肤，经腹膜向腹腔注入6mlNS，轻轻按摩2min，回收腹腔液，离心后取上清于A560nm处测定吸光度A。2.5数据统计方法实验结果均以Bis表示，按t检验进行数据统计分析。3结果LMWH对OA引起致敏豚鼠离体回肠平滑肌过敏性收缩的影响加入OA可引起致敏回肠平滑肌收缩，与NS组比较，LMWH16000u.L-1和8000u.L-1均能显著降低回肠平滑肌的收缩高度（分别PV0.01和PV0.05）；Dex200mg.L-1也能显著降低收缩高度（PV0.01）。LMWH16000u.L-1组和Dex200mg.kg-1组比较无显著性差异。结果见表1。表1LMWH对OA引起致敏豚鼠离体回肠平滑肌过敏性收缩的影响.匕LI±s组别浓度标本数/n收缩高度/mm抑制率/%NS等容量973.0±9.5--LMWH16000u.L-1747.7±18.12)32.78000u.L-1756.0i19.11)28.9Dex200mg.L-1737.5±14.62)43.9注：与NS组比较，1）PV0.05,2）PV0.01LMWH对大鼠颅骨骨膜MC脱颗粒的影响各组MC总数无显著性差别（PV0.05）。OA可引起被动致敏大鼠颅骨骨膜MC

脱颗粒，与NS组比较，LMWH各剂量组和Dex2.5mg.kg-i组均能显著减少脱颗粒MC数(PV0.01)，降低脱颗粒率作用与剂量呈正相关。LMWH50u.kg-i组和12.5u.kg-1组与Dex2.5mg.kg-1组比较，无显著性差异。结果见表2。表2LMWH对大鼠颅骨骨膜肥大细胞脱颗粒的影响.』土s,n=8组别剂量MC总数/个mm-2脱颗粒MC数/个.mm-2脱颗粒率/%NS等容量407.8±118.4361.4±104.288.7±3.6LMWH200u.kg-1492.0±89.280.0±38.51)15.8±5.51)50u.kg-1449.8±89.1142.0±42.71)31.4±5.41)12.5u.kg-1377.5±110.0167.0±51.71)44.9±3.61)Dex2.5mg.kg-1351.0±55.7170.0±27.61)48.9±6.41)注：与NS组比较，1)PV0.01LMWH对4-AP诱发小鼠舔体反应的影响4-AP可诱发小鼠舔体反应。与NS组比较，LMWH60u.kg-1和30u.kg-1均能显著减少4-AP诱发的小鼠舔体次数(分别PV0.01和PV?0.05)；Dex3mg.kg-1组也能明显减少舔体次数(PV0.01)；LMWH各剂量组和Dex组对潜伏期均无显著影响，LMWH60u.kg-1组和Dex3mg.kg-1组无显著性差异。结果见表3。表3LMWH对4-AP诱发小鼠舔体反应的影响.』土s,n=10组别剂量潜伏期/s舔体次数NS等容量50.3±21.234.6±16.6LMWH60u.kg-164.7±22.016.2±4.02)30u.kg-162.7±25.721.7±5.61)Dex3mg.kg-162.6±17.315.2±7.52)注：与NS组比较，1)PV0.05,2)PV0.01LMWH对HAc所致的小鼠毛细血管通透性增加的影响与NS组比较，LMWH60u.kg-1(P<0.01)，30u.kg-1(P<0.05)和Dex(PV0.01)均能显著降低A值，即降低HAc所致的毛细血管对依文思蓝的通透性增加，结果见表4。表4EO±s,n=10组别剂量表4EO±s,n=10组别剂量ANS等容量0.454±0.054LMWH60u.kg-10.345±0.0792)LMWH对HAc所致的小鼠毛细血管通透性增加的影响.30u.kg-10.382+0.0821)Dex3mg.kg-10.290+0.0742)注：与NS组比较，i）PV0.05,2）PV0.014讨论32+[8]3果还显示，LMWH能抑制OA引起的致敏豚鼠离体回肠平滑肌收缩，该作用可能依赖于其抑制MC脱颗粒从而降低炎症介质释放有关，表明LMWH有抑制致敏原引起的过敏反应的作用。4-AP是一种K+通道阻滞剂，可以阻滞K+通道，膜电位降低，Ca2+通道易于打开，使更多的Ca2+内流，促进神经末稍释放递质，从而促使MC脱颗粒[10]。颈背部4-AP可引起皮肤MC脱颗粒，释放组胺，引起小鼠舔体反应⑼。LMWH能显著减少4-AP引起的小鼠舔体反应次数，表明LMWH能够抑制非抗原引起的MC脱颗粒。过敏反应过程中伴有炎症的发生，毛细血管通透性升高是炎症早期的重要反应。本研究发现LMWH能降低HAc所致的毛细血管通透性升高，提示LMWH也可通过抑制炎症反应来发挥其抗过敏作用。■基金项目：山东省自然科学基金资助号Q98Co7130作者单位：王庆利（济南山东医科大学药学院药理学教研室250012）尚雪原（济南山东医科大学药学院药理学教研室250012）纪建波（济南山东医科大学药学院药理学教研室250012）孟雅娟（济南山东医科大学药学院药理学教研室250012）朱业靖（济南山东医科大学药学院药理学教研室250012）程艳娜（济南山东医科大学药学院药理学教研室250012）张世玲（济南山东医科大学药学院药理学教研室250012）参考文献：尚丽，周序斌，张黎华.肝素的非抗凝药理作用.中国药理学通报，1995,11（4）：366.Diamantz,TimmersMC,vanderVeenH,etal.Effectofheparinonallergen-inducedearlyandlateasthmaticresponsesinpatientswithatopicasthma.AmJRespirCritCareMed,1996,153:1790.BowlerSD,SmithSM,LavercombePS.Heparininhibit