第十章 DNA的生物合成 Chapter 10 Biosynthesis of DNA78课件

第十章DNA的生物合成

Chapter10

BiosynthesisofDNADNA复制的特点DNA复制的条件DNA生物合成过程DNA的损伤与修复第十章DNA的生物合成

Chapter10B1教学目的:1.掌握DNA复制的特点2.了解DNA复制的条件3.掌握DNA的生物合成过程4.了解DNA的损伤与修复教学重点难点:DNA复制的特点DNA的生物合成过程教学课时：2教学目的:2DNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。生物体的遗传信息就贮存在DNA的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。

DNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携3DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。DNA的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则。

在RNA病毒中，其遗传信息贮存在RNA分子中。因此，在这些生物体中，遗传信息的流向是RNA通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代，通过反转录将遗传信息传递给DNA，再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质，这种遗传信息的流向就称为反中心法则。

DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将4DNAdependentDNApolymerase——DDDPDNAdependentRNApolymerase——DDRPRNAdependentRNApolymerase——RDRPRNAdependentDNApolymerase——RDDPDNAdependentDNApolymerase——5第一节DNA复制的特点

一、半保留复制

DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservativereplication)。

第一节DNA复制的特点一、半保留复制6DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M.Meselson和F.Stahl所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作密度梯度离心，可得到下列结果：

DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M.Mesel7二、有一定的复制起始点DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点（复制子）。在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。

二、有一定的复制起始点8三、需要引物

参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3’端自由羟基（3’-OH）的RNA作为引物(primer)，才能开始聚合子代DNA链。RNA引物的大小，在原核生物中通常为50～100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。

三、需要引物9四、双向复制DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。

四、双向复制10五、半不连续复制由于DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须为3'→5'。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。五、半不连续复制11以3'→5'方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为5'→3'，这一条链被称为领头链(leadingstrand)。而以5'→3'方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是5'→3'，这条链被称为随从链(laggingstrand)。以3'→5'方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是12由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成也是一段一段的。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazakifragment)。冈崎片段的大小，在原核生物中约为1000～2000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。

由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成也13第二节DNA复制的条件

一、底物以四种脱氧核糖核酸(deoxynucleotidetriphosphate)为底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。

(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi

第二节DNA复制的条件一、底物14二、模板(template)DNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代DNA链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。

二、模板(template)15三、引发体和RNA引物引发体(primosome)由引发前体与引物酶（primase）组装而成。引发前体是由若干蛋白因子聚合而成的复合体。在原核生物中，引发前体至少由六种蛋白因子构成。蛋白i、蛋白n、蛋白n”、蛋白dnaC与引物预合成有关，蛋白n’与蛋白dnaB与识别复制起始点有关，并具有ATPase活性。引物酶本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP），该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物(primer)，以提供自由的3'-OH，使子代DNA链能够开始聚合。

三、引发体和RNA引物16四、DNA聚合酶(DDDP)（一）种类和生理功能：在原核生物中，目前发现的DNA聚合酶有三种，分别命名为DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ），DNA聚合酶Ⅱ（polⅡ），DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ），这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。参与DNA复制的主要是polⅢ和polⅠ。

四、DNA聚合酶(DDDP)（一）种类和生理功能：17polⅠ为单一肽链的大分子蛋白质,可被特异的蛋白酶水解为两个片段，其中的大片段称为Klenowfragment，具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶的活性。

polⅠ为单一肽链的大分子蛋白质,可被特异的蛋白酶水解为两18polⅢ由十种亚基组成，其中α亚基具有5'→3'聚合DNA的酶活性，因而具有复制DNA的功能；而ε亚基具有3'→5'外切酶的活性，因而与DNA复制的校正功能有关。

polⅢ由十种亚基组成，其中α亚基具有5'→3'聚合DNA19

原核生物中的三种DNA聚合酶

原核生物中的三种DNA聚合酶

20在真核生物中，目前发现的DNA聚合酶有五种，分别命名为DNA聚合酶α（polα），DNA聚合酶β（polβ），DNA聚合酶γ（polγ），DNA聚合酶δ（polδ），DNA聚合酶ε（polε）。其中，参与染色体DNA复制的是polα（延长随从链）和polδ（延长领头链），参与线粒体DNA复制的是polγ，polε与DNA损伤修复、校读和填补缺口有关，polβ只在其他聚合酶无活性时才发挥作用。

在真核生物中，目前发现的DNA聚合酶有五种，分别命名为DNA21（二）DNA复制的保真性：为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关：1．遵守严格的碱基配对规律；2．DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择；3．对复制过程中出现的错误及时进行校正。

（二）DNA复制的保真性：22五、DNA连接酶DNA连接酶(DNAligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，而使两段DNA连接起来。五、DNA连接酶23DNA连接酶催化的条件是：①需一段DNA片段具有3'-OH，而另一段DNA片段具有5'-Pi基；②未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；③需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。DNA连接酶催化的条件是：①需一段DNA片段具有3'-OH24六、单链DNA结合蛋白单链DNA结合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又称螺旋反稳蛋白（HDP）。这是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。其作用为：①使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA；②保护单链DNA，避免核酸酶的降解。

六、单链DNA结合蛋白25七、解螺旋酶解螺旋酶（unwindingenzyme），又称解链酶或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白，每解开一对碱基，需消耗两分子ATP。目前发现存在至少存在两种解螺旋酶。

七、解螺旋酶26八、拓扑异构酶(topoisomerase)拓扑异构酶Ⅰ可使DNA双链中的一条链切断，松开双螺旋后再将DNA链连接起来，从而避免出现链的缠绕。拓扑异构酶Ⅱ可切断DNA双链，使DNA的超螺旋松解后，再将其连接起来。大肠杆菌拓朴异构酶Ⅰ的结构八、拓扑异构酶(topoisomerase)大肠杆菌拓朴异构27第三节DNA生物合成过程

一、复制的起始DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。

（一）预引发：1．解旋解链，形成复制叉：由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。单链DNA结合蛋白（SSB）结合在两条单链DNA上，形成复制叉。DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。

第三节DNA生物合成过程一、复制的起始282．引发体组装：由蛋白因子（如dnaB等）识别复制起始点，并与其他蛋白因子以及引物酶一起组装形成引发体。

2．引发体组装：29（二）引发：在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3'端自由羟基（3'-OH）。

（二）引发：30二、复制的延长

（一）聚合子代DNA：由DNA聚合酶催化，以3'→5'方向的亲代DNA链为模板，从5'→3'方向聚合子代DNA链。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶Ⅲ；而在真核生物中，是DNA聚合酶α(延长随从链)和δ（延长领头链）。

二、复制的延长（一）聚合子代DNA：31（二）引发体移动：引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，随从链重新合成RNA引物，继续进行链的延长。

（二）引发体移动：32第十章DNA的生物合成Chapter10BiosynthesisofDNA78课件33三、复制的终止

（一）去除引物，填补缺口：在原核生物中，由DNA聚合酶Ⅰ来水解去除RNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由DNA聚合酶来延长。

三、复制的终止（一）去除引物，填补缺口：34（二）连接冈崎片段：在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。

（二）连接冈崎片段：35（三）真核生物端粒的形成：端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。其共同的结构特征是由一些富含G、C的短重复序列构成，可重复数十次至数百次。

（三）真核生物端粒的形成：36线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。

线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现37端粒酶(telomerase)的作用机制端粒酶(telomerase)的作用机制38第四节DNA的损伤与修复

一、DNA的损伤（突变）

由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA的损伤，也称为突变（mutation）。常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联，链的断裂，重组等。

第四节DNA的损伤与修复一、DNA的损伤（突变）39（一）引起突变的因素：1．自发因素：(1)自发脱碱基：由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。(2)自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。每日可达几十到几百个核苷酸残基。(3)复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发生频率较低。

（一）引起突变的因素：402．物理因素：由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。其中，X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。

2．物理因素：413．化学因素：

(1)脱氨剂：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成I。

3．化学因素：42

(2)烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的烷基化，甚至可引起邻近碱基的交联。

(3)DNA加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。

(4)碱基类似物：如5-FU，6-MP等，可掺入到DNA分子中引起损伤或突变。

(5)断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引起DNA链的断裂。

(2)烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供43（二）DNA突变的类型：

（二）DNA突变的类型：44碱基的转换碱基的转换45（三）DNA突变的效应：

1．同义突变：基因突变导致mRNA暗码子第三位碱基的改变但不引起暗码子意义的改变，其翻译产物中的氨基酸残基顺序不变，但有时可引起翻译效率降低。

2．误义突变：基因突变导致mRNA暗码子碱基被置换，其意义发生改变，翻译产物中的氨基酸残基顺序发生改变。

3．无义突变：基因突变导致mRNA暗码子碱基被置换而改变成终止暗码子，引起多肽链合成的终止。

4．移码突变：基因突变导致mRNA暗码子碱基被置换，引起突变点之后的氨基酸残基顺序全部发生改变。

（三）DNA突变的效应：46二、DNA损伤的修复

DNA损伤的修复方式可分为直接修复和取代修复两大类。

二、DNA损伤的修复DNA损伤的修复方式可分为直接修复和取47（一）直接修复：

1．光复活：（lightrepairing）：这是一种广泛存在的修复作用。光复活能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。其修复过程为：光复活酶（photo-lyase)识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物→在300～600nm可见光照射下，酶获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰环打开，使之完全修复→光复活酶从DNA上解离。

（一）直接修复：48

2．转甲基作用：在转甲基酶的催化下，将DNA上的被修饰的甲基去除。此时，转甲基酶自身被甲基化而失活。

3．直接连接：DNA断裂形成的缺口，可以在DNA连接酶的催化下，直接进行连接而封闭缺口。

2．转甲基作用：49（二）取代修复：1．切除修复(excisionrepairing)：这也是一种广泛存在的修复机制，可适用于多种DNA损伤的修复。该修复机制可以分别由两种不同的酶来发动，一种是核酸内切酶，另一种是DNA糖苷酶。

（二）取代修复：50第十章DNA的生物合成Chapter10BiosynthesisofDNA78课件51

2．重组修复(recombinationrepairing)：这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。

2．重组修复(recombinationrepairi52

3．SOS修复：这是一种在DNA分子受到较大范围损伤并且使复制受到抑制时出现的修复机制，以SOS借喻细胞处于危急状态。DNA分子受到长片段高密度损伤，使DNA复制过程在损伤部位受到抑制。

损伤诱导一种特异性较低的新的DNA聚合酶，以及重组酶等的产生。

由这些特异性较低的酶继续催化损伤部位DNA的复制，复制完成后，保留许多错误的碱基，从而造成突变。

3．SOS修复：53第十章DNA的生物合成Chapter10BiosynthesisofDNA78课件54D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)voWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgPdLa2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#kShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(voWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdH6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pD2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s55第十章DNA的生物合成

Chapter10

BiosynthesisofDNADNA复制的特点DNA复制的条件DNA生物合成过程DNA的损伤与修复第十章DNA的生物合成

Chapter10B56教学目的:1.掌握DNA复制的特点2.了解DNA复制的条件3.掌握DNA的生物合成过程4.了解DNA的损伤与修复教学重点难点:DNA复制的特点DNA的生物合成过程教学课时：2教学目的:57DNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携带者。生物体的遗传信息就贮存在DNA的四种脱氧核糖核酸的排列顺序中。

DNA是由四种脱氧核糖核酸所组成的长链大分子，是遗传信息的携58DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将遗传信息传递给蛋白质分子，从而决定生物的表现型。DNA的复制、转录和翻译过程就构成了遗传学的中心法则。

在RNA病毒中，其遗传信息贮存在RNA分子中。因此，在这些生物体中，遗传信息的流向是RNA通过复制，将遗传信息由亲代传递给子代，通过反转录将遗传信息传递给DNA，再由DNA通过转录和翻译传递给蛋白质，这种遗传信息的流向就称为反中心法则。

DNA通过复制将遗传信息由亲代传递给子代；通过转录和翻译，将59DNAdependentDNApolymerase——DDDPDNAdependentRNApolymerase——DDRPRNAdependentRNApolymerase——RDRPRNAdependentDNApolymerase——RDDPDNAdependentDNApolymerase——60第一节DNA复制的特点

一、半保留复制

DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservativereplication)。

第一节DNA复制的特点一、半保留复制61DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M.Meselson和F.Stahl所完成的实验所证明。该实验首先将大肠杆菌在含15N的培养基中培养约十五代，使其DNA中的碱基氮均转变为15N。将大肠杆菌移至只含14N的培养基中同步培养一代、二代、三代。分别提取DNA，作密度梯度离心，可得到下列结果：

DNA以半保留方式进行复制，是在1958年由M.Mesel62二、有一定的复制起始点DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点（复制子）。在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。

二、有一定的复制起始点63三、需要引物

参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3’端自由羟基（3’-OH）的RNA作为引物(primer)，才能开始聚合子代DNA链。RNA引物的大小，在原核生物中通常为50～100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。

三、需要引物64四、双向复制DNA复制时，以复制起始点为中心，向两个方向进行复制。但在低等生物中，也可进行单向复制（如滚环复制）。

四、双向复制65五、半不连续复制由于DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须为3'→5'。因此，分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时的方式是不同的。五、半不连续复制66以3'→5'方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为5'→3'，这一条链被称为领头链(leadingstrand)。而以5'→3'方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是5'→3'，这条链被称为随从链(laggingstrand)。以3'→5'方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是67由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成也是一段一段的。DNA在复制时，由随从链所形成的一些子代DNA短链称为冈崎片段(Okazakifragment)。冈崎片段的大小，在原核生物中约为1000～2000个核苷酸，而在真核生物中约为100个核苷酸。

由于亲代DNA双链在复制时是逐步解开的，因此，随从链的合成也68第二节DNA复制的条件

一、底物以四种脱氧核糖核酸(deoxynucleotidetriphosphate)为底物，即dATP，dGTP，dCTP，dTTP。

(dNMP)n+dNTP(dNMP)n+1+PPi

第二节DNA复制的条件一、底物69二、模板(template)DNA复制是模板依赖性的，必须要以亲代DNA链作为模板。亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。

二、模板(template)70三、引发体和RNA引物引发体(primosome)由引发前体与引物酶（primase）组装而成。引发前体是由若干蛋白因子聚合而成的复合体。在原核生物中，引发前体至少由六种蛋白因子构成。蛋白i、蛋白n、蛋白n”、蛋白dnaC与引物预合成有关，蛋白n’与蛋白dnaB与识别复制起始点有关，并具有ATPase活性。引物酶本质上是一种依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP），该酶以DNA为模板，聚合一段RNA短链引物(primer)，以提供自由的3'-OH，使子代DNA链能够开始聚合。

三、引发体和RNA引物71四、DNA聚合酶(DDDP)（一）种类和生理功能：在原核生物中，目前发现的DNA聚合酶有三种，分别命名为DNA聚合酶Ⅰ（polⅠ），DNA聚合酶Ⅱ（polⅡ），DNA聚合酶Ⅲ（polⅢ），这三种酶都属于具有多种酶活性的多功能酶。参与DNA复制的主要是polⅢ和polⅠ。

四、DNA聚合酶(DDDP)（一）种类和生理功能：72polⅠ为单一肽链的大分子蛋白质,可被特异的蛋白酶水解为两个片段，其中的大片段称为Klenowfragment，具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶的活性。

polⅠ为单一肽链的大分子蛋白质,可被特异的蛋白酶水解为两73polⅢ由十种亚基组成，其中α亚基具有5'→3'聚合DNA的酶活性，因而具有复制DNA的功能；而ε亚基具有3'→5'外切酶的活性，因而与DNA复制的校正功能有关。

polⅢ由十种亚基组成，其中α亚基具有5'→3'聚合DNA74

原核生物中的三种DNA聚合酶

原核生物中的三种DNA聚合酶

75在真核生物中，目前发现的DNA聚合酶有五种，分别命名为DNA聚合酶α（polα），DNA聚合酶β（polβ），DNA聚合酶γ（polγ），DNA聚合酶δ（polδ），DNA聚合酶ε（polε）。其中，参与染色体DNA复制的是polα（延长随从链）和polδ（延长领头链），参与线粒体DNA复制的是polγ，polε与DNA损伤修复、校读和填补缺口有关，polβ只在其他聚合酶无活性时才发挥作用。

在真核生物中，目前发现的DNA聚合酶有五种，分别命名为DNA76（二）DNA复制的保真性：为了保证遗传的稳定，DNA的复制必须具有高保真性。DNA复制时的保真性主要与下列因素有关：1．遵守严格的碱基配对规律；2．DNA聚合酶在复制时对碱基的正确选择；3．对复制过程中出现的错误及时进行校正。

（二）DNA复制的保真性：77五、DNA连接酶DNA连接酶(DNAligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，而使两段DNA连接起来。五、DNA连接酶78DNA连接酶催化的条件是：①需一段DNA片段具有3'-OH，而另一段DNA片段具有5'-Pi基；②未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的；③需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。DNA连接酶催化的条件是：①需一段DNA片段具有3'-OH79六、单链DNA结合蛋白单链DNA结合蛋白（singlestrandbindingprotein,SSB）又称螺旋反稳蛋白（HDP）。这是一些能够与单链DNA结合的蛋白质因子。其作用为：①使解开双螺旋后的DNA单链能够稳定存在，即稳定单链DNA，便于以其为模板复制子代DNA；②保护单链DNA，避免核酸酶的降解。

六、单链DNA结合蛋白80七、解螺旋酶解螺旋酶（unwindingenzyme），又称解链酶或rep蛋白，是用于解开DNA双链的酶蛋白，每解开一对碱基，需消耗两分子ATP。目前发现存在至少存在两种解螺旋酶。

七、解螺旋酶81八、拓扑异构酶(topoisomerase)拓扑异构酶Ⅰ可使DNA双链中的一条链切断，松开双螺旋后再将DNA链连接起来，从而避免出现链的缠绕。拓扑异构酶Ⅱ可切断DNA双链，使DNA的超螺旋松解后，再将其连接起来。大肠杆菌拓朴异构酶Ⅰ的结构八、拓扑异构酶(topoisomerase)大肠杆菌拓朴异构82第三节DNA生物合成过程

一、复制的起始DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。

（一）预引发：1．解旋解链，形成复制叉：由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。单链DNA结合蛋白（SSB）结合在两条单链DNA上，形成复制叉。DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。

第三节DNA生物合成过程一、复制的起始832．引发体组装：由蛋白因子（如dnaB等）识别复制起始点，并与其他蛋白因子以及引物酶一起组装形成引发体。

2．引发体组装：84（二）引发：在引物酶的催化下，以DNA为模板，合成一段短的RNA片段，从而获得3'端自由羟基（3'-OH）。

（二）引发：85二、复制的延长

（一）聚合子代DNA：由DNA聚合酶催化，以3'→5'方向的亲代DNA链为模板，从5'→3'方向聚合子代DNA链。在原核生物中，参与DNA复制延长的是DNA聚合酶Ⅲ；而在真核生物中，是DNA聚合酶α(延长随从链)和δ（延长领头链）。

二、复制的延长（一）聚合子代DNA：86（二）引发体移动：引发体向前移动，解开新的局部双螺旋，形成新的复制叉，随从链重新合成RNA引物，继续进行链的延长。

（二）引发体移动：87第十章DNA的生物合成Chapter10BiosynthesisofDNA78课件88三、复制的终止

（一）去除引物，填补缺口：在原核生物中，由DNA聚合酶Ⅰ来水解去除RNA引物，并由该酶催化延长引物缺口处的DNA，直到剩下最后一个磷酸酯键的缺口。而在真核生物中，RNA引物的去除，由一种特殊的核酸酶来水解，而冈崎片段仍由DNA聚合酶来延长。

三、复制的终止（一）去除引物，填补缺口：89（二）连接冈崎片段：在DNA连接酶的催化下，形成最后一个磷酸酯键，将冈崎片段连接起来，形成完整的DNA长链。

（二）连接冈崎片段：90（三）真核生物端粒的形成：端粒（telomere）是指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构部分，通常膨大成粒状。其共同的结构特征是由一些富含G、C的短重复序列构成，可重复数十次至数百次。

（三）真核生物端粒的形成：91线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现缩短。故需要在端粒酶（telomerase）的催化下，进行延长反应。端粒酶是一种RNA-蛋白质复合体，它可以其RNA为模板，通过逆转录过程对末端DNA链进行延长。

线性DNA在复制完成后，其末端由于引物RNA的水解而可能出现92端粒酶(telomerase)的作用机制端粒酶(telomerase)的作用机制93第四节DNA的损伤与修复

一、DNA的损伤（突变）

由自发的或环境的因素引起DNA一级结构的任何异常的改变称为DNA的损伤，也称为突变（mutation）。常见的DNA的损伤包括碱基脱落、碱基修饰、交联，链的断裂，重组等。

第四节DNA的损伤与修复一、DNA的损伤（突变）94（一）引起突变的因素：1．自发因素：(1)自发脱碱基：由于N-糖苷键的自发断裂，引起嘌呤或嘧啶碱基的脱落。每日可达近万个核苷酸残基。(2)自发脱氨基：胞嘧啶自发脱氨基可生成尿嘧啶，腺嘌呤自发脱氨基可生成次黄嘌呤。每日可达几十到几百个核苷酸残基。(3)复制错配：由于复制时碱基配对错误引起的损伤，发生频率较低。

（一）引起突变的因素：952．物理因素：由紫外线、电离辐射、X射线等引起的DNA损伤。其中，X射线和电离辐射常常引起DNA链的断裂，而紫外线常常引起嘧啶二聚体的形成，如TT，TC，CC等二聚体。这些嘧啶二聚体由于形成了共价键连接的环丁烷结构，因而会引起复制障碍。

2．物理因素：963．化学因素：

(1)脱氨剂：如亚硝酸与亚硝酸盐，可加速C脱氨基生成U，A脱氨基生成I。

3．化学因素：97

(2)烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供甲基或其他烷基，引起碱基或磷酸基的烷基化，甚至可引起邻近碱基的交联。

(3)DNA加合剂：如苯并芘，在体内代谢后生成四羟苯并芘，与嘌呤共价结合引起损伤。

(4)碱基类似物：如5-FU，6-MP等，可掺入到DNA分子中引起损伤或突变。

(5)断链剂：如过氧化物，含巯基化合物等，可引起DNA链的断裂。

(2)烷基化剂：这是一类带有活性烷基的化合物，可提供98（二）DNA突变的类型：

（二）DNA突变的类型：99碱基的转换碱基的转换100（三）DNA突变的效应：

1．同义突变：基因突变导致mRNA暗码子第三位碱基的改变但不引起暗码子意义的改变，其翻译产物中的氨基酸残基顺序不变，但有时可引起翻译效率降低。

2．误义突变：基因突变导致mRNA暗码子碱基被置换，其意义发生改变，翻译产物中的氨基酸残基顺序发生改变。

3．无义突变：基因突变导致mRNA暗码子碱基被置换而改变成终止暗码子，引起多肽链合成的终止。

4．移码突变：基因突变导致mRNA暗码子碱基被置换，引起突变点之后的氨基酸残基顺序全部发生改变。

（三）DNA突变的效应：101二、DNA损伤的修复

DNA损伤的修复方式可分为直接修复和取代修复两大类。

二、DNA损伤的修复DNA损伤的修复方式可分为直接修复和取102（一）直接修复：

1．光复活：（lightrepairing）：这是一种广泛存在的修复作用。光复活能够修复任何嘧啶二聚体的损伤。其修复过程为：光复活酶（photo-lyase)识别嘧啶二聚体并与之结合形成复合物→在300～600nm可见光照射下，酶获得能量，将嘧啶二聚体的丁酰环打开，使之完全修复→光复活酶从DNA上解离。

（一）直接修复：103

2．转甲基作用：在转甲基酶的催化下，将DNA上的被修饰的甲基去除。此时，转甲基酶自身被甲基化而失活。

3．直接连接：DNA断裂形成的缺口，可以在DNA连接酶的催化下，直接进行连接而封闭缺口。

2．转甲基作用：104（二）取代修复：1．切除修复(excisionrepairing)：这也是一种广泛存在的修复机制，可适用于多种DNA损伤的修复。该修复机制可以分别由两种不同的酶来发动，一种是核酸内切酶，另一种是DNA糖苷酶。

（二）取代修复：105第十章DNA的生物合成Chapter10BiosynthesisofDNA78课件106

2．重组修复(recombinationrepairing)：这是DNA的复制过程中所采用的一种有差错的修复方式。

2．重组修复(recombinationrepairi107

3．SOS修复：这是一种在DNA分子受到较大范围损伤并且使复制受到抑制时出现的修复机制，以SOS借喻细胞处于危急状态。DNA分子受到长片段高密度损伤，使DNA复制过程在损伤部位受到抑制。

损伤诱导一种特异性较低的新的DNA聚合酶，以及重组酶等的产生。

由这些特异性较低的酶继续催化损伤部位DNA的复制，复制完成后，保留许多错误的碱基，从而造成突变。

3．SOS修复：108第十章DNA的生物合成Chapter10BiosynthesisofDNA78课件109D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)voWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6E3B0y(v%s#oXlTiQfNbK8H5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*t$qZnVkShPdMaI7F4C0z)w&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdMaI7F3C0z)v&s!pXmUiRfOcK9H6E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2B+x(u$rZoWkThQeMbJ7G4D1z-w*t!qYmVjSgOdLaI6F3B0y)v%s#pXlUiQfNcK8H5E2A+x*u$rZnWkThPeMaJ7G4C1z-w&t!pYmVjRgOdL9I6F3B0y(v%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQeNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z%s#oXlUiQfNbK8H5D2A+x*u$qZnWkShPeMaJ7F4C1z)w&t!pYmUjRgOcL9I6E3B+y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnVkShPdMaJ7F4C0z)w&s!pYmUjRfOcL9H6E3B+y(u%r#oWlTiQeNbJ8G5D1A-x*t$qYnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcK9H6E2B+y(u%rZoWlThQeNbJ8G4D1A-w*t$qYnVjSgPdLaI7F3C0y)v&s#pXmUiRfNcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgOdLaI6F3C0y)v%s#pXlUiRfNcK8H5E2A+x(u$rZnWkThPeMbJ7G4C1z-w&t!qYmVjRgOdL9I6F3B0y)v%s#oXlUiQfNcK8H5D2A+x*u$rZnWkShPeMaJ7G4C1z)w&t!pYmVjRgOcL9I6E3B0y(v%r#oXlTiQfNbK8G5D2A-x*u$qZnWkShPdMaJ7F4C1z)w&s!pYmUjRgOcL9H6E3B+y(v%r#oWlTiQeNbK8G5D1A-x*t$qZnVkSgPdMaI7F4C0z)v&s!pXmUjRfOcL9H6E2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWkThQeMbJ8G4D1z-w*t!qYnVjSgPdLa2B+y(u%r#oWlThQeNbJ8G5D1A-w*t$qYnVkSgPdLaI7F3C0z)v&s#pXmUiRfOcK9H5E2B+x(u%rZoWlThQeMbJ8G4D1A-w*t!qYnVjSgPdLaI6F3C0y)v&s#pXlUiRfNcK9H5E2A+x(u$rZoWkThPeMbJ7G4D1z-w&t!qYmVjSgOdL9I6