目的基因的克隆课件

一般来说,目的基因的克隆战略分为两大类类是构建感兴趣的生物个体的基因文库,即将某生物体的全基因组分段克隆,然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因,然后将之克隆表达。一般来说,目的基因的克隆战略分为两大类1APCR法PCR法定向扩增目的基因的基本原理PCR克隆目的基因的基本程序●PCR盒式引物扩增法DSPanlabsAPCR法21.PCR法定向扩增目的基因的基本原理使用PCR技术克隆目的基因的前提条件是已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列根据该序列化学合成聚合反应所需的双引物DSPanlabs1.PCR法定向扩增目的基因的基本原理3目的基因变性加热聚合底物5退火引物退火引物底物5变性加热退火引物聚合底物目的基因42.PCR克隆目的基因的基本程序由Taqdna聚合酶扩增的PCR产物中,其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基,而且这个碱基几乎总是A,因为TaqdNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在,克隆时即可以采取πσT末端加同聚尾的方法与载体拼接也可以使用专门的T载体克隆PCR扩增产物T7acZMCsoriT载体DSPanlabs2.PCR克隆目的基因的基本程序53.PCR盒式引物扩增法染色体DNASau3A部分酶切5端不含磷酸基二加装盒式接头片变性引物退火DSPanlabs3.PCR盒式引物扩增法6B基因文库的构建基因文库的基本概念基因文库的构建程序基因组文库重组克隆的排序DSPanlabsB基因文库的构建7基因文库的基本概念基因库与基因文库基因库(genepool)特定生物体全基因组的集合(天然存在)基因文库(genelibraryorgenebank)从特定生物个体中分离的全部基因,这些基因以克隆的形式存在(人工构建)。根据枸建方法的不同,基因文库分为●基因组文库(含有全部基因)●cDNA文库(含有全部蛋白质编码的结构基因)DSPanlabs基因文库的基本概念8基因文库的基本概念基因文库构建的基本战略用鸟枪法构建基因组文库,材料来自染色体DNA用cDNA法构建cDNA文库,材料来自mRNA在高度分化的生物体中,不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同(即基因的表达谱不同),因此同种生物体的cDNA文库般还有组织细胞的界定,如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然,CDNA文库的信息量远小于基因组文库DSPanlabs基因文库的基本概念9基因文库的基本概念基因文库的完备性基因文库的完备性是指:在构建的基因文库中任一基因存在的概率,它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示:N=n(1-P)/(1-f)其中:P=任一基因被克隆(或存在于基因文库中)的概率f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小例如,人的单倍体DNA总长为29×109b,基因文库中克隆片段的平均大小为15kb,则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆;而当完备性提高到0.99时,基因文库至少需要180万个克隆DSPanlabs基因文库的基本概念10目的基因的克隆课件11目的基因的克隆课件12目的基因的克隆课件13目的基因的克隆课件14目的基因的克隆课件15目的基因的克隆课件16目的基因的克隆课件17目的基因的克隆课件18目的基因的克隆课件19目的基因的克隆课件20目的基因的克隆课件21目的基因的克隆课件22目的基因的克隆课件23目的基因的克隆课件24目的基因的克隆课件25目的基因的克隆课件26目的基因的克隆课件27目的基因的克隆课件28目的基因的克隆课件29目的基因的克隆课件30目的基因的克隆课件31目的基因的克隆课件32目的基因的克隆课件33目的基因的克隆课件34目的基因的克隆课件35目的基因的克隆课件36目的基因的克隆课件37目的基因的克隆课件38目的基因的克隆课件39目的基因的克隆课件40目的基因的克隆课件41目的基因的克隆课件42目的基因的克隆课件43目的基因的克隆课件44目的基因的克隆课件45目的基因的克隆课件46目的基因的克隆课件47目的基因的克隆课件48目的基因的克隆课件49目的基因的克隆课件50目的基因的克隆课件51目的基因的克隆课件52目的基因的克隆课件53一般来说,目的基因的克隆战略分为两大类类是构建感兴趣的生物个体的基因文库,即将某生物体的全基因组分段克隆,然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因,然后将之克隆表达。一般来说,目的基因的克隆战略分为两大类54APCR法PCR法定向扩增目的基因的基本原理PCR克隆目的基因的基本程序●PCR盒式引物扩增法DSPanlabsAPCR法551.PCR法定向扩增目的基因的基本原理使用PCR技术克隆目的基因的前提条件是已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列根据该序列化学合成聚合反应所需的双引物DSPanlabs1.PCR法定向扩增目的基因的基本原理56目的基因变性加热聚合底物5退火引物退火引物底物5变性加热退火引物聚合底物目的基因572.PCR克隆目的基因的基本程序由Taqdna聚合酶扩增的PCR产物中,其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基,而且这个碱基几乎总是A,因为TaqdNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。由于该突出碱基的存在,克隆时即可以采取πσT末端加同聚尾的方法与载体拼接也可以使用专门的T载体克隆PCR扩增产物T7acZMCsoriT载体DSPanlabs2.PCR克隆目的基因的基本程序583.PCR盒式引物扩增法染色体DNASau3A部分酶切5端不含磷酸基二加装盒式接头片变性引物退火DSPanlabs3.PCR盒式引物扩增法59B基因文库的构建基因文库的基本概念基因文库的构建程序基因组文库重组克隆的排序DSPanlabsB基因文库的构建60基因文库的基本概念基因库与基因文库基因库(genepool)特定生物体全基因组的集合(天然存在)基因文库(genelibraryorgenebank)从特定生物个体中分离的全部基因,这些基因以克隆的形式存在(人工构建)。根据枸建方法的不同,基因文库分为●基因组文库(含有全部基因)●cDNA文库(含有全部蛋白质编码的结构基因)DSPanlabs基因文库的基本概念61基因文库的基本概念基因文库构建的基本战略用鸟枪法构建基因组文库,材料来自染色体DNA用cDNA法构建cDNA文库,材料来自mRNA在高度分化的生物体中,不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同(即基因的表达谱不同),因此同种生物体的cDNA文库般还有组织细胞的界定,如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文库等。很显然,CDNA文库的信息量远小于基因组文库DSPanlabs基因文库的基本概念62基因文库的基本概念基因文库的完备性基因文库的完备性是指:在构建的基因文库中任一基因存在的概率,它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示:N=n(1-P)/(1-f)其中:P=任一基因被克隆(或存在于基因文库中)的概率f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小例如,人的单倍体DNA总长为29×109b,基因文库中克隆片段的平均大小为15kb,则构建一个完备性为0.9的基因文库至少需要45万个克隆;而当完备性提高到0.99时,基因文库至少需要180万个克隆DSPanlabs基因文库的基本概念63目的基因的克隆课件64目的基因的克隆课件65目的基因的克隆课件66目的基因的克隆课件67目的基因的克隆课件68目的基因的克隆课件69目的基因的克隆课件70目的基因的克隆课件71目的基因的克隆课件72目的基因的克隆课件73目的基因的克隆课件74目的基因的克隆课件75目的基因的克隆课件76目的基因的克隆课件77目的基因的克隆课件78目的基因的克隆课件79目的基因的克隆课件80目的基因的克隆课件81目的基因的克隆课件82目的基因的克隆课件83目的基因的克隆课件84目的基因的克隆课件85目的基因的克隆课件86目的基因的克隆课件87目的基因的克隆课件88目的基因的克隆课件89目的基因的克隆课件90目的基因的克隆课件91目的基