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文档简介
导师:王红静教授研究生:张晓燕PTEN基因多态性与子宫内膜异位症的相关性研究导师:王红静教授PTEN基因多态性与子宫研究背景研究背景2
子宫内膜异位症(endometriosis,EMs),是妇科常见疾病之一,组织学上虽然是良性的,但却有增生、浸润、转移及复发等恶性生物学行为。药物及手术治疗复发率均高。究其原因主要是EMs的病因及发病机制尚未完全明了。子宫内膜异位症(endometri3
自1921年Sampson首先提出子宫内膜种植学说以来,在EMs众多的病因及发病机制中,种植学说虽被大多数学者所接受,但它无法解释盆腔外EMs的发生,也无法解释多数育龄妇女存在经血逆流,但仅少数(10%-15%)发病。自1921年Sampson首先提出子宫内膜种4
越来越多的研究表明EMs与高血压、糖尿病、精神分裂症等一大类疾病一样被认为受多基因遗传及多因素的影响。现今的研究表明,子宫内膜碎片必须通过粘附、侵袭及血管形成,方可以生存、生长。这一过程的完成是由在位内膜的不同生物学特征,即基因差异决定的。越来越多的研究表明EMs与高血压、糖尿病、精神分裂症5因此,当前的研究重点在于寻找和鉴定EMs相关的遗传基因。因此,当前的研究重点在于寻找和鉴定EMs相关的遗传基6
PTEN(phosphataseandtensinhomologydeletedonchromosometen,PTEN)是1997年发现的一种新的抑癌基因,是继P53基因之后发现的在人类肿瘤中突变率最高的基因。也是子宫内膜腺癌中发现的突变率最高的基因,被认为是子宫内膜的“看家基因”
。研究发现PTEN与子宫内膜相关性疾病如EMs的发病密切相关。
PTEN(phosphataseandtensi7PTEN通过调控细胞周期,抑制细胞分化,抑制细胞粘附和迁移,诱导凋亡等参与肿瘤的发生、发展。内异症患者在位内膜可能因抑癌基因PTEN失活而表现出与正常内膜不同的生物学特性,如细胞粘附增强,凋亡减少,血管形成能力增强,从而容易在异位部位存活并生长,继而引起相应的症状和体征。PTEN通过调控细胞周期,抑制细胞分化,抑制细胞粘附和8PTEN基因突变、杂合性缺失及多态性改变与多种肿瘤如食道癌、膀胱癌等的发病密切相关。其基因突变、杂合性缺失与EMS的相关性研究报道也较多,而PTEN多态性与EMS的相关性研究才处于探索阶段。PTEN基因突变、杂合性缺失及多态性9PTEN-9C/G(以下简读为-9C/G)单核苷酸多态性(SNP)及PTENⅣS4-/+(以下简读为IVS4-/+)为PTEN基因最常见的两个多态性位点,此两个位点多态性的改变与食道癌、鼻咽癌的相关性研究已见报道。国内外目前尚无此两个位点多态性的改变与EMs的相关性研究报道。PTEN-9C/G(以下简读为-9C/G)单核苷酸多态性(10
PTEN-9C/GSNP位于PTEN翻译起始点上游的第9位核苷酸处,C→G的替换使得G周期性地出现,它非常接近翻译时使核糖体停留在阅读框架内的交感序列,因此C→G的替换可能影响PTEN的表达。
PTENⅣS4-/+为第4内含子的一个插入性多态,可能通过不同剪切及通过与其它位点连锁来影响其基因表达。PTEN-9C/GSNP位于PTEN翻译起始点上游的11本研究首次采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP)技术对PTEN-9C/G及IVS4-/+基因进行分型,旨在探讨此两个位点的多态性与EMs
的关系。本研究首次采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(po12材料与方法材料与方法13
主要实验仪器及设备
名称型号生产厂家洁净工作台上海力申科学仪器有限公司高速离心机TG19A.WS美国BECKMAN公司低温离心机TGL-16H珠海黑马医学仪器有限公司普通冰箱
BCD-130H青岛海尔股份有限公司电子天平PB3002-S瑞士Mettler公司PCR扩增仪PTC一200美国MJReseareh公司Eppendorf移液器0.1-1000ul德国Eppendorf公司紫外扫描仪GelDoe1000美国BioRad公司稳压稳流电泳仪DYY-III3北京市六一仪器厂电泳槽Sub一Cell@Model96美国BioRad公司凝胶成像分析仪AlphaImagerTM2200美国AlphaInnotech公司
主要实验仪器及设备14主要实验试剂试剂名称生产厂商全血基因组DNA提取试剂盒北京博大泰克公司引物合成上海生工DNA胶回收试剂盒北京博大泰克公司PCR纯化试剂盒上海生工蛋白酶K(Germany)Merck公司限制性内切酶AflIINewEnglandBiolabs限制性内切酶DraIINewEnglandBiolabs100bpDNAladder华美生物工程公司主要实验试剂研究对象
EMs组:86人,无肿瘤性及遗传性疾病病史,术后病检证实为子宫内膜异位症的患者。对照组:64人,同期因输卵管阻塞继发不孕、宫外孕及子宫脱垂等手术,术后病检排除EMs,且无肿瘤性及遗传性疾病病史的患者。研究对象EMs组:86人,无肿16
标本采集
采集每位研究个体的外周血3ml,EDTA抗凝,置4℃冰箱保存,并于采血后1周内提取符合条件的研究对象的外周血白细胞DNA。标本采集采集每位研究个体的外周血3ml17实验方法微量全血基因组DNA提取试剂盒,提取全基因组DNA聚合酶链反应-限制性片段长度多多态性(PCR-RFLP)技术,扩增-9C/G和IVS4-/+多态位点的基因片段
分别PCR-AflII、PCR-DraII酶切消化后行基因分型
实验方法微量全血基因组18DNA的提取
用微量全血基因组DNA提取试剂盒,提取全基因组DNA。DNA的提取
用微量全血基因组DNA提取试19100μl裂解液20μlRNaseA/蛋白酶K
,55℃温浴30min
12000rpm离心1min,弃尽上清
,100μlTE10000rpm离心1.5min,弃上清,300μl红细胞裂解液300μl抗凝全血等体积红细胞裂解液加入10μl3MnaAC、1250μl结合缓冲液加入600μl漂洗液加入30μlddH2O洗脱,-20℃保存24小时将所提DNA进行Agarose电泳泳100μl裂解液10000rpm离心1.5min,300μ20
PTEN的基因分型
采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法进行基因分型。PTEN的基因分型采用聚合酶链反应-限制性21PTENIVS4-/+引物:上游引物:5'-GGGGGTGATAACAGTATCTA-3'下游引物:5'-CTTTATGCAATACTTTTTCCTA-3'PTENIVS4-/+引物:22dNTPs5μl
10XBuffer5μl
MgSO42μl
上下游引物各2μl
模板DNA100ng(1μl)
KOD-Plus1μl
ddH2O32μl
PCR反应体系dNTPs10XBufferMgSO4上下游引物模板2372℃延伸1min
58℃退火45s
94℃变性30s
94℃预变性5min
35个循环后,72℃继续延伸5min
PCR反应条件扩增产物为403bp
72℃延伸1min58℃退火45s94℃变性30s9424PTENIVS4-/+PCR产物酶切电泳后判断基因型
纯化PCR产物10μl经限制性内切酶AflII(2μl)
于37℃酶切过夜
行2.5%琼脂糖凝胶电泳
凝胶成像仪下观察判断基因型
-/-纯合型显示403bp一条电泳带,+/+纯合型显示335bp和73bp两条电泳带,-/+杂合型显示403bp、335bp和73bp三条电泳带
PTENIVS4-/+PCR产物酶切电泳后判断基因型纯25
PTEN-9C/G引物为:上游引物:5'-GCAGCCGTTCGGAGGATT-3'下游引物:5'-GCCGCAGAA,ATGGATACAGG-3'PTEN-9C/G引物为:26
PTEN-9C/GPCR反应体系及反应条件同扩增PTENIVS4-/+。PTEN-9C/GPCR反应体系及反应条件同扩增PT27PTEN-9C/GPCR产物酶切电泳后判断基因型
纯化PCR产物10μl经限制性内切酶DraII(10μl)
于37℃酶切过夜
行2.5%琼脂糖凝胶电泳
凝胶成像仪下观察判断基因型
C/C纯合型显示371bp的一条电泳带G/G纯合型显示266bp和105bp两条电泳带C/G杂合型显示371bp、266bp和105bp三条电泳带PTEN-9C/GPCR产物酶切电泳后判断基因型纯化28
统计学分析
数据用SPSS13.0软件进行统计学分析,P<0.05认为有统计学意义。
比较基因型频率的观察值与预期值,并进行卡方检验行Hardy-Weinberg平衡分析。病例组与对照组的基因型及等位基因分布采用卡方检验,用OR值及其95%可信区间,分析PTEN-9C/G、IVS4-/+多态性与EMs的关系。统计学分析数据用SPSS13.0软件29结果结果30
一.研究对象的一般特征:
1.平均年龄EMS组:35.4±7.69岁
对照组:35.6±12.24岁两组比较,平均年龄差异无统计学意义(t=0.122,P>0.05)一.研究对象的一般特征:312.家族史
EMs阳性家族史,
EMs组为24.4%,对照组仅10.9%,两者相比有统计学意义(χ2=4.392,P<0.05)。
EMs阳性家族史明显增加EMs的发病风险,OR值2.6308(95%CI=0.8117-5.1771)。2.家族史32二.PTEN基因ⅣS4-/+扩增产物AflⅡ酶切电泳结果
PTENⅣS4-/-纯合型产生403bp
一条电泳带PTENⅣS4+/+纯合型产生335bp和73bp两条电泳带PTENⅣS4-/+杂合型产生403b、335bp、73bp三条电泳带二.PTEN基因ⅣS4-/+扩增产物AflⅡ酶切电泳结果33
Fig.1GenotypepatternforPTENIVS4(-/+)polymorphismanalyzedbyPCR-AflIIdigestion.Lane1:+/+homozygousgenotype,Lane2:-/-homozygousgenotype,Lane3,4,5,and6:-/+heterozygousgenotype,
基因多态性与子宫内膜异位症的相关性研究课件34
三.
PTEN基因-9C/G扩增产物DraII酶切电泳结果:C/C纯合型产生371bp的一条电泳带G/G纯合型产生266bp和105bp两条电泳带C/G杂合型产生371bp、266bp和105bp三条电泳带
三.PTEN基因-9C/G扩增产物DraII酶切电35Fig.2GenotypepatternforPTEN-9C/GpolymorphismanalyzedbyPCR-DraIIdigestion.Lane1,4and6:C/Gheterozygousgenotype,Lane2and3:G/Ghomozygousgenotype,Lane5:C/Chomozygousgenotype.
Fig.2GenotypepatternforPTE36GenotypeObservedExpectedΧ2andPEMs-/-1024.61-/+7242.79Χ2=32.25+/+418.60P<0.05Control-/-714.54
-/+4731.93Χ2=14.25+/+1017.53P<0.05四.PTENIVS4-/+多态位点的基因型分布GenotypeObservedExpectedΧ2and37
Table2.PTEN-9C/GGenotypeHardy-WeinberyexaminationintwoGroupsGenotypeObservedExpectedΧ2andPEmsC/C7675.34C/G910.30Χ2=2.124G/G10.35P>0.05ControlC/C5858.14C/G65.72Χ2=0.154G/G00.14P>0.05五.PTEN-9C/G多态位点的基因型分布Table2.PTEN-9C/GGenotype38GroupEMSControlΧ2POR(95%CI)C/C76(88.4)58(90.6)
C/G9(10.4)6(9.4)
G/G1(1.2)0(0.0)
C/G+G/G10(11.6)6(9.4)0.1950.658
0.7862(0.7044-5.9662)
六.PTEN-9C/G基因型分布与EMs的发病风险GroupEMSControlΧ2POR(95%CI)C/C39
GroupEMSControlΧ2
POR(95%CI)-/-10(11.6)
7(10.9)
-/+72(83.7)
47(73.5)
+/+4(4.7)
10(15.6)5.2390.073a
(-/-)+(-/+)82(95.3)54(84.4)5.220.02b
3.796(1.1328-12.7227)
七.PTENIVS4-/+基因型分布与EMs的发病风险EMSControlΧ2POR(95%CI)-/-40
EMS,n(%)Control,n(%)OR(95%CI)Χ2
P-valuea-9C/IVS4+71(41.28)62(48.44)1.00(reference)
-9C/IVS4-90(52.33)60(46.88)0.7634(1.2787-3.2865)1.2580.262-9G/IVS4+9(5.23)5(3.90)0.6362(0.6523-6.4426)0.6070.312-9G/IVS4-2(1.16)1(0.78)0.5726(0.1815-23.1593)
0.2080.555八.PTEN单体型与EMs的发病风险EMS,n(%)Control,n(%)OR(941讨论讨论42
一.研究对象的一般特征
1.平均年龄EMS组:35.4±7.69岁
对照组:35.6±12.24两组比较,平均年龄差异无统计学意义(t=0.122,P>0.05)说明病例组与对照组年龄分布具有可比性。
一.研究对象的一般特征432.家族史阳性家族史,EMs组为24.4%,对照组为10.9%,两者相比有统计学意义(χ2=4.392,P<0.05)。OR值2.6308(95%CI=0.8117-5.1771),说明EMs阳性家族史明显增加EMs的发病风险。
进一步证实了EMs的家族遗传倾向。2.家族史44
二.分析PTEN基因-9C/GSNP及IVS4-/+基因型及等位基因频率分布情况本研究中PTEN-9C/GSNP的基因型分布在EMs病例组及对照组中均符合Hardy-Weinbery平衡,表明研究对象具有群体代表性。
二.分析PTEN基因-9C/GSNP及IVS4-45PTENIVS4-/+基因型分布在EMs病例组及对照组中均不符合Hardy-Weinbery平衡,可能的原因有:突变、选择、随机遗传漂变、迁移及遗传异质性。PTENIVS4-/+基因型分布在EMs病例组及对照组46本研究人群中,PTENIVS4-/+杂合型(73.5%)明显高于另两种类型(-/-10.9%,+/+15.6%),这是Hardy-Weinbery平衡计算中影响其遗传平衡的主要因素,可能跟遗传选择中的杂合子优势有关,具体原因有待进一步研究。本研究人群中,PTENIVS4-/+杂合型(73.5%47
本研究对照组中-9C/GSNP的基因型分布(C/C90.6%、C/G9.4%、G/G0.0%)与日本人群(C/C95.0%,C/G5.0%,G/G0%)相似;而IVS4-/+多态的基因型分布(-/-10.9%、-/+73.5%、+/+15.6%)与美国人群(-/-43.1%,-/+45.7%,+/+11.2%)有显著差别。
本研究对照组中-9C/GSNP的基因型分布(C/C48
在不同种族不同地区人群中PTEN基因的多态性可能分布相似或存在差异。在不同种族不同地区人群中PTEN基因的多态性可能分布相似49三.分析PTEN-9C/G基因型分布与EMS发病风险
合并PTEN-9C/G及G/G基因型与C/C基因型相比,携带G等位基因(C/G+G/G)不改变EMs的发病风险,与张小爱及Ge等分别在PTEN-9C/G多态性与鼻咽癌及食道癌中的研究结果一样。三.分析PTEN-9C/G基因型分布与EMS发病风险50
位于PTEN非编码区的-9C→G多态性改变可能不改变抑癌基因PTEN的功能,不增加EMs的发病风险。位于PTEN非编码区的-9C→G多态性改变可能不改变抑51四.分析PTENIVS4-/+基因型分布与EMs的发病风险
在合并PTENIVS4基因-/+和-/-后与+/+相比,病例组与对照组差异有统计学意义(P<0.05)。
四.分析PTENIVS4-/+基因型分布与EMs52
PTENⅣS4基因多态性中,突变型(+/+)可能降低EMs的发病风险。这与ⅣS4+/+基因型降低食管癌的发病风险的报道一致,但与IVS4+/+基因型可增加较年轻者患乳腺癌的风险的报道不同。PTENⅣS4基因多态性中,突变型(+/+)可能降低E53
在不同类型肿瘤中,PTENⅣS4多态性发挥不同的作用,同时也存在不同人群中这一多态存在着对肿瘤易感性的差异的可能性。因此有必要在某一确定的人群中进行不同类型疾病的研究,来评价PTENⅣS4多态性的作用。在不同类型肿瘤中,PTENⅣS4多态性发挥不同的作54
五.分析PTEN单体型与EMs的发病风险
在PTEN-9C/G和IVS4-/+构成的单体中:-9C/IVS4-为EMs病例组中最常见
-9C/IVS4+为对照组中最常见
五.分析PTEN单体型与EMs的发病风险55与对照组中最常见的单体型-9C/IVS4+相比:
-9C/IVS4-、-9G/IVS4+、-9G/IVS4-三种单体型在EMs组及对照组中的分布无统计学差异;也均不增加EMs的发病风险。这与Ge等的研究结论(-9C/IVS4-单体型增加食管癌的发病风险)结果不同。与对照组中最常见的单体型-9C/IVS4+相比:56
PTEN-9C/G和IVS4-/+这两个多态位点构成的单体型中,是否可能通过相互连锁,共同影响对肿瘤及EMs的易感性,需要进一步扩大样本量并通过单体型-表型的关系来阐明。PTEN-9C/G和IVS4-/+这两个多态位点构成的57结论结论58
1.EMs家族史明显增加EMs的发病风险。2.与PTEN-9C/C基因型相比,携带G等位基因(即C/G/+G/G基因型)不影响EMs的发病风险。1.EMs家族史明显增加EMs的发病风593.PTENIVS4+/+基因型可以降低EMs的发病风险,是EMs发生的保护性因素。4.与-9C/IVS4+单体型相比:-9C/IVS4-、-9G/IVS4-、-9G/IVS4+单体型不影响EMs的发病风险。3.PTENIVS4+/+基因型可以降低EMs的发病风60致谢
首先,感谢我的导师王红静教授!在王教授的倾力支持和严格要求下,本课题得以顺利完成。导师无论在课题确定、实验设计还是论文撰写上都倾注了大量心血,特别是对我科研思维、科研实践能力的全面培养将使我受益终身。导师敏锐的科研思维、严谨的治学态度、忘我的工作作风以及宽厚善良的品德是我工作和学习的楷模。在此,谨向我的导师王红静老师致以我最诚挚的敬意和最衷心的感谢。衷心感谢王平教授、何跃东副教授、师弟贾西彪、景彩霞硕士、检验科李文胜老师、杨琴硕士、杨堃硕士、方堃硕士、谢聪硕士、何蕾硕士等在学习和实验过程中的大力支持和帮助!衷心感谢各位论文评阅老师、答辩主席、各位答辩委员在论文的评阅及答辩过程中付出的辛勤劳动!感谢我的亲人对我学习的全力支持,感谢他们在我学习生活中所做出的牺牲,以及他们给予我的关心、理解、支持与帮助!致谢首先,感谢我的导师王红静教授!在王61谢谢各位老师指导谢谢各位老师指导62导师:王红静教授研究生:张晓燕PTEN基因多态性与子宫内膜异位症的相关性研究导师:王红静教授PTEN基因多态性与子宫研究背景研究背景64
子宫内膜异位症(endometriosis,EMs),是妇科常见疾病之一,组织学上虽然是良性的,但却有增生、浸润、转移及复发等恶性生物学行为。药物及手术治疗复发率均高。究其原因主要是EMs的病因及发病机制尚未完全明了。子宫内膜异位症(endometri65
自1921年Sampson首先提出子宫内膜种植学说以来,在EMs众多的病因及发病机制中,种植学说虽被大多数学者所接受,但它无法解释盆腔外EMs的发生,也无法解释多数育龄妇女存在经血逆流,但仅少数(10%-15%)发病。自1921年Sampson首先提出子宫内膜种66
越来越多的研究表明EMs与高血压、糖尿病、精神分裂症等一大类疾病一样被认为受多基因遗传及多因素的影响。现今的研究表明,子宫内膜碎片必须通过粘附、侵袭及血管形成,方可以生存、生长。这一过程的完成是由在位内膜的不同生物学特征,即基因差异决定的。越来越多的研究表明EMs与高血压、糖尿病、精神分裂症67因此,当前的研究重点在于寻找和鉴定EMs相关的遗传基因。因此,当前的研究重点在于寻找和鉴定EMs相关的遗传基68
PTEN(phosphataseandtensinhomologydeletedonchromosometen,PTEN)是1997年发现的一种新的抑癌基因,是继P53基因之后发现的在人类肿瘤中突变率最高的基因。也是子宫内膜腺癌中发现的突变率最高的基因,被认为是子宫内膜的“看家基因”
。研究发现PTEN与子宫内膜相关性疾病如EMs的发病密切相关。
PTEN(phosphataseandtensi69PTEN通过调控细胞周期,抑制细胞分化,抑制细胞粘附和迁移,诱导凋亡等参与肿瘤的发生、发展。内异症患者在位内膜可能因抑癌基因PTEN失活而表现出与正常内膜不同的生物学特性,如细胞粘附增强,凋亡减少,血管形成能力增强,从而容易在异位部位存活并生长,继而引起相应的症状和体征。PTEN通过调控细胞周期,抑制细胞分化,抑制细胞粘附和70PTEN基因突变、杂合性缺失及多态性改变与多种肿瘤如食道癌、膀胱癌等的发病密切相关。其基因突变、杂合性缺失与EMS的相关性研究报道也较多,而PTEN多态性与EMS的相关性研究才处于探索阶段。PTEN基因突变、杂合性缺失及多态性71PTEN-9C/G(以下简读为-9C/G)单核苷酸多态性(SNP)及PTENⅣS4-/+(以下简读为IVS4-/+)为PTEN基因最常见的两个多态性位点,此两个位点多态性的改变与食道癌、鼻咽癌的相关性研究已见报道。国内外目前尚无此两个位点多态性的改变与EMs的相关性研究报道。PTEN-9C/G(以下简读为-9C/G)单核苷酸多态性(72
PTEN-9C/GSNP位于PTEN翻译起始点上游的第9位核苷酸处,C→G的替换使得G周期性地出现,它非常接近翻译时使核糖体停留在阅读框架内的交感序列,因此C→G的替换可能影响PTEN的表达。
PTENⅣS4-/+为第4内含子的一个插入性多态,可能通过不同剪切及通过与其它位点连锁来影响其基因表达。PTEN-9C/GSNP位于PTEN翻译起始点上游的73本研究首次采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP)技术对PTEN-9C/G及IVS4-/+基因进行分型,旨在探讨此两个位点的多态性与EMs
的关系。本研究首次采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(po74材料与方法材料与方法75
主要实验仪器及设备
名称型号生产厂家洁净工作台上海力申科学仪器有限公司高速离心机TG19A.WS美国BECKMAN公司低温离心机TGL-16H珠海黑马医学仪器有限公司普通冰箱
BCD-130H青岛海尔股份有限公司电子天平PB3002-S瑞士Mettler公司PCR扩增仪PTC一200美国MJReseareh公司Eppendorf移液器0.1-1000ul德国Eppendorf公司紫外扫描仪GelDoe1000美国BioRad公司稳压稳流电泳仪DYY-III3北京市六一仪器厂电泳槽Sub一Cell@Model96美国BioRad公司凝胶成像分析仪AlphaImagerTM2200美国AlphaInnotech公司
主要实验仪器及设备76主要实验试剂试剂名称生产厂商全血基因组DNA提取试剂盒北京博大泰克公司引物合成上海生工DNA胶回收试剂盒北京博大泰克公司PCR纯化试剂盒上海生工蛋白酶K(Germany)Merck公司限制性内切酶AflIINewEnglandBiolabs限制性内切酶DraIINewEnglandBiolabs100bpDNAladder华美生物工程公司主要实验试剂研究对象
EMs组:86人,无肿瘤性及遗传性疾病病史,术后病检证实为子宫内膜异位症的患者。对照组:64人,同期因输卵管阻塞继发不孕、宫外孕及子宫脱垂等手术,术后病检排除EMs,且无肿瘤性及遗传性疾病病史的患者。研究对象EMs组:86人,无肿78
标本采集
采集每位研究个体的外周血3ml,EDTA抗凝,置4℃冰箱保存,并于采血后1周内提取符合条件的研究对象的外周血白细胞DNA。标本采集采集每位研究个体的外周血3ml79实验方法微量全血基因组DNA提取试剂盒,提取全基因组DNA聚合酶链反应-限制性片段长度多多态性(PCR-RFLP)技术,扩增-9C/G和IVS4-/+多态位点的基因片段
分别PCR-AflII、PCR-DraII酶切消化后行基因分型
实验方法微量全血基因组80DNA的提取
用微量全血基因组DNA提取试剂盒,提取全基因组DNA。DNA的提取
用微量全血基因组DNA提取试81100μl裂解液20μlRNaseA/蛋白酶K
,55℃温浴30min
12000rpm离心1min,弃尽上清
,100μlTE10000rpm离心1.5min,弃上清,300μl红细胞裂解液300μl抗凝全血等体积红细胞裂解液加入10μl3MnaAC、1250μl结合缓冲液加入600μl漂洗液加入30μlddH2O洗脱,-20℃保存24小时将所提DNA进行Agarose电泳泳100μl裂解液10000rpm离心1.5min,300μ82
PTEN的基因分型
采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法进行基因分型。PTEN的基因分型采用聚合酶链反应-限制性83PTENIVS4-/+引物:上游引物:5'-GGGGGTGATAACAGTATCTA-3'下游引物:5'-CTTTATGCAATACTTTTTCCTA-3'PTENIVS4-/+引物:84dNTPs5μl
10XBuffer5μl
MgSO42μl
上下游引物各2μl
模板DNA100ng(1μl)
KOD-Plus1μl
ddH2O32μl
PCR反应体系dNTPs10XBufferMgSO4上下游引物模板8572℃延伸1min
58℃退火45s
94℃变性30s
94℃预变性5min
35个循环后,72℃继续延伸5min
PCR反应条件扩增产物为403bp
72℃延伸1min58℃退火45s94℃变性30s9486PTENIVS4-/+PCR产物酶切电泳后判断基因型
纯化PCR产物10μl经限制性内切酶AflII(2μl)
于37℃酶切过夜
行2.5%琼脂糖凝胶电泳
凝胶成像仪下观察判断基因型
-/-纯合型显示403bp一条电泳带,+/+纯合型显示335bp和73bp两条电泳带,-/+杂合型显示403bp、335bp和73bp三条电泳带
PTENIVS4-/+PCR产物酶切电泳后判断基因型纯87
PTEN-9C/G引物为:上游引物:5'-GCAGCCGTTCGGAGGATT-3'下游引物:5'-GCCGCAGAA,ATGGATACAGG-3'PTEN-9C/G引物为:88
PTEN-9C/GPCR反应体系及反应条件同扩增PTENIVS4-/+。PTEN-9C/GPCR反应体系及反应条件同扩增PT89PTEN-9C/GPCR产物酶切电泳后判断基因型
纯化PCR产物10μl经限制性内切酶DraII(10μl)
于37℃酶切过夜
行2.5%琼脂糖凝胶电泳
凝胶成像仪下观察判断基因型
C/C纯合型显示371bp的一条电泳带G/G纯合型显示266bp和105bp两条电泳带C/G杂合型显示371bp、266bp和105bp三条电泳带PTEN-9C/GPCR产物酶切电泳后判断基因型纯化90
统计学分析
数据用SPSS13.0软件进行统计学分析,P<0.05认为有统计学意义。
比较基因型频率的观察值与预期值,并进行卡方检验行Hardy-Weinberg平衡分析。病例组与对照组的基因型及等位基因分布采用卡方检验,用OR值及其95%可信区间,分析PTEN-9C/G、IVS4-/+多态性与EMs的关系。统计学分析数据用SPSS13.0软件91结果结果92
一.研究对象的一般特征:
1.平均年龄EMS组:35.4±7.69岁
对照组:35.6±12.24岁两组比较,平均年龄差异无统计学意义(t=0.122,P>0.05)一.研究对象的一般特征:932.家族史
EMs阳性家族史,
EMs组为24.4%,对照组仅10.9%,两者相比有统计学意义(χ2=4.392,P<0.05)。
EMs阳性家族史明显增加EMs的发病风险,OR值2.6308(95%CI=0.8117-5.1771)。2.家族史94二.PTEN基因ⅣS4-/+扩增产物AflⅡ酶切电泳结果
PTENⅣS4-/-纯合型产生403bp
一条电泳带PTENⅣS4+/+纯合型产生335bp和73bp两条电泳带PTENⅣS4-/+杂合型产生403b、335bp、73bp三条电泳带二.PTEN基因ⅣS4-/+扩增产物AflⅡ酶切电泳结果95
Fig.1GenotypepatternforPTENIVS4(-/+)polymorphismanalyzedbyPCR-AflIIdigestion.Lane1:+/+homozygousgenotype,Lane2:-/-homozygousgenotype,Lane3,4,5,and6:-/+heterozygousgenotype,
基因多态性与子宫内膜异位症的相关性研究课件96
三.
PTEN基因-9C/G扩增产物DraII酶切电泳结果:C/C纯合型产生371bp的一条电泳带G/G纯合型产生266bp和105bp两条电泳带C/G杂合型产生371bp、266bp和105bp三条电泳带
三.PTEN基因-9C/G扩增产物DraII酶切电97Fig.2GenotypepatternforPTEN-9C/GpolymorphismanalyzedbyPCR-DraIIdigestion.Lane1,4and6:C/Gheterozygousgenotype,Lane2and3:G/Ghomozygousgenotype,Lane5:C/Chomozygousgenotype.
Fig.2GenotypepatternforPTE98GenotypeObservedExpectedΧ2andPEMs-/-1024.61-/+7242.79Χ2=32.25+/+418.60P<0.05Control-/-714.54
-/+4731.93Χ2=14.25+/+1017.53P<0.05四.PTENIVS4-/+多态位点的基因型分布GenotypeObservedExpectedΧ2and99
Table2.PTEN-9C/GGenotypeHardy-WeinberyexaminationintwoGroupsGenotypeObservedExpectedΧ2andPEmsC/C7675.34C/G910.30Χ2=2.124G/G10.35P>0.05ControlC/C5858.14C/G65.72Χ2=0.154G/G00.14P>0.05五.PTEN-9C/G多态位点的基因型分布Table2.PTEN-9C/GGenotype100GroupEMSControlΧ2POR(95%CI)C/C76(88.4)58(90.6)
C/G9(10.4)6(9.4)
G/G1(1.2)0(0.0)
C/G+G/G10(11.6)6(9.4)0.1950.658
0.7862(0.7044-5.9662)
六.PTEN-9C/G基因型分布与EMs的发病风险GroupEMSControlΧ2POR(95%CI)C/C101
GroupEMSControlΧ2
POR(95%CI)-/-10(11.6)
7(10.9)
-/+72(83.7)
47(73.5)
+/+4(4.7)
10(15.6)5.2390.073a
(-/-)+(-/+)82(95.3)54(84.4)5.220.02b
3.796(1.1328-12.7227)
七.PTENIVS4-/+基因型分布与EMs的发病风险EMSControlΧ2POR(95%CI)-/-102
EMS,n(%)Control,n(%)OR(95%CI)Χ2
P-valuea-9C/IVS4+71(41.28)62(48.44)1.00(reference)
-9C/IVS4-90(52.33)60(46.88)0.7634(1.2787-3.2865)1.2580.262-9G/IVS4+9(5.23)5(3.90)0.6362(0.6523-6.4426)0.6070.312-9G/IVS4-2(1.16)1(0.78)0.5726(0.1815-23.1593)
0.2080.555八.PTEN单体型与EMs的发病风险EMS,n(%)Control,n(%)OR(9103讨论讨论104
一.研究对象的一般特征
1.平均年龄EMS组:35.4±7.69岁
对照组:35.6±12.24两组比较,平均年龄差异无统计学意义(t=0.122,P>0.05)说明病例组与对照组年龄分布具有可比性。
一.研究对象的一般特征1052.家族史阳性家族史,EMs组为24.4%,对照组为10.9%,两者相比有统计学意义(χ2=4.392,P<0.05)。OR值2.6308(95%CI=0.8117-5.1771),说明EMs阳性家族史明显增加EMs的发病风险。
进一步证实了EMs的家族遗传倾向。2.家族史106
二.分析PTEN基因-9C/GSNP及IVS4-/+基因型及等位基因频率分布情况本研究中PTEN-9C/GSNP的基因型分布在EMs病例组及对照组中均符合Hardy-Weinbery平衡,表明研究对象具有群体代表性。
二.分析PTEN基因-9C/GSNP及IVS4-107PTENIVS4-/+基因型分布在EMs病例组及对照组中均不符合Hardy-Weinbery平衡,可能的原因有:突变、选择、随机遗传漂变、迁移及遗传异质性。PTENIVS4-/+基因型分布在EMs病例组及对照组108本研究人群中,PTENIVS4-/+杂合型(73.5%)明显高于另两种类型(-/-10.9%,+/+15.6%),这是Hardy-Weinbery平衡计算中影响其遗传平衡的主要因素,可能跟遗传选择中的杂合子优势有关,具体原因有待进一步研究。本研究人群中,PTENIVS4-/+杂合型(73.5%109
本研究对照组中-9C/GSNP的基因型分布(C/C90.6%、C/G9.4%、G/G0.
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