基因功能研究2RNi+Yeast课件

教师：王华单位：吉林大学基础医学院分子生物学教研室电话：85619369(L)

E-mail:wanghua1973@Strategiesforanalyzinggenefunction基因功能的鉴定技术之二教师：王华电话：85619369(L)Strategie在mRNA水平上RNA干涉反义RNA在基因水平上基因敲除技术转基因技术在蛋白质水平上酵母双杂交技术基因功能的研究是21世纪生命科学研究的重点之一，希望能发现更多的功能基因造福于人类。基因功能的鉴定技术之二在mRNA水平上RNA干涉反义RNA在基因水平上基因敲除技术反义RNA（anti-senseRNA）能与mRNA互补的RNA链,称作反义RNA.反义技术的应用实例：用BCL-2Anti-senseoligonucleotide,通过与细胞内特定mRNA互补，封闭特定基因的表达，达到治疗疾病的目的。治疗B淋巴瘤和白血病。BCL-2癌基因第三节通过封闭mRNA，而使基因功能失活反义RNA（anti-senseRNA）能与mRNA互补的美国科学家安德鲁·法尔(左)和克雷格·梅洛(右)：发现了ＲＮＡ干扰机制。2006年AndrewZ.FireStanfordUniversitySchoolofMedicineCraigC.MelloUniversityofMassachusettsMedicalSchool第四节RNA干涉（RNAinterference,RNAi）美国科学家安德鲁·法尔(左)和克雷格·梅洛(右)：发现了ＲＮ问:你知道最早发现RNAi现象是在什么情况下吗？1995年，康奈尔大学SuGou博士的实验：用反义RNA(anti-senseRNA)转染线虫可以阻断par-1基因的表达；在正义RNA(senseRNA)的对照组中也出现了基因受抑现象。Larva:幼虫Moult:脱毛

线虫的优点：1.可用大肠杆菌饲喂2.about1000cells,3.基因组小(100Mbp)4.在生活史的各阶段皆透明

5.3.5天一代.Hatch:孵化提示:一些实验现象可能是当时知识背景下所不能认识的，但客观地呈现这些实验现象是非常重要的。许多科学的重大发现都源于意外的实验现象诸如：RNAi现象青霉素——霉菌，抑菌环葡萄酒——葡萄变“坏”伟哥——心肠变硬的药，提高性欲，治疗冠心病纯化抗体——杂蛋白吸附到介质上（pH值的变化）

Why？该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。

一、RNAi的历史问:1995年，Larva:幼虫线虫的优点：Hatc（1）用纯化后的单链RNA注射线虫，基因抑制现象是非常微弱的！（2）将双链RNA给线虫注射，出现了高效、特异性的基因抑制效应。（3）SuGuo博士在转染正义RNA时污染了微量反义RNA，“十分错误”地将双链RNA(dsRNA)导入了细胞。AndrewZ.FireStanfordUniversitySchoolofMedicineCraigC.MelloUniversityofMassachusettsMedicalSchool1998年:Fire和Mello的实验揭开这个悬疑之谜：他们将这种由双链RNA引起的特异性基因抑制现象，称作RNA干涉（RNAi）。Fire,A.etal.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans.Nature391,806-811.(1998)进一步的研究发现：（1）RNAi的活性可以远程表现（2）RNAi的作用可传给后代☆在C.elegans应用双链RNA的途径：（1）直接注射到肠道（2）饲喂（3）浸泡例如：GFP转基因植物的叶子:从叶片的一端注射GFPsiRNA,可干扰整个叶片GFP的表达。RNAi广泛存在于自然界（1）用纯化后的单链RNA注射线虫，基因抑制现象是非常微弱的想想：

由于antisense-RNA的原因,在细胞内出现dsRNA正常吗？细胞内是否存在特异性降解dsRNA的机制？Dicer负责识别并切割dsRNARNaseⅢ家族中成员识别、降解双链RNA产生约21~23nt

bp片段每个片段3端有2个碱基突出二、RNA干涉（RNAi）的机理想想：Dicer负责识别并切割dsRNARNaseⅢ家族活化阶段：siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。RISC中的解旋酶将其中的siRNA变成单链,成为activatedRISC。Longdouble-strandedRNAs(dsRNAs;typically>200nt)canbeusedtosilencetheexpressionoftargetgenesinavarietyoforganismsandcelltypes(e.g.,worms,fruitflies,andplants).Uponintroduction,thelongdsRNAsenteracellularpathwaythatiscommonlyreferredtoastheRNAinterference(RNAi)pathway.First,thedsRNAsgetprocessedinto20-25nucleotide(nt)smallinterferingRNAs(siRNAs)byanRNaseIII-likeenzymecalledDicer(initiationstep).Then,thesiRNAsassembleintoendoribonuclease-containingcomplexesknownasRNA-inducedsilencingcomplexes(RISCs),unwindingintheprocess.ThesiRNAstrandssubsequentlyguidetheRISCstocomplementaryRNAmolecules,wheretheycleaveanddestroythecognateRNA(effecterstep).CleavageofcognateRNAtakesplacenearthemiddleoftheregionboundbythesiRNAstrand.Inmammaliancells,introductionoflongdsRNA(>30

nt)initiatesapotentantiviralresponse,exemplifiedbynonspecificinhibitionofproteinsynthesisandRNAdegradation.Themammalianantiviralresponsecanbebypassed,however,bytheintroductionorexpressionofsiRNAs.

效应阶段：ActivatedRISC与靶mRNA结合，利用自身核酸内切酶活性在距离siRNA3’端12个碱基的位置将mRNA切断、降解靶mRNA。起始阶段：异常dsRNA被细胞内的Dicer酶特异识别、切割成长21~23nt的短双链RNA，称为小干扰性RNA（smallinterferingRNA,siRNA）。ViralRNAViralRNAdsRNA激活Dicer，降解具有互补序列的外源RNA或细胞RNA。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA；RISC中的siRNA与靶RNA结合时还可作为引物，并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP)作用下，合成更多新的dsRNA；新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。二、RNA干涉（RNAi）的机理*RNA干扰过程主要有3个步骤：活化阶段：siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称三、RNAi技术利用短双链RNA

(siRNA)

能启动特定mRNA降解的特性，将人工设计的

siRNA

导入靶细胞中，启动RNAi，从而诱导特定mRNA降解，抑制特定基因表达的技术。*三、RNAi技术利用短双链RNA(siRNA)能启确定目的基因设计SiRNA

序列化学合成或体外转录在体外，获得

SiRNA构建SiRNA表达载体转染细胞转染细胞细胞内表达SiRNARNAi效果检测如何开展RNAi实验？确定目的基因设计SiRNA序列化学合成或体外转录在体外，构建SiRNA表达载体,在细胞内转录RNApolⅢ启动子(U6)可以在哺乳动物细胞中表达小分子RNA。BamHIHindIIII将重组质粒转染细胞，在细胞内，转录产生发夹siRNAUU3’5’UUCAAGAGALoopSensestrandAntisensestrand19nt了解构建SiRNA表达载体,在细胞内转录RNApolⅢ启动子UUSiRNADicerRNaseIIIA.TransfectionABCTargetingmRNAcleavagesuppressionSiRNADSiRNA如何开展RNAi实验？UUSiRNADicerA.TransfectionABC四、SiRNA的设计原则：随机选取不考虑位点信息脱靶效应严重NCBI软件生物信息分析具有最小脱靶效应的功能性siRNA避开起始100bpAA（N19）TTGC含量BLAST检索….大量筛选了解四、SiRNA的设计原则：随机选取NCBI五、RNAi技术的应用

1)研究基因的功能用RNAi来抑制癌基因的表达，进而抑制肿瘤的生长。肿瘤细胞2)封闭有害基因的表达：抗肿瘤、抗病毒缩短人类对基因功能的认识时间CD4

siRNA封闭受体，使HIV不易进入宿主细胞。p24siRNA

抑制HIV蛋白质的合成和HIV的复制。五、RNAi技术的应用1)研究基因的功能用R六、RNAi技术优点RNAi(knockdown)VS同源重组(knockout)高效率易于操纵可实现多种基因突变六、RNAi技术优点RNAi(knockdown)VRNA干扰(RNAinterference,RNAi)*

是由短双链RNA（double-strandedRNA，SiRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。

其抑制基因表达的效率比反义RNA至少高2个数量级。mRNAsiRNAsiRNA是可以反复利用的!通过封闭mRNA反推基因的功能Summary:Post-transcriptionalgenesilencing，PTGS相关技术：Anti-senseRNARNAi橙色：解旋酶绿色：内切酶

由于使用RNAi技术可以特异性关闭特定基因的表达，所以已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗。RNA干扰(RNAinterference,基因功能研究的策略在mRNA水平上RNA干涉反义RNA在基因水平上基因敲除技术转基因技术在蛋白质水平上酵母双杂交技术基因功能的研究是21世纪生命科学研究的重点之一，希望能发现更多的功能基因造福于人类。基因功能研究的策略在mRNA水平上RNA干涉反义RNA在基第五节酵母双杂交（Yeast-Two-Hybrid）转录激活因子（TAF=BD+AD）ActivationdomainBD(AD)DNAbindingdomain(BD)回忆：转录激活因子的结构特征AD的作用：促进基因转录两个结构域是转录激活因子发挥活性所必需的，缺一不可。一、原理第五节酵母双杂交（Yeast-Two-Hybrid）转1.两个结构域分别与两个蛋白融合，各自均没有转录激活因子的活性第五节酵母双杂交（Yeast-Two-Hybrid）一、原理1.两个结构域分别与两个蛋白融合，各自均没有转录激活因子的2.BD和AD空间位置靠近，可以恢复TAF的作用：BDADBD-融合蛋白(诱饵)AD-融合蛋白(待测)两个蛋白相互作用使BD和AD空间位置靠近一、原理2.BD和AD空间位置靠近，可以恢复TAF的作用：BDAD酵母双杂交（Yeast-Two-Hybrid）在真核模式生物酵母中，利用蛋白质-蛋白质相互作用来激活报告基因的转录激活因子，并以报告基因表达产物作为检测信号来检测蛋白质间是否发生了相互作用的技术方法。体内(活细胞内)检测；敏感方法。报告基因转录酵母双杂交（Yeast-Two-Hybrid）在真核模式生物二、酵母双杂交实验是如何进行的：二、酵母双杂交实验是如何进行的：BD

MCSP

BDvectorligationligationTransformationTransformation1、构建两种酵母表达载体AD

MCSP

ADvector已知基因：baitcDNA文库基因：FishexpressGAL4-BD-已知蛋白.selectedonTrpdeficientmedia.色氨酸expressGAL4-AD-Fishprotein.selectedonLeudeficientmedia.LeucineBDMCSPBDvectorligationligatMatingplatingTransformationTransformation交配2、将两种载体放到一个酵母细胞中selectedonTrpdeficientmedia.selectedonLeudeficientmedia.只有共转化成功的酵母菌才能在Trp

&Leudeficient的培养基上生长！BD

MCSP

BDvectorligationligationAD

MCSP

ADvector已知基因：bait未知基因：FishexpressGAL4-BD-已知蛋白.expressGAL4-AD-Fishprotein.MatingplatingTransformation3、筛选发生了蛋白质-蛋白质相互作用的酵母株报告基因----LacZ

基因和His基因的转录激活因子都是GAL4，即启动子上都有GAL4的bindingsite

。但启动子序列除了GAL4bindingsite相同外，其余序列完全不同。HistidineOnlyyeastcellsexpressinginteractingproteinsurvive.

LacZ表达产物检测：使底物X-GAL显蓝色营养代谢有关基因表达产物检测：HIS基因的表达可以使酵母细胞在相应的营养物质缺乏的平板上生长lacZGAL4-bindingsiteHis3PromoterReportorGene

酵母菌株Auxotrophic具有报告基因：LacZ和His。3、筛选发生了蛋白质-蛋白质相互作用的酵母株报告基因----4、分析Fish对AD-fish质粒进行DNA测序、在cDNA数据库中进行同源性比较分析，确定fish确定这些发生了相互作用的蛋白质中，哪些是目前未知的fish！4、分析Fish对AD-fish质粒进行DNA测序、酵母双杂交技术的基本过程fish酵母双杂交技术的基本过程fish三、酵母双杂交系统的应用1、筛选与已知蛋白质相互作用的未知蛋白，并确定其编码基因2、检测已知蛋白质间的相互作用的结构域及氨基酸序列通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸。三、酵母双杂交系统的应用1、筛选与已知蛋白质相互作用的未知拓展知识拓展知识是细胞内的一类非编码小分子RNA(22nt±)细胞内有microRNA(miRNA)miRNAgene-----Pre-microRNA(具有颈环结构的ssRNA，约70nt）-----运输到细胞质-被Dicer切割miRNA控制着几乎每一个人类基因的活动。拓展知识1miRNA与siRNA之间有许多相同之处：1.二者的长度都约在22nt左右。2.二者都依赖Dicer酶的加工,都是由双链RNA或RNA前体形成的。3.

二者都是RISC组分，microRNA也可以引起mRNA降解。是细胞内的一类非编码小分子RNA(22nt±)细胞内有mi

micro-RNA的形成及作用机制micro-RNA的形成及作用机制RNA干扰机制示意图翻译抑制（不完全匹配）剪切目的mRNA（完全匹配）RNA干扰机制示意图翻译抑制（不完全匹配）剪切目的mRNA1.根本区别是miRNA是内源的，调节基因表达,是生物所固有的；

而siRNA是人工体外合成的，通过转染进入人体内，是RNA干涉的中间产物。正常情况下只有在病毒或其它dsRNA诱导情况下才产生siRNA，作为miRNA的完善和补充。2.在作用位置上：miRNA主要作用于靶标基因3′-UTR区，可抑制靶标基因的翻译，也可以导致靶标基因降解;而siRNA可作用于mRNA的任何部位，只能导致靶标基因降解。miRNA与siRNA的区别：1.根本区别是miRNA是内源的，调节基因表达,是生物所固问：RNAi为什么可能存在在脱靶(off-targeting)效应？拓展知识2•1.正义链与RISC结合问：RNAi为什么可能存在在脱靶(off-targetin•解决办法：链偏好性（Strandbias）使RISC只结合SiRNA的反义链。•解决办法：链偏好性（Strandbias）使RISC只结2.miRNA-likepathway：Off-targetsilencingviaseed-regionactivity2.miRNA-likepathway：Off-targ基因功能研究2RNi+Yeast课件难点：RNi的机理、酵母双杂交的基本程序【重点内容】二、机理*一、定义

*三、生物学意义*第三节RNi第四节酵母双杂交二、原理*一、定义

*三、基本程序难点：RNi的机理、酵母双杂交的基本程序【重点内容】二、机理【课后思考】miRNA的检测在乳腺癌或胃肠癌的诊断或用药指导方面的应用。【课后思考】miRNA的检测在乳腺癌或胃肠癌的诊断或用药指导教师：王华单位：吉林大学基础医学院分子生物学教研室电话：85619369(L)

E-mail:wanghua1973@Strategiesforanalyzinggenefunction基因功能的鉴定技术之二教师：王华电话：85619369(L)Strategie在mRNA水平上RNA干涉反义RNA在基因水平上基因敲除技术转基因技术在蛋白质水平上酵母双杂交技术基因功能的研究是21世纪生命科学研究的重点之一，希望能发现更多的功能基因造福于人类。基因功能的鉴定技术之二在mRNA水平上RNA干涉反义RNA在基因水平上基因敲除技术反义RNA（anti-senseRNA）能与mRNA互补的RNA链,称作反义RNA.反义技术的应用实例：用BCL-2Anti-senseoligonucleotide,通过与细胞内特定mRNA互补，封闭特定基因的表达，达到治疗疾病的目的。治疗B淋巴瘤和白血病。BCL-2癌基因第三节通过封闭mRNA，而使基因功能失活反义RNA（anti-senseRNA）能与mRNA互补的美国科学家安德鲁·法尔(左)和克雷格·梅洛(右)：发现了ＲＮＡ干扰机制。2006年AndrewZ.FireStanfordUniversitySchoolofMedicineCraigC.MelloUniversityofMassachusettsMedicalSchool第四节RNA干涉（RNAinterference,RNAi）美国科学家安德鲁·法尔(左)和克雷格·梅洛(右)：发现了ＲＮ问:你知道最早发现RNAi现象是在什么情况下吗？1995年，康奈尔大学SuGou博士的实验：用反义RNA(anti-senseRNA)转染线虫可以阻断par-1基因的表达；在正义RNA(senseRNA)的对照组中也出现了基因受抑现象。Larva:幼虫Moult:脱毛

线虫的优点：1.可用大肠杆菌饲喂2.about1000cells,3.基因组小(100Mbp)4.在生活史的各阶段皆透明

5.3.5天一代.Hatch:孵化提示:一些实验现象可能是当时知识背景下所不能认识的，但客观地呈现这些实验现象是非常重要的。许多科学的重大发现都源于意外的实验现象诸如：RNAi现象青霉素——霉菌，抑菌环葡萄酒——葡萄变“坏”伟哥——心肠变硬的药，提高性欲，治疗冠心病纯化抗体——杂蛋白吸附到介质上（pH值的变化）

Why？该研究小组一直没能给这个意外以合理解释。

一、RNAi的历史问:1995年，Larva:幼虫线虫的优点：Hatc（1）用纯化后的单链RNA注射线虫，基因抑制现象是非常微弱的！（2）将双链RNA给线虫注射，出现了高效、特异性的基因抑制效应。（3）SuGuo博士在转染正义RNA时污染了微量反义RNA，“十分错误”地将双链RNA(dsRNA)导入了细胞。AndrewZ.FireStanfordUniversitySchoolofMedicineCraigC.MelloUniversityofMassachusettsMedicalSchool1998年:Fire和Mello的实验揭开这个悬疑之谜：他们将这种由双链RNA引起的特异性基因抑制现象，称作RNA干涉（RNAi）。Fire,A.etal.Potentandspecificgeneticinterferencebydouble-strandedRNAinCaenorhabditiselegans.Nature391,806-811.(1998)进一步的研究发现：（1）RNAi的活性可以远程表现（2）RNAi的作用可传给后代☆在C.elegans应用双链RNA的途径：（1）直接注射到肠道（2）饲喂（3）浸泡例如：GFP转基因植物的叶子:从叶片的一端注射GFPsiRNA,可干扰整个叶片GFP的表达。RNAi广泛存在于自然界（1）用纯化后的单链RNA注射线虫，基因抑制现象是非常微弱的想想：

由于antisense-RNA的原因,在细胞内出现dsRNA正常吗？细胞内是否存在特异性降解dsRNA的机制？Dicer负责识别并切割dsRNARNaseⅢ家族中成员识别、降解双链RNA产生约21~23nt

bp片段每个片段3端有2个碱基突出二、RNA干涉（RNAi）的机理想想：Dicer负责识别并切割dsRNARNaseⅢ家族活化阶段：siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称为RNA诱导的沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。RISC中的解旋酶将其中的siRNA变成单链,成为activatedRISC。Longdouble-strandedRNAs(dsRNAs;typically>200nt)canbeusedtosilencetheexpressionoftargetgenesinavarietyoforganismsandcelltypes(e.g.,worms,fruitflies,andplants).Uponintroduction,thelongdsRNAsenteracellularpathwaythatiscommonlyreferredtoastheRNAinterference(RNAi)pathway.First,thedsRNAsgetprocessedinto20-25nucleotide(nt)smallinterferingRNAs(siRNAs)byanRNaseIII-likeenzymecalledDicer(initiationstep).Then,thesiRNAsassembleintoendoribonuclease-containingcomplexesknownasRNA-inducedsilencingcomplexes(RISCs),unwindingintheprocess.ThesiRNAstrandssubsequentlyguidetheRISCstocomplementaryRNAmolecules,wheretheycleaveanddestroythecognateRNA(effecterstep).CleavageofcognateRNAtakesplacenearthemiddleoftheregionboundbythesiRNAstrand.Inmammaliancells,introductionoflongdsRNA(>30

nt)initiatesapotentantiviralresponse,exemplifiedbynonspecificinhibitionofproteinsynthesisandRNAdegradation.Themammalianantiviralresponsecanbebypassed,however,bytheintroductionorexpressionofsiRNAs.

效应阶段：ActivatedRISC与靶mRNA结合，利用自身核酸内切酶活性在距离siRNA3’端12个碱基的位置将mRNA切断、降解靶mRNA。起始阶段：异常dsRNA被细胞内的Dicer酶特异识别、切割成长21~23nt的短双链RNA，称为小干扰性RNA（smallinterferingRNA,siRNA）。ViralRNAViralRNAdsRNA激活Dicer，降解具有互补序列的外源RNA或细胞RNA。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA；RISC中的siRNA与靶RNA结合时还可作为引物，并在RNA聚合酶(RNA-dependentRNApolymerase，RdRP)作用下，合成更多新的dsRNA；新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。二、RNA干涉（RNAi）的机理*RNA干扰过程主要有3个步骤：活化阶段：siRNA与细胞内的某些酶和蛋白质形成复合体，称三、RNAi技术利用短双链RNA

(siRNA)

能启动特定mRNA降解的特性，将人工设计的

siRNA

导入靶细胞中，启动RNAi，从而诱导特定mRNA降解，抑制特定基因表达的技术。*三、RNAi技术利用短双链RNA(siRNA)能启确定目的基因设计SiRNA

序列化学合成或体外转录在体外，获得

SiRNA构建SiRNA表达载体转染细胞转染细胞细胞内表达SiRNARNAi效果检测如何开展RNAi实验？确定目的基因设计SiRNA序列化学合成或体外转录在体外，构建SiRNA表达载体,在细胞内转录RNApolⅢ启动子(U6)可以在哺乳动物细胞中表达小分子RNA。BamHIHindIIII将重组质粒转染细胞，在细胞内，转录产生发夹siRNAUU3’5’UUCAAGAGALoopSensestrandAntisensestrand19nt了解构建SiRNA表达载体,在细胞内转录RNApolⅢ启动子UUSiRNADicerRNaseIIIA.TransfectionABCTargetingmRNAcleavagesuppressionSiRNADSiRNA如何开展RNAi实验？UUSiRNADicerA.TransfectionABC四、SiRNA的设计原则：随机选取不考虑位点信息脱靶效应严重NCBI软件生物信息分析具有最小脱靶效应的功能性siRNA避开起始100bpAA（N19）TTGC含量BLAST检索….大量筛选了解四、SiRNA的设计原则：随机选取NCBI五、RNAi技术的应用

1)研究基因的功能用RNAi来抑制癌基因的表达，进而抑制肿瘤的生长。肿瘤细胞2)封闭有害基因的表达：抗肿瘤、抗病毒缩短人类对基因功能的认识时间CD4

siRNA封闭受体，使HIV不易进入宿主细胞。p24siRNA

抑制HIV蛋白质的合成和HIV的复制。五、RNAi技术的应用1)研究基因的功能用R六、RNAi技术优点RNAi(knockdown)VS同源重组(knockout)高效率易于操纵可实现多种基因突变六、RNAi技术优点RNAi(knockdown)VRNA干扰(RNAinterference,RNAi)*

是由短双链RNA（double-strandedRNA，SiRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。

其抑制基因表达的效率比反义RNA至少高2个数量级。mRNAsiRNAsiRNA是可以反复利用的!通过封闭mRNA反推基因的功能Summary:Post-transcriptionalgenesilencing，PTGS相关技术：Anti-senseRNARNAi橙色：解旋酶绿色：内切酶

由于使用RNAi技术可以特异性关闭特定基因的表达，所以已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗。RNA干扰(RNAinterference,基因功能研究的策略在mRNA水平上RNA干涉反义RNA在基因水平上基因敲除技术转基因技术在蛋白质水平上酵母双杂交技术基因功能的研究是21世纪生命科学研究的重点之一，希望能发现更多的功能基因造福于人类。基因功能研究的策略在mRNA水平上RNA干涉反义RNA在基第五节酵母双杂交（Yeast-Two-Hybrid）转录激活因子（TAF=BD+AD）ActivationdomainBD(AD)DNAbindingdomain(BD)回忆：转录激活因子的结构特征AD的作用：促进基因转录两个结构域是转录激活因子发挥活性所必需的，缺一不可。一、原理第五节酵母双杂交（Yeast-Two-Hybrid）转1.两个结构域分别与两个蛋白融合，各自均没有转录激活因子的活性第五节酵母双杂交（Yeast-Two-Hybrid）一、原理1.两个结构域分别与两个蛋白融合，各自均没有转录激活因子的2.BD和AD空间位置靠近，可以恢复TAF的作用：BDADBD-融合蛋白(诱饵)AD-融合蛋白(待测)两个蛋白相互作用使BD和AD空间位置靠近一、原理2.BD和AD空间位置靠近，可以恢复TAF的作用：BDAD酵母双杂交（Yeast-Two-Hybrid）在真核模式生物酵母中，利用蛋白质-蛋白质相互作用来激活报告基因的转录激活因子，并以报告基因表达产物作为检测信号来检测蛋白质间是否发生了相互作用的技术方法。体内(活细胞内)检测；敏感方法。报告基因转录酵母双杂交（Yeast-Two-Hybrid）在真核模式生物二、酵母双杂交实验是如何进行的：二、酵母双杂交实验是如何进行的：BD

MCSP

BDvectorligationligationTransformationTransformation1、构建两种酵母表达载体AD

MCSP

ADvector已知基因：baitcDNA文库基因：FishexpressGAL4-BD-已知蛋白.selectedonTrpdeficientmedia.色氨酸expressGAL4-AD-Fishprotein.selectedonLeudeficientmedia.LeucineBDMCSPBDvectorligationligatMatingplatingTransformationTransformation交配2、将两种载体放到一个酵母细胞中selectedonTrpdeficientmedia.selectedonLeudeficientmedia.只有共转化成功的酵母菌才能在Trp

&Leudeficient的培养基上生长！BD

MCSP

BDvectorligationligationAD

MCSP

ADvector已知基因：bait未知基因：FishexpressGAL4-BD-已知蛋白.expressGAL4-AD-Fishprotein.MatingplatingTransformation3、筛选发生了蛋白质-蛋白质相互作用的酵母株报告基因----LacZ

基因和His基因的转录激活因子都是GAL4，即启动子上都有GAL4的bindingsite

。但启动子序列除了GAL4bindingsite相同外，其余序列完全不同。HistidineOnlyyeastcellsexpressinginteractingprote