第三紫外可见分光光度法优质课件

第三紫外可见分光光度法第三紫外可见分光光度法1优选第三紫外可见分光光度法优选第三紫外可见分光光度法1.1光学分析基础一电磁辐射的性质1、光学分析法根据物质发射的电磁辐射或电磁辐射与物质相互作用建立起来的一类分析方法。2、电磁辐射:以巨大速度通过空间、不需要任何物质作为传播媒介的一种能量(交变电场和磁场)。3、波动性和粒子性1.1光学分析基础一电磁辐射的性质

(1)波动性:电磁辐射为正弦波（波长、频率、速度、振幅）。与其它波，如声波不同，电磁波不需传播介质，可在真空中传输。

第三紫外可见分光光度法优质课件

频率：为空间某点的电场每秒钟达到正极大值的次数（单位时间电磁场振动次数）。周期：两个相邻矢量极大（或极小）通过空间某固定点所需的时间间隔叫做辐射的周期。波长：相邻两个波峰或波谷间的距离。波数：是1cm内波的数目=1/。频率：为空间某点的电场每秒钟达到正极大值的次数（单位时间

普朗克方程：E=hv，式中的h叫普朗克常量(Planckconstant),其值为6.626×10-34J·s。

普朗克认为,物体只能按hν的整数倍一份一份地吸收或释出光能,而不可能是0.5hν等任何非整数倍。即所谓的能量量子化概念，但它只涉及光作用于物体时能量的传递过程。

普朗克方程：E=hv，式中的h叫普朗2能态(1)量子理论:物质粒子总是处于特定的不连续的能量状态，即能量是量子化的。(2)当粒子的状态发生变化时，该粒子将吸收或发射完全等于两个能级之间的能量差；反之亦是成立的，即

2能态二电磁波谱二电磁波谱2．在同一波长下，各组分吸光度具有加和性2溶液酸度配位数和水解等与pH有关适用于分析多组分混合物，混浊试样（生物组织液）根据吸收谱带波长和电子跃迁类型→推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定）。不饱和基团（—C＝C—，—C＝O）浓度过高会使C与A关系偏离定律。吸收峰→λmax不同的有机化合物具有不同的吸收光谱。（2）不饱和烃及共轭烯烃反式空间位阻小，双键与苯环在同一平面上，容易产生共轭。2有机化合物的构型，构象测定频率：为空间某点的电场每秒钟达到正极大值的次数（单位时间电磁场振动次数）。1．两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）(2)当粒子的状态发生变化时，该粒子将吸收或发射完全等于两个能级之间的能量差；一仪器测量条件的选择含杂原子不饱和基团（—C≡N，C＝O）不用拉动吸收池(同时通过参比溶液和待测溶液），可以减小移动误差特点强度大，摩尔吸收系数大，通常在104~2×104Lmol1cm1，吸收峰的位置一般在217~280nm；2．在同一波长下，各组分吸光度具有加和性白光为一复合光三物质的颜色白光为一复合光三物质的颜色能复合成白光的两种颜色的光叫互补色光。物质所显示的颜色是吸收光的互补色，即透过光颜色能复合成白光的两种颜色的光叫互补色光。物质所显示的颜色是吸收

物质颜色和吸收光的关系物质颜色吸收光颜色波长/nm黄绿紫400~450黄蓝450~480橙绿蓝480~490红蓝绿490~500红紫绿500~560紫黄绿560~580蓝黄580~610绿蓝橙610~650蓝绿红650~780物质颜色和吸收光的关系物质颜色吸收光颜色波长/nm黄绿紫41.2紫外可见吸收光谱的产生1原理运动的分子外层电子吸收紫外可见光区的辐射产生电子能级跃迁紫外可见吸收光谱。1.2紫外可见吸收光谱的产生1原理能级组成除了电子能级外，分子吸收能量将伴随着分子的振动和转动，即同时将发生振动能级和转动能级的跃迁！据量子力学理论，分子的振转跃迁也是量子化的或者说将产生非连续谱。因此，分子的能量变化E为各种形式能量变化的总和

其中ΔEe最大：1-20eV;ΔEv次之：

0.05-1eV;ΔEr最小：<0.05eV能级组成除了电子能级外，分子吸收能量将伴随着分子的振动和转动2分子吸收光谱跃迁类型

2分子吸收光谱跃迁类型K带：λmax=240nm，ε=13000依据Lamber-Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线。物质颜色和吸收光的关系=ε1c1b+ε2c2b+ε3c3b+…+εncnb浓度过高会使C与A关系偏离定律。由共轭双键（两个双键被一个单键隔开时称为共轭体系）中跃迁产生的吸收带称为K（π－π*）带。溶剂参比试样组成简单、共存组份少(基体干扰少)、显色剂不吸收时，直接采用溶剂(多为蒸馏水)为参比；随着溶剂极性的增大,分子振动受到限制,精细结构就会逐渐消失,合并为一条宽而低的吸收带。第二节紫外－可见分光光度计浓度过高会使C与A关系偏离定律。例精密称取B12样品25.Fe(C7H4O3)3+单光束分光光度计原理图醛酮中均含有羰基，含有n，σ和π电子，可产生n－σ*，π－π*和n－π*三个吸收带，n－π*又称为R带，落于近紫外或紫外光区，吸收带出现在270－300nm，强度低，吸收系数为10－20，并且谱带略宽。E=A/(bc)消除方法：选择较窄的入射狭缝宽度和提高单色器分辨率决定双波长分光光度计原理图例1某有色溶液，用1cm比色皿时其透射比为T，如改用2cm比色皿时其透射比为多少？B带是由苯环本身振动及闭合环状共轭双键ππ*跃迁而产生的吸收带，是芳香族（包括杂环芳香族）的主要特征吸收带。参比溶液目的消除溶液中其它成分（溶剂，试剂，样品基体）以及吸收池对光的反射和吸收所带来的误差1.σ→σ*跃迁饱和烃（乙烷:λmax=135nm）E很高，λ<150nm（远紫外区）2.n→σ*跃迁含杂原子饱和基团（—OH，—NH2）E较大，λ150~250nm（远紫外区）3.π→π*跃迁不饱和基团（—C＝C—，—C＝O）E较小，λ~200nm体系共轭，E更小，λ更大4.n→π*跃迁含杂原子不饱和基团（—C≡N，C＝O）E最小，λ200~400nm（近紫外区）K带：λmax=240nm，ε=130001.σ→σ*跃备注紫外可见光谱电子跃迁类型n—π*跃迁π—π*跃迁饱和化合物无紫外吸收电子跃迁类型与分子结构及基团有密切联系。根据分子结构→推测可能产生的电子跃迁类型。根据吸收谱带波长和电子跃迁类型→推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定）。备注3、相关的基本概念(1)吸收光谱（吸收曲线）不同波长光对样品的作用不同，吸收强度不同,以A~λ作图所得的曲线。(2)吸收光谱特征定性依据吸收峰→λmax吸收谷→λmin肩峰→λsh

3、相关的基本概念(1)吸收光谱（吸收曲线）(3)生色团（发色团）分子中含有非键或π键的电子体系，能吸收紫外可见光的原子基团或结构单元。例C＝C；C＝O；C＝N；—N＝N—注当出现几个发色团共轭，则几个发色团所产生的吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波长将比单个发色团的吸收波长长，强度也增强。(4)助色团:本身无紫外吸收，含有孤对电子，可使生色团吸收峰向长波方向移动并提高吸收强度的一些官能团。(3)生色团（发色团）分子中含有非键或π键的电子体系，能吸收生色团实例溶剂max/nmmax跃迁类型烯C6H13CH=CH2正庚烷17713000→*炔C5H11C≡CCH3正庚烷17810000→*羰基CH3COCH3异辛烷27913n→*CH3COH异辛烷29017n→*羧基CH3COOH乙醇20441n→*酰胺CH3CONH2水21460n→*偶氮基CH3N=NCH3乙醇3395n→*硝基CH3NO2异辛烷28022n→*亚硝基C4H9NO乙醚300100n→*硝酸酯C2H5ONO2二氧六环27012n→*生色团实例溶剂max/nmmax跃迁类型烯C6H13CH助色团化合物溶剂max/m

max/(L.mol-1.cm-1)

--CH4,C2H6气态150,165___---OHCH3OH正己烷177200---OHC2H5OH正己烷186___---ORC2H5OC2H5气态1901000---NH2CH3NH2--173213---NHRC2H5NHC2H5正己烷1952800---SHCH3SH乙醇1951400---SRCH3SCH3乙醇210,2291020,140---ClCH3Cl正己烷173200---BrCH3CH2CH2Br正己烷208300---ICH3I正己烷259400助色团化合物溶剂max/mmax/(L.mol-1.(5)红移和蓝移由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或采用不同溶剂后吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移（长移）吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移）。(6)增色效应和减色效应增色效应吸收强度增强的效应。减色效应吸收强度减小的效应。(7)强带和弱带εmax>105→强带;εmin<103→弱带(5)红移和蓝移第三紫外可见分光光度法优质课件4有机化合物的紫外－可见吸收光谱

（1）饱和烃及取代烃饱和单键碳氢化合物含有CH和CC键，只含有σ键电子,一般在远紫外区才有吸收，又称为真空紫外区，因为小于160nm的紫外光要被空气中的氧所吸收，因此需要在无氧或真空中进行测定，应用不多；这类化合物在200－1000nm范围内无吸收带，在紫外吸收光谱中常用作溶剂，如己烷，庚烷，环己烷等。当饱和单键碳氢化合物中的氢被氧，氮，卤素，硫等杂原子取代时，即其取代物如卤代烃，醇，胺等，由于这类原子中有n电子，可产生n－σ*，从而产生红移。4有机化合物的紫外－可见吸收光谱（1）饱和烃及取代烃（2）不饱和烃及共轭烯烃这类化合物含有孤立双键和共轭双键，都含有π电子，吸收能量后可产生π－π*跃迁。由共轭双键（两个双键被一个单键隔开时称为共轭体系）中跃迁产生的吸收带称为K（π－π*）带。特点强度大，摩尔吸收系数大，通常在104~2×104Lmol1cm1，吸收峰的位置一般在217~280nm；K带的波长和强度与共轭体系的数目，位置和取代基的种类有关。（2）不饱和烃及共轭烯烃丁二烯λmax=217nmεmax104巴豆醛λmax=217.5nmεmax:1.5×104芳香环上如有生色团取代时，也会出现K带，如苯乙烯λmax248nmεmax~1.4×104苯甲醛λmax=249nmεmax–1.1×104丁二烯λmax=217nmεmax104（3）羰基化合物（醛酮）醛酮中均含有羰基，含有n，σ和π电子，可产生n－σ*，π－π*和n－π*三个吸收带，n－π*又称为R带，落于近紫外或紫外光区，吸收带出现在270－300nm，强度低，吸收系数为10－20，并且谱带略宽。醛酮的羰基与双键共轭时，形成不饱和醛酮类化合物，发生红移，强度增强。（3）羰基化合物（醛酮）（4）苯及其取代物苯有三个吸收带，它们都由π－π*跃迁引起的B带是由苯环本身振动及闭合环状共轭双键ππ*跃迁而产生的吸收带，是芳香族（包括杂环芳香族）的主要特征吸收带。其特点是在230～270nm呈现一宽峰，且具有精细结构，λmax=255nm，εmax约200，属弱吸收,常用来识别芳香族化合物。B带在气态或非极性溶剂中，有许多的精细结构，是由于振动跃迁在基态电子跃迁上的叠加，在极性溶剂中，溶质与溶剂分子的相互作用使这种精细结构消失。（4）苯及其取代物4紫外可见吸收光谱的应用含杂原子不饱和基团（—C≡N，C＝O）2检测器类型光电池、光电管和光电倍增管。Fe(C7H4O3)3+1．吸光系数的物理意义单位浓度、单位厚度的吸光度2、电磁辐射:以巨大速度通过空间、不需要任何物质作为传播媒介的一种能量(交变电场和磁场)。含杂原子不饱和基团（—C≡N，C＝O）下表列出紫外、可见吸收光谱中常用的溶剂，以供选择时参考。二、紫外可见分光光度计的类型1显色剂用量配位数与显色剂用量有关；这类化合物在200－1000nm范围内无吸收带，在紫外吸收光谱中常用作溶剂，如己烷，庚烷，环己烷等。1单色器能从光源辐射的复合光中分出单色光的装置浓度过高会使C与A关系偏离定律。溶质浓度改变可能会引起其离解，缔合，光化学反应，互变异构，络合物配位数变化等作用，使被测组分的吸收曲线发生变化。使用时来回拉动吸收池（轮流通过参比溶液和样品溶液）→移动误差在形成逐级配合物，其用量更要严格控制（二）单波长双光束分光光度计普朗克认为,物体只能按hν的整数倍一份一份地吸收或释出光能,而不可能是0.（一）显色反应和显色剂05-1eV;ΔEr最小：<0.（二）单波长双光束分光光度计E吸收带E带也是芳香族化合物的特征吸收谱带，可以认为是苯环内三个乙烯基共轭发生的π-π*跃迁所发生的。

E带可分为E1和E2二个吸收带。E1带的吸收峰大约在180nm（ε＞104）；E2带约在200nm（ε<7000），都属强吸收。一般来说，El带是观察不到的，当苯环上有生色团取代且与苯环共轭时，E2带常与K带合并，吸收峰向长波移动。4紫外可见吸收光谱的应用E吸收带E带也是芳香族化合物的苯乙酮的紫外吸收光谱,溶剂:正庚烷K带：λmax=240nm，ε=13000B带：λmax=278nm，ε=1100R带：λmax=319nm，ε=50苯乙酮的紫外吸收光谱,溶剂:正庚烷K带：λmax=240n

取代基能影响苯原有的三个吸收带，其中影响较大的是E2带和B带，当苯环上引入－OH,－CHO,－NO2,－NH2时，苯的B带显著红移，吸收强度也有所增加，但B带的精细结构也消失，这是由于n－π*共轭所致；而当烷基取代时，对苯的吸收光谱影响不大稠环芳香族化合物的紫外吸收光谱的最大特征是共轭体系增加，使波长红移，吸收强度增强。取代基能影响苯原有的三个吸收带，其中影响较大的是E2带和B化合物E吸收带B吸收带R吸收带maxmaxmaxmaxmaxmaxnmL.mol-1.cm-1nmL.mol-1.cm-1nmL.mol-1.cm-1苯2047900254204甲苯2067000261225苯酚21062002701450苯甲酸23011600273970苯胺23086002871430苯乙烯24814000282750苯甲醛2491140032050硝基苯26811000330200化合物E吸收带B吸收带R吸收带maxmaxmaxma1.3影响紫外可见吸收光谱的因素1溶剂效应(1)对λmax影响

吸收带正己烷CH3ClCH3OHH2O波长位移→*λmax

/nm230238237243红移n→*λmax

/nm329315309305紫移溶剂对亚异丙酮吸收带的影响

一般来说,随着溶剂极性增大,→*跃迁吸收峰红移,n→*跃迁吸收峰紫移。1.3影响紫外可见吸收光谱的因素1溶剂效应吸收带正己烷C(2)对吸收光谱精细结构影响随着溶剂极性的增大,分子振动受到限制,精细结构就会逐渐消失,合并为一条宽而低的吸收带。选择收光谱曲线的溶剂时，应注意如下几点（1）尽量选用低极性溶剂。（2）能很好地溶解被测物，并且形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性。（3）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。下表列出紫外、可见吸收光谱中常用的溶剂，以供选择时参考。(2)对吸收光谱精细结构影响溶剂使用波长范围/nm溶剂使用波长范围/nm水>210甘油>230乙醇>210氯仿>245甲醇>210四氯化碳>265异丙醇>210乙酸甲酯>260正丁醇>210乙酸乙酯>26096%硫酸>210乙酸正丁酯>260乙醚>220苯>280二氧六环>230甲苯>285二氯甲烷>235吡啶>303己烷>200丙酮>330环己烷>200二硫化碳>375溶剂使用波长范围/nm溶剂使用波长范围/nm水>210甘油>2共轭体系的存在红移CH2=CH2的π－π*跃迁，λmax165~200nm；而1,3丁二烯，λmax=217nm

由于π键与π键相互作用，产生π－π共轭效应，生成大π键，使π*轨道的能量降低，π→π*跃迁所需的能量也减小，所以生色团的吸收谱带移向长波区和吸收强度增加.2共轭体系的存在红移共轭双键数增加，红移增大共轭双键数增加，红移增大1.4紫外可见吸收光谱的应用1定性分析不同的有机化合物具有不同的吸收光谱。根据化合物的特征吸收峰波长和强度可以进行物质的鉴定，结合红外光谱，质谱和核磁共振谱进行定性鉴定和结构分析波长吸收带结构200－400nm无饱和直链烃，脂环烃，饱和脂肪烃270－350nm弱简单的非共轭发色团210－250nm强共轭双键250－300nm中等强度苯环1.4紫外可见吸收光谱的应用1定性分析波长吸收带结构202有机化合物的构型，构象测定（1）顺反异构一般，反式异构体的λmax和εmax比相应的顺式异构体大。在顺式肉桂酸和反式肉桂酸中，顺式空间位阻大，苯环与侧链双键共平面性差，不易产生共轭；反式空间位阻小，双键与苯环在同一平面上，容易产生共轭。因此，反式的最大吸收波长λmax=295nm，而顺式的最大吸收波长λmax=280nm。

2有机化合物的构型，构象测定根据紫外吸收光谱的λmax判断是否存在互变异构体参比溶液目的消除溶液中其它成分（溶剂，试剂，样品基体）以及吸收池对光的反射和吸收所带来的误差消除办法提高仪器自身的性能。依据Lamber-Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线。不同波长光对样品的作用不同，吸收强度不同,以A~λ作图所得的曲线。透过光的强度(Ⅰt)和入射光强度(Ⅰo)之比称为透光度（T)T=Ⅰt/Ⅰo(2)对吸收光谱精细结构影响若不被吸收，吸光度小于真实值，出现负偏差。运动的分子外层电子吸收紫外可见光区的辐射产生电子能级跃迁紫外可见吸收光谱。即所谓的能量量子化概念，但它只涉及光作用于物体时能量的传递过程。=ε1c1b+ε2c2b+ε3c3b+…+εncnb注当出现几个发色团共轭，则几个发色团所产生的吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波长将比单个发色团的吸收波长长，强度也增强。优选第三紫外可见分光光度法例精密称取B12样品25.2共轭体系的存在红移光学元件污染（灰尘散射，光学部件反射，散射）。吸收峰→λmaxA=A1+A2+A3+…+An（2）互变异构体根据紫外吸收光谱的λmax判断是否存在互变异构体酮式没有共轭双键，它在204nm处仅有弱吸收；而烯醇式由于有共轭双键，因此在245nm处有强的K吸收带（κ=18000L·mol-1cm-1)根据紫外吸收光谱的λmax判断是否存在互变异构体（2）互变异3定量分析根据朗伯比尔定律，物质在一定波长处的吸光度与它的浓度成正比，因此，选择合适的波长，测定溶液的吸光度就可求出溶液的浓度和物质的量。3定量分析第二节紫外－可见分光光度计

第二节紫外－可见分光光度计

图3.6紫外-可见分光光度计1：光源；2：单色器；3吸收池；4检测系统；5显示系统一主要部件与性能图3.6紫外-可见分光光度计1：光源；2：单色器；3吸收池（一）光源白炽光源钨灯或卤钨灯－可见光源350～1000nm气体放电光源氢灯或氘灯－紫外光源200～360nm基本要求所需的光谱区域内能够发射连续辐射足够的辐射强度良好的稳定性辐射能量随波长的变化应尽可能小（一）光源白炽光源钨灯或卤钨灯－可见光源350～1000（二）单色器1单色器能从光源辐射的复合光中分出单色光的装置2组成狭缝、色散元件（棱镜，光栅）3棱镜色散原理依据不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长的光分开。(1)玻璃棱镜由于玻璃可吸收紫外光，玻璃棱镜只能用于350~3200nm的波长范围，能用于可见光域内。(2)石英棱镜石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从185~4000nm，可用于紫外、可见和近红外三个光域。（二）单色器1单色器能从光源辐射的复合光中分出单色光的第三紫外可见分光光度法优质课件4光栅原理利用光的衍射与干涉作用制成的范围紫外、可见及红外光域，在整个波长区具有良好的、几乎均匀一致的分辨能力。优点它具有色散波长范围宽、分辨本领高、成本低、便于保存和易于制备等优点。缺点各级光谱会重叠而产生干扰,可用二维色散技术克服。4光栅（三）吸收池1、吸收池功能用于盛放分析试样2、材料玻璃——能吸收UV光，仅适用于可见光区石英——不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区。3、要求匹配性（对光的吸收和反射应一致），为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。（三）吸收池1、吸收池功能用于盛放分析试样（四）检测系统1功能检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变化的一种装置。2检测器类型光电池、光电管和光电倍增管。3硒光电池范围为300~800nm，其中500~600nm最为灵敏。用于低档的分光光度计中。4光电管在紫外可见分光光度计上应用广泛。5光电倍增管检测微弱光最常用的光电元件，它的灵敏度比光电管要高200倍，因此可使用较窄的单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。（四）检测系统1功能检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变（五）显示系统作用放大信号并以适当方式指示或记录下来。常用装置直读检流计、电位调节指零装置，数字显示或自动记录装置，现在用工作站。（五）显示系统二、紫外可见分光光度计的类型单光束分光光度计双光束分光光度计双波长分光光度计二、紫外可见分光光度计的类型单光束分光光度计特点：使用时来回拉动吸收池（轮流通过参比溶液和样品溶液）→移动误差结构简单，操作方便，维修容易（一）单光束分光光度计光电倍增管切光器光闸比色皿单色器单光束分光光度计原理图特点：（一）单光束分光光度计光电倍增管切光器光闸比色皿单色器（二）单波长双光束分光光度计特点：不用拉动吸收池(同时通过参比溶液和待测溶液），可以减小移动误差可以自动扫描吸收光谱

光闸单色器切光器参比光电倍增管双光束分光光度计原理图样品溶液（二）单波长双光束分光光度计特点：光闸单色器切光器参比光电倍（三）双波长分光光度计单色器单色器吸收池接收器λ1λ1λ2λ2双波长分光光度计原理图特点：定量基础：ΔA=A1-A2可消除干扰和吸收池不匹配引起的误差，不需要参比溶液。适用于分析多组分混合物，混浊试样（生物组织液）（三）双波长分光光度计单色器单色器吸收池接收器λ1λ1λ2λ第三节Lamber－Beer定律透射比和吸光度Lamber－Beer定律吸光系数偏离Lamber－Beer定律的因素第三节Lamber－Beer定律透射比和吸光度透过光的强度(Ⅰt)和入射光强度(Ⅰo)之比称为透光度（T)T=Ⅰt/Ⅰo为表示物质吸收光的程度引入吸光度(A)概念一、透光度和吸光度透过光的强度(Ⅰt)和入射光强度(Ⅰo)之比称为透光度（T二、LamberBeer定律描述物质对单色光吸收强弱(吸光度）与液层厚度和待测物浓度的关系A=Elc=Ebc=εbc=abc二、LamberBeer定律描述物质对单色光吸收强弱(吸光讨论：1．Lamber-Beer定律的适用条件（前提）（1）入射光为单色光（2）溶液是稀溶液（3）均相体系2．在同一波长下，各组分吸光度具有加和性应用：多组分测定。讨论：1．Lamber-Beer定律的适用条件（前提）吸光度的加和性如有一复杂试样，其中含有几个组分，各个组分都有各自的吸光系数ε，浓度c和吸光度A，那么溶液的吸光度等于各组分的吸光度之和A=A1+A2+A3+…+An=ε1c1b+ε2c2b+ε3c3b+…+εncnb吸光度的加和性如有一复杂试样，其中含有几个组分，各个例1某有色溶液，用1cm比色皿时其透射比为T，如改用2cm比色皿时其透射比为多少？解例2已知某一有机化合物，在波长520nm处的摩尔吸光系数为9.29×104L/（molcm)，今用2cm的吸收池，在该波长处测得的吸光度为0.89，求有色化合物的浓度？解c=A/εb=0.89/(9.29×104×2)=4.79×106例1某有色溶液，用1cm比色皿时其透射比为T，如改用2三、吸光系数1．吸光系数的物理意义单位浓度、单位厚度的吸光度E=A/(bc)当b以cm,c以g/L为单位时,吸光系数以a表示:A=acb当b以cm,c以mol/L为单位时,摩尔吸光系数以ε表示

A=εcb三、吸光系数1．吸光系数的物理意义单位浓度、单位厚度的吸光四、偏离朗伯－比尔定律的因素依据Lamber-Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线。偏离Lamber-Beer定律的主要因素表现为以下两个方面。（一）光学因素（二）化学因素

A=εbc四、偏离朗伯－比尔定律的因素依据Lamber-Beer定律，（一）光学因素1．非单色光的影响LamberBeer定律应用的重要前提——入射光为单色光一般仪器所获得的入射光是具有一定波长范围的复合光，由于物质对不同波长的光有不同的吸光系数，从而使得吸光度的变化偏离Lamber-Beer定律消除方法：选择较窄的入射狭缝宽度和提高单色器分辨率决定（一）光学因素1．非单色光的影响一般仪器所获得的入射光是具有2．杂散光的影响杂散光指与测量波长相同，在仪器内部不通过试样而到达检测器的那部分辐射，以及单色器通带范围以外的额外辐射。杂散光来源仪器本身缺陷；光学元件污染（灰尘散射，光学部件反射，散射）。当杂散光可以被试样吸收，所得的吸光度大于真实值，出现正偏差；若不被吸收，吸光度小于真实值，出现负偏差。消除办法提高仪器自身的性能。2．杂散光的影响3．反射光和散射光的影响反射光（吸收池内外界面间产生的）和散射光（颗粒较大的吸收质点产生的）均是入射光谱带宽度内的光直接对T产生影响，产生假吸收的现象，使T↓，A↑，吸收光谱变形。※注一般可用空白对比校正消除。4．非平行光的影响使光程↑，A↑，吸收光谱变形3．反射光和散射光的影响（二）化学因素Beer定律适用的另一个前提稀溶液；浓度过高会使C与A关系偏离定律。溶质浓度过高（>0.01mol/L),吸光物质分子或离子间的平均距离缩小，使相邻吸光分子的电荷分布相互影响，从而改变它对光的吸收能力，浓度越大，这种影响就越大。溶质浓度改变可能会引起其离解，缔合，光化学反应，互变异构，络合物配位数变化等作用，使被测组分的吸收曲线发生变化。※消除办法采用稀溶液分析（二）化学因素Beer定律适用的另一个前提稀溶液；浓度过高会第四节分析条件的选择仪器测量条件的选择显色反应条件的选择参比溶液的选择第四节分析条件的选择仪器测量条件的选择一仪器测量条件的选择

1，入射光波长的选择一般用最大吸收波长，如有干扰则选用其他波长。一仪器测量条件的选择

1，入射光波长的选择一般用最大吸二显色反应条件的选择（一）显色反应和显色剂1显色反应被测元素（金属离子）在某种试剂作用下,转变为有色化合物的反应2显色剂所用的试剂3对显色反应的要求:（1）选择性好（2）灵敏度要高（3）有色配合物的组成一定并且稳定二显色反应条件的选择（一）显色反应和显色剂（二）影响显色反应的条件1显色剂用量配位数与显色剂用量有关；在形成逐级配合物，其用量更要严格控制2溶液酸度配位数和水解等与pH有关3显色时间、温度、放置时间通过条件实验确定显色反应条件pH范围配合物组成颜色<4Fe(C7H4O3)+紫红色(1:1)4-7Fe(C7H4O3)2+棕橙色(1:2)8-10Fe(C7H4O3)3+黄色(1:3)（二）影响显色反应的条件pH范围配合物组成颜色<4Fe(C7三参比溶液的选择

参比溶液目的消除溶液中其它成分（溶剂，试剂，样品基体）以及吸收池对光的反射和吸收所带来的误差1.溶剂参比试样组成简单、共存组份少(基体干扰少)、显色剂不吸收时，直接采用溶剂(多为蒸馏水)为参比；2.试剂参比当显色剂或其它试剂在测定波长处有吸收时，采用试剂作参比(不加待测物)；3.试样参比如试样基体在测定波长处有吸收，但不与显色剂反应时，可以试样作参比(不能加显色剂)三参比溶液的选择

参比溶液目的消除溶液中其它成分（溶剂，第五节测定方法单组分定量方法多组分定量方法第五节测定方法单组分定量方法一单组分定量方法1．吸光系数法2．标准曲线法定量依据：A=εbc一单组分定量方法1．吸光系数法定量依据：A=εbc1．吸光系数法

1．吸光系数法

例维生素B12的水溶液在361nm处的百分吸光系数为207，用1cm比色池测得某维生素B12溶液的吸光度是0.414，求该溶液的浓度例精密称取B12样品25.0mg，用水溶液配成100ml。精密吸取10.00ml，又置100ml容量瓶中，加水至刻度。取此溶液在1cm的吸收池中，于361nm处测定吸光度为0.507，求B12的百分含量？例维生素B12的水溶液在361nm处的百分吸光系数为2072．标准曲线法前提固定测定条件和仪器条件2．标准曲线法前提固定测定条件和仪器条件芦丁含量测定0.710mg/25mL芦丁含量测定0.710mg/25mL二多组分定量方法1．两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）

两组分在各自λmax下不重叠→分别按单组分定量二多组分定量方法1．两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）2．两组分吸收光谱部分重叠

λ1→测A1→b组分不干扰→可按单组分定量测Caλ2→测A2→a组分干扰→不能按单组分定量测Cb2．两组分吸收光谱部分重叠第三紫外可见分光光度法第三紫外可见分光光度法80优选第三紫外可见分光光度法优选第三紫外可见分光光度法1.1光学分析基础一电磁辐射的性质1、光学分析法根据物质发射的电磁辐射或电磁辐射与物质相互作用建立起来的一类分析方法。2、电磁辐射:以巨大速度通过空间、不需要任何物质作为传播媒介的一种能量(交变电场和磁场)。3、波动性和粒子性1.1光学分析基础一电磁辐射的性质

(1)波动性:电磁辐射为正弦波（波长、频率、速度、振幅）。与其它波，如声波不同，电磁波不需传播介质，可在真空中传输。

第三紫外可见分光光度法优质课件

频率：为空间某点的电场每秒钟达到正极大值的次数（单位时间电磁场振动次数）。周期：两个相邻矢量极大（或极小）通过空间某固定点所需的时间间隔叫做辐射的周期。波长：相邻两个波峰或波谷间的距离。波数：是1cm内波的数目=1/。频率：为空间某点的电场每秒钟达到正极大值的次数（单位时间

普朗克方程：E=hv，式中的h叫普朗克常量(Planckconstant),其值为6.626×10-34J·s。

普朗克认为,物体只能按hν的整数倍一份一份地吸收或释出光能,而不可能是0.5hν等任何非整数倍。即所谓的能量量子化概念，但它只涉及光作用于物体时能量的传递过程。

普朗克方程：E=hv，式中的h叫普朗2能态(1)量子理论:物质粒子总是处于特定的不连续的能量状态，即能量是量子化的。(2)当粒子的状态发生变化时，该粒子将吸收或发射完全等于两个能级之间的能量差；反之亦是成立的，即

2能态二电磁波谱二电磁波谱2．在同一波长下，各组分吸光度具有加和性2溶液酸度配位数和水解等与pH有关适用于分析多组分混合物，混浊试样（生物组织液）根据吸收谱带波长和电子跃迁类型→推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定）。不饱和基团（—C＝C—，—C＝O）浓度过高会使C与A关系偏离定律。吸收峰→λmax不同的有机化合物具有不同的吸收光谱。（2）不饱和烃及共轭烯烃反式空间位阻小，双键与苯环在同一平面上，容易产生共轭。2有机化合物的构型，构象测定频率：为空间某点的电场每秒钟达到正极大值的次数（单位时间电磁场振动次数）。1．两组分吸收光谱不重叠（互不干扰）(2)当粒子的状态发生变化时，该粒子将吸收或发射完全等于两个能级之间的能量差；一仪器测量条件的选择含杂原子不饱和基团（—C≡N，C＝O）不用拉动吸收池(同时通过参比溶液和待测溶液），可以减小移动误差特点强度大，摩尔吸收系数大，通常在104~2×104Lmol1cm1，吸收峰的位置一般在217~280nm；2．在同一波长下，各组分吸光度具有加和性白光为一复合光三物质的颜色白光为一复合光三物质的颜色能复合成白光的两种颜色的光叫互补色光。物质所显示的颜色是吸收光的互补色，即透过光颜色能复合成白光的两种颜色的光叫互补色光。物质所显示的颜色是吸收

物质颜色和吸收光的关系物质颜色吸收光颜色波长/nm黄绿紫400~450黄蓝450~480橙绿蓝480~490红蓝绿490~500红紫绿500~560紫黄绿560~580蓝黄580~610绿蓝橙610~650蓝绿红650~780物质颜色和吸收光的关系物质颜色吸收光颜色波长/nm黄绿紫41.2紫外可见吸收光谱的产生1原理运动的分子外层电子吸收紫外可见光区的辐射产生电子能级跃迁紫外可见吸收光谱。1.2紫外可见吸收光谱的产生1原理能级组成除了电子能级外，分子吸收能量将伴随着分子的振动和转动，即同时将发生振动能级和转动能级的跃迁！据量子力学理论，分子的振转跃迁也是量子化的或者说将产生非连续谱。因此，分子的能量变化E为各种形式能量变化的总和

其中ΔEe最大：1-20eV;ΔEv次之：

0.05-1eV;ΔEr最小：<0.05eV能级组成除了电子能级外，分子吸收能量将伴随着分子的振动和转动2分子吸收光谱跃迁类型

2分子吸收光谱跃迁类型K带：λmax=240nm，ε=13000依据Lamber-Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线。物质颜色和吸收光的关系=ε1c1b+ε2c2b+ε3c3b+…+εncnb浓度过高会使C与A关系偏离定律。由共轭双键（两个双键被一个单键隔开时称为共轭体系）中跃迁产生的吸收带称为K（π－π*）带。溶剂参比试样组成简单、共存组份少(基体干扰少)、显色剂不吸收时，直接采用溶剂(多为蒸馏水)为参比；随着溶剂极性的增大,分子振动受到限制,精细结构就会逐渐消失,合并为一条宽而低的吸收带。第二节紫外－可见分光光度计浓度过高会使C与A关系偏离定律。例精密称取B12样品25.Fe(C7H4O3)3+单光束分光光度计原理图醛酮中均含有羰基，含有n，σ和π电子，可产生n－σ*，π－π*和n－π*三个吸收带，n－π*又称为R带，落于近紫外或紫外光区，吸收带出现在270－300nm，强度低，吸收系数为10－20，并且谱带略宽。E=A/(bc)消除方法：选择较窄的入射狭缝宽度和提高单色器分辨率决定双波长分光光度计原理图例1某有色溶液，用1cm比色皿时其透射比为T，如改用2cm比色皿时其透射比为多少？B带是由苯环本身振动及闭合环状共轭双键ππ*跃迁而产生的吸收带，是芳香族（包括杂环芳香族）的主要特征吸收带。参比溶液目的消除溶液中其它成分（溶剂，试剂，样品基体）以及吸收池对光的反射和吸收所带来的误差1.σ→σ*跃迁饱和烃（乙烷:λmax=135nm）E很高，λ<150nm（远紫外区）2.n→σ*跃迁含杂原子饱和基团（—OH，—NH2）E较大，λ150~250nm（远紫外区）3.π→π*跃迁不饱和基团（—C＝C—，—C＝O）E较小，λ~200nm体系共轭，E更小，λ更大4.n→π*跃迁含杂原子不饱和基团（—C≡N，C＝O）E最小，λ200~400nm（近紫外区）K带：λmax=240nm，ε=130001.σ→σ*跃备注紫外可见光谱电子跃迁类型n—π*跃迁π—π*跃迁饱和化合物无紫外吸收电子跃迁类型与分子结构及基团有密切联系。根据分子结构→推测可能产生的电子跃迁类型。根据吸收谱带波长和电子跃迁类型→推测分子中可能存在的基团（分子结构鉴定）。备注3、相关的基本概念(1)吸收光谱（吸收曲线）不同波长光对样品的作用不同，吸收强度不同,以A~λ作图所得的曲线。(2)吸收光谱特征定性依据吸收峰→λmax吸收谷→λmin肩峰→λsh

3、相关的基本概念(1)吸收光谱（吸收曲线）(3)生色团（发色团）分子中含有非键或π键的电子体系，能吸收紫外可见光的原子基团或结构单元。例C＝C；C＝O；C＝N；—N＝N—注当出现几个发色团共轭，则几个发色团所产生的吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波长将比单个发色团的吸收波长长，强度也增强。(4)助色团:本身无紫外吸收，含有孤对电子，可使生色团吸收峰向长波方向移动并提高吸收强度的一些官能团。(3)生色团（发色团）分子中含有非键或π键的电子体系，能吸收生色团实例溶剂max/nmmax跃迁类型烯C6H13CH=CH2正庚烷17713000→*炔C5H11C≡CCH3正庚烷17810000→*羰基CH3COCH3异辛烷27913n→*CH3COH异辛烷29017n→*羧基CH3COOH乙醇20441n→*酰胺CH3CONH2水21460n→*偶氮基CH3N=NCH3乙醇3395n→*硝基CH3NO2异辛烷28022n→*亚硝基C4H9NO乙醚300100n→*硝酸酯C2H5ONO2二氧六环27012n→*生色团实例溶剂max/nmmax跃迁类型烯C6H13CH助色团化合物溶剂max/m

max/(L.mol-1.cm-1)

--CH4,C2H6气态150,165___---OHCH3OH正己烷177200---OHC2H5OH正己烷186___---ORC2H5OC2H5气态1901000---NH2CH3NH2--173213---NHRC2H5NHC2H5正己烷1952800---SHCH3SH乙醇1951400---SRCH3SCH3乙醇210,2291020,140---ClCH3Cl正己烷173200---BrCH3CH2CH2Br正己烷208300---ICH3I正己烷259400助色团化合物溶剂max/mmax/(L.mol-1.(5)红移和蓝移由于化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或采用不同溶剂后吸收峰位置向长波方向的移动，叫红移（长移）吸收峰位置向短波方向移动，叫蓝移（紫移，短移）。(6)增色效应和减色效应增色效应吸收强度增强的效应。减色效应吸收强度减小的效应。(7)强带和弱带εmax>105→强带;εmin<103→弱带(5)红移和蓝移第三紫外可见分光光度法优质课件4有机化合物的紫外－可见吸收光谱

（1）饱和烃及取代烃饱和单键碳氢化合物含有CH和CC键，只含有σ键电子,一般在远紫外区才有吸收，又称为真空紫外区，因为小于160nm的紫外光要被空气中的氧所吸收，因此需要在无氧或真空中进行测定，应用不多；这类化合物在200－1000nm范围内无吸收带，在紫外吸收光谱中常用作溶剂，如己烷，庚烷，环己烷等。当饱和单键碳氢化合物中的氢被氧，氮，卤素，硫等杂原子取代时，即其取代物如卤代烃，醇，胺等，由于这类原子中有n电子，可产生n－σ*，从而产生红移。4有机化合物的紫外－可见吸收光谱（1）饱和烃及取代烃（2）不饱和烃及共轭烯烃这类化合物含有孤立双键和共轭双键，都含有π电子，吸收能量后可产生π－π*跃迁。由共轭双键（两个双键被一个单键隔开时称为共轭体系）中跃迁产生的吸收带称为K（π－π*）带。特点强度大，摩尔吸收系数大，通常在104~2×104Lmol1cm1，吸收峰的位置一般在217~280nm；K带的波长和强度与共轭体系的数目，位置和取代基的种类有关。（2）不饱和烃及共轭烯烃丁二烯λmax=217nmεmax104巴豆醛λmax=217.5nmεmax:1.5×104芳香环上如有生色团取代时，也会出现K带，如苯乙烯λmax248nmεmax~1.4×104苯甲醛λmax=249nmεmax–1.1×104丁二烯λmax=217nmεmax104（3）羰基化合物（醛酮）醛酮中均含有羰基，含有n，σ和π电子，可产生n－σ*，π－π*和n－π*三个吸收带，n－π*又称为R带，落于近紫外或紫外光区，吸收带出现在270－300nm，强度低，吸收系数为10－20，并且谱带略宽。醛酮的羰基与双键共轭时，形成不饱和醛酮类化合物，发生红移，强度增强。（3）羰基化合物（醛酮）（4）苯及其取代物苯有三个吸收带，它们都由π－π*跃迁引起的B带是由苯环本身振动及闭合环状共轭双键ππ*跃迁而产生的吸收带，是芳香族（包括杂环芳香族）的主要特征吸收带。其特点是在230～270nm呈现一宽峰，且具有精细结构，λmax=255nm，εmax约200，属弱吸收,常用来识别芳香族化合物。B带在气态或非极性溶剂中，有许多的精细结构，是由于振动跃迁在基态电子跃迁上的叠加，在极性溶剂中，溶质与溶剂分子的相互作用使这种精细结构消失。（4）苯及其取代物4紫外可见吸收光谱的应用含杂原子不饱和基团（—C≡N，C＝O）2检测器类型光电池、光电管和光电倍增管。Fe(C7H4O3)3+1．吸光系数的物理意义单位浓度、单位厚度的吸光度2、电磁辐射:以巨大速度通过空间、不需要任何物质作为传播媒介的一种能量(交变电场和磁场)。含杂原子不饱和基团（—C≡N，C＝O）下表列出紫外、可见吸收光谱中常用的溶剂，以供选择时参考。二、紫外可见分光光度计的类型1显色剂用量配位数与显色剂用量有关；这类化合物在200－1000nm范围内无吸收带，在紫外吸收光谱中常用作溶剂，如己烷，庚烷，环己烷等。1单色器能从光源辐射的复合光中分出单色光的装置浓度过高会使C与A关系偏离定律。溶质浓度改变可能会引起其离解，缔合，光化学反应，互变异构，络合物配位数变化等作用，使被测组分的吸收曲线发生变化。使用时来回拉动吸收池（轮流通过参比溶液和样品溶液）→移动误差在形成逐级配合物，其用量更要严格控制（二）单波长双光束分光光度计普朗克认为,物体只能按hν的整数倍一份一份地吸收或释出光能,而不可能是0.（一）显色反应和显色剂05-1eV;ΔEr最小：<0.（二）单波长双光束分光光度计E吸收带E带也是芳香族化合物的特征吸收谱带，可以认为是苯环内三个乙烯基共轭发生的π-π*跃迁所发生的。

E带可分为E1和E2二个吸收带。E1带的吸收峰大约在180nm（ε＞104）；E2带约在200nm（ε<7000），都属强吸收。一般来说，El带是观察不到的，当苯环上有生色团取代且与苯环共轭时，E2带常与K带合并，吸收峰向长波移动。4紫外可见吸收光谱的应用E吸收带E带也是芳香族化合物的苯乙酮的紫外吸收光谱,溶剂:正庚烷K带：λmax=240nm，ε=13000B带：λmax=278nm，ε=1100R带：λmax=319nm，ε=50苯乙酮的紫外吸收光谱,溶剂:正庚烷K带：λmax=240n

取代基能影响苯原有的三个吸收带，其中影响较大的是E2带和B带，当苯环上引入－OH,－CHO,－NO2,－NH2时，苯的B带显著红移，吸收强度也有所增加，但B带的精细结构也消失，这是由于n－π*共轭所致；而当烷基取代时，对苯的吸收光谱影响不大稠环芳香族化合物的紫外吸收光谱的最大特征是共轭体系增加，使波长红移，吸收强度增强。取代基能影响苯原有的三个吸收带，其中影响较大的是E2带和B化合物E吸收带B吸收带R吸收带maxmaxmaxmaxmaxmaxnmL.mol-1.cm-1nmL.mol-1.cm-1nmL.mol-1.cm-1苯2047900254204甲苯2067000261225苯酚21062002701450苯甲酸23011600273970苯胺23086002871430苯乙烯24814000282750苯甲醛2491140032050硝基苯26811000330200化合物E吸收带B吸收带R吸收带maxmaxmaxma1.3影响紫外可见吸收光谱的因素1溶剂效应(1)对λmax影响

吸收带正己烷CH3ClCH3OHH2O波长位移→*λmax

/nm230238237243红移n→*λmax

/nm329315309305紫移溶剂对亚异丙酮吸收带的影响

一般来说,随着溶剂极性增大,→*跃迁吸收峰红移,n→*跃迁吸收峰紫移。1.3影响紫外可见吸收光谱的因素1溶剂效应吸收带正己烷C(2)对吸收光谱精细结构影响随着溶剂极性的增大,分子振动受到限制,精细结构就会逐渐消失,合并为一条宽而低的吸收带。选择收光谱曲线的溶剂时，应注意如下几点（1）尽量选用低极性溶剂。（2）能很好地溶解被测物，并且形成的溶液具有良好的化学和光化学稳定性。（3）溶剂在样品的吸收光谱区无明显吸收。下表列出紫外、可见吸收光谱中常用的溶剂，以供选择时参考。(2)对吸收光谱精细结构影响溶剂使用波长范围/nm溶剂使用波长范围/nm水>210甘油>230乙醇>210氯仿>245甲醇>210四氯化碳>265异丙醇>210乙酸甲酯>260正丁醇>210乙酸乙酯>26096%硫酸>210乙酸正丁酯>260乙醚>220苯>280二氧六环>230甲苯>285二氯甲烷>235吡啶>303己烷>200丙酮>330环己烷>200二硫化碳>375溶剂使用波长范围/nm溶剂使用波长范围/nm水>210甘油>2共轭体系的存在红移CH2=CH2的π－π*跃迁，λmax165~200nm；而1,3丁二烯，λmax=217nm

由于π键与π键相互作用，产生π－π共轭效应，生成大π键，使π*轨道的能量降低，π→π*跃迁所需的能量也减小，所以生色团的吸收谱带移向长波区和吸收强度增加.2共轭体系的存在红移共轭双键数增加，红移增大共轭双键数增加，红移增大1.4紫外可见吸收光谱的应用1定性分析不同的有机化合物具有不同的吸收光谱。根据化合物的特征吸收峰波长和强度可以进行物质的鉴定，结合红外光谱，质谱和核磁共振谱进行定性鉴定和结构分析波长吸收带结构200－400nm无饱和直链烃，脂环烃，饱和脂肪烃270－350nm弱简单的非共轭发色团210－250nm强共轭双键250－300nm中等强度苯环1.4紫外可见吸收光谱的应用1定性分析波长吸收带结构202有机化合物的构型，构象测定（1）顺反异构一般，反式异构体的λmax和εmax比相应的顺式异构体大。在顺式肉桂酸和反式肉桂酸中，顺式空间位阻大，苯环与侧链双键共平面性差，不易产生共轭；反式空间位阻小，双键与苯环在同一平面上，容易产生共轭。因此，反式的最大吸收波长λmax=295nm，而顺式的最大吸收波长λmax=280nm。

2有机化合物的构型，构象测定根据紫外吸收光谱的λmax判断是否存在互变异构体参比溶液目的消除溶液中其它成分（溶剂，试剂，样品基体）以及吸收池对光的反射和吸收所带来的误差消除办法提高仪器自身的性能。依据Lamber-Beer定律，A与C关系应为经过原点的直线。不同波长光对样品的作用不同，吸收强度不同,以A~λ作图所得的曲线。透过光的强度(Ⅰt)和入射光强度(Ⅰo)之比称为透光度（T)T=Ⅰt/Ⅰo(2)对吸收光谱精细结构影响若不被吸收，吸光度小于真实值，出现负偏差。运动的分子外层电子吸收紫外可见光区的辐射产生电子能级跃迁紫外可见吸收光谱。即所谓的能量量子化概念，但它只涉及光作用于物体时能量的传递过程。=ε1c1b+ε2c2b+ε3c3b+…+εncnb注当出现几个发色团共轭，则几个发色团所产生的吸收带将消失，代之出现新的共轭吸收带，其波长将比单个发色团的吸收波长长，强度也增强。优选第三紫外可见分光光度法例精密称取B12样品25.2共轭体系的存在红移光学元件污染（灰尘散射，光学部件反射，散射）。吸收峰→λmaxA=A1+A2+A3+…+An（2）互变异构体根据紫外吸收光谱的λmax判断是否存在互变异构体酮式没有共轭双键，它在204nm处仅有弱吸收；而烯醇式由于有共轭双键，因此在245nm处有强的K吸收带（κ=18000L·mol-1cm-1)根据紫外吸收光谱的λmax判断是否存在互变异构体（2）互变异3定量分析根据朗伯比尔定律，物质在一定波长处的吸光度与它的浓度成正比，因此，选择合适的波长，测定溶液的吸光度就可求出溶液的浓度和物质的量。3定量分析第二节紫外－可见分光光度计

第二节紫外－可见分光光度计

图3.6紫外-可见分光光度计1：光源；2：单色器；3吸收池；4检测系统；5显示系统一主要部件与性能图3.6紫外-可见分光光度计1：光源；2：单色器；3吸收池（一）光源白炽光源钨灯或卤钨灯－可见光源350～1000nm气体放电光源氢灯或氘灯－紫外光源200～360nm基本要求所需的光谱区域内能够发射连续辐射足够的辐射强度良好的稳定性辐射能量随波长的变化应尽可能小（一）光源白炽光源钨灯或卤钨灯－可见光源350～1000（二）单色器1单色器能从光源辐射的复合光中分出单色光的装置2组成狭缝、色散元件（棱镜，光栅）3棱镜色散原理依据不同的波长光通过棱镜时有不同的折射率而将不同波长的光分开。(1)玻璃棱镜由于玻璃可吸收紫外光，玻璃棱镜只能用于350~3200nm的波长范围，能用于可见光域内。(2)石英棱镜石英棱镜可使用的波长范围较宽，可从185~4000nm，可用于紫外、可见和近红外三个光域。（二）单色器1单色器能从光源辐射的复合光中分出单色光的第三紫外可见分光光度法优质课件4光栅原理利用光的衍射与干涉作用制成的范围紫外、可见及红外光域，在整个波长区具有良好的、几乎均匀一致的分辨能力。优点它具有色散波长范围宽、分辨本领高、成本低、便于保存和易于制备等优点。缺点各级光谱会重叠而产生干扰,可用二维色散技术克服。4光栅（三）吸收池1、吸收池功能用于盛放分析试样2、材料玻璃——能吸收UV光，仅适用于可见光区石英——不能吸收紫外光，适用于紫外和可见光区。3、要求匹配性（对光的吸收和反射应一致），为减少光的损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。（三）吸收池1、吸收池功能用于盛放分析试样（四）检测系统1功能检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变化的一种装置。2检测器类型光电池、光电管和光电倍增管。3硒光电池范围为300~800nm，其中500~600nm最为灵敏。用于低档的分光光度计中。4光电管在紫外可见分光光度计上应用广泛。5光电倍增管检测微弱光最常用的光电元件，它的灵敏度比光电管要高200倍，因此可使用较窄的单色器狭缝，从而对光谱的精细结构有较好的分辨能力。（四）检测系统1功能检测信号、测量单色光透过溶液后光强度变（五）显示系统作用放大信号并以适当方式指示或记录下来。常用装置直读检流计、电位调节指零装置，数字显示或自动记录装置，现在用工作站。（五）显示系统二、紫外可见分光光度计的类型单光束分光光度计双光束分光光度计双波长分光光度计二、紫外可见分光光度计的类型单光束分光光度计特点：使用时来回拉动吸收池（轮流通过参比溶液和样品溶液）→移动误差结构简单，操作方便，维修容易（一）单光束分光光度计光电倍增管切光器光闸比色皿单色器单光束分光光度计原理图特点：（一）单光束分光光度计光电倍增管切光器光闸比色皿单色器（二）单波长双光束分光光度计特点：不用拉动吸收池(同时通过参比溶液和待测溶液），可以减小移动误差可以自动扫描吸收光谱

光闸单色器切光器参比光电倍增管双光束分光光度计原理图样品溶液（二）单波长双光束分光光度计特点：光闸单色器切光器参比光电倍（三）双波长分光光度计单色器单色器吸收池接收器λ1λ1λ2λ2双波长分光光度计原理图特点：定量基础：ΔA=A1-A2可消除干扰和吸收池不匹配引起的误差，不需要参比溶液。适用于分析多组分混合物，混浊试样（生物组织液）（三）双波长分光光度计单色器单色器吸收池接收器λ1λ1λ2λ第三节Lamber－Beer定律透射比和吸光度Lamber－Beer定律吸光系数偏离Lamber－Beer定律的因素第三节Lamber－Beer定律透射比和吸光度透过光的强度(Ⅰt)和入射光强度(Ⅰo)之比称为透光度（T)T=Ⅰt/Ⅰo为表示物质吸收光的程度引入吸光度(A)概念一、透光度和吸光度透过光的强度(Ⅰt)和入射光强度(Ⅰo)之比称为透光度（T二、LamberBeer定律描述物质对单色光吸收强弱(吸光度）与液层厚度和待测物浓度的关系A=Elc=Ebc=εbc=abc二、LamberBeer定律描述物质对单色光吸收强弱(吸光讨论：1．Lamber-Beer定律的适用条件（前提）（1）入射光为单色光（2）溶液是稀溶液（3）均相体系2．在同一波长下，各组分吸光度具有加和性应用：多组分测定。讨论：1．Lamber-Beer定律的适用条件（前提）吸光度的加和性如有一复杂试样，其中含有几个组分，各个组分都有各自的吸光系数ε，浓度c和吸光度A，那么溶液的吸光度等于各组分的吸光度之和A=A1+A2+A3+…+An=ε1c1b+