药品分析方法建立及验证-从质量控制出发课件

药品分析方法建立及验证——从质量控制出发2016.03.23健康元生物医药有限公司药品分析方法建立及验证2016.03.23健康元生物医药有限1目录

方法开发考虑方法哪里来开发什么方法

检测方法初识

分析方法验证分析方法确认及再验证目录方法开发考虑方法哪里来开发什么方法检测方法初识分析2方法考虑原则预期的监督机构期望产品质量参数对安全性和有效性的预期影响分子的具体开发经验来自之前以开发的类似分子的平台经验方法考虑原则预期的监督机构期望3方法开发考虑折叠结构可以防止生物制品降解，但同时使分子的某些部分难以被检测到被结构所保护的易受影响基团延缓了降解过程（氧化、脱酰胺基、切断和聚合）完整结构使得分析方法很难检测到内部的变化在某些分析中保持三维结构是很重要的（如SEC），但在其他一些分析中则需拆开折叠结构（如变性凝胶电泳）方法开发考虑折叠结构可以防止生物制品降解，但同时使分子的某些4方法开发考虑如何解释不是针对完整分子而是针对裂解部分所进行的检测而获得的数据有时有必要将一个蛋白分子裂解为所需的片段，然后对所关注的片段进行分析，如用于蛋氨酸氧化测定肽图多数时候片段并非以简单直接或线性的方式与完整分子相关联（不再是1：1）需要明确地确定完整分子的片段进行分析而得到的某些参数的报告值方法开发考虑如何解释不是针对完整分子而是针对裂解部分所进行的5方法开发考虑从不同正交试验或从主要和辅助试验所得的杂质量并不是可以累加的生物制品需要多项检测来检量其多种特性，如电荷、分子大小等如果一个分子包含多种修饰，则它将被多次计算，但是降解的分子仍然只有一个所以不同检测所得到的值是不能累加的方法开发考虑从不同正交试验或从主要和辅助试验所得的杂质量并不6方法开发考虑对于所要分析的蛋白质物种，通常无法获得纯的样品用来进行加样/回收的物质是所要分析的蛋白质物种（杂质）的富集物，而不是纯化物很多时候，峰并不能达到基线分离可容许实验误差较大定量限较高方法开发考虑对于所要分析的蛋白质物种，通常无法获得纯的样品很7方法开发考虑基质（配方组成）或酸碱度变化、自由巯基的出现等，可能在分析过程中形成原来并不存在的杂质通过溶液交换消除基质影响减少暴露于过高或过低酸碱度溶液的时间在某些特定方法中，自由巯基会导致分析方法造成的杂质这些都是要设法避免方法开发考虑基质（配方组成）或酸碱度变化、自由巯基的出现等，8方法开发考虑1.生物学活性：是反映生物技术药物质量的重要指标，通常使用细胞或动物进行测定，误差相对较大。不同批细胞、血清、或其它易变性物质对测定方法的准确度和精密性均有影响。2.生物技术药物多为生物大分子药物，具有分子量大、结构多样性和可变性等特点，结构的细微变化可影响药物的活性和质量。3.对酸、碱、高温、冻融等不稳定，保存、运输条件不当会影响药品质量，并可能导致方法转移困难或失败。4.标准物质：活性标准品、含量标准品、理化对照品，根据情况可能分别制备，保存、运输条件相对较高，需对其稳定性进行认真分析与评价。方法开发考虑1.生物学活性：是反映生物技术药物质量的重要指9方法哪里来标准方法（或正式方法、法定方法）一般是指已有国家标准的质控方法，WHO推荐的质控方法也可作为重要参考。此类方法在被确定为标准方法前已经过了适当的验证。申报者应说明方法的来源，并附具体方法。研制单位在首次采用此类方法前，也应对该方法进行适当的验证，如进行专属性和精密度的验证，以便证明在实际的使用条件下该方法也是适用的。标准方法的替代方法此类方法系指由申报者提出的可取代标准方法的替代方法。申报者在决定采用此类方法时应持慎重的态度，并需提供表明新方法等同于或优于原方法的依据以及全面的验证资料，包括两种方法的比较性资料。来自参考文献的方法是指在专业杂志或著作上发表并介绍的方法，一般要认真对待此类方法，并需进行全面的验证。应说明参考文献的出处，附原文及译文。自己建立的方法对于某些产品，尤其是创新性产品来讲，由于缺少可参考的方法，通常需要自己建立一种新的分析方法，对于这类方法需进行全面而严格的验证。方法哪里来标准方法（或正式方法、法定方法）来自参考文献的方10开发什么方法适用于所有分子的方法蛋白浓度或含量紫外/可见光光度法（基于消光系数，灵敏度低，干扰物多）高效液相色谱法（基于标准样校正）BCA/TCA/G250（基于标准样校正，基质有可能干扰)电荷概括离子交换色谱（原始状态）毛细管等电聚焦法（原始状态和局部变性状态）开发什么方法适用于所有分子的方法11开发什么方法适用于所有分子的方法分子大小概况SEC（原始状态）凝胶电泳法（非折叠（变性）状态）病毒样颗粒概况电镜（局部原始状态，人为影响因素大）DLS（原始状态，分辨率差，大小精准）SEC（原始状态，流动相会影响蛋白状态）开发什么方法适用于所有分子的方法12开发什么方法适用于所有分子的方法杂质残留量HPLC（基于标准样校正或自身对照）GC（对残留溶剂）ICP/AAS（对元素测定）Elisa（宿主蛋白、杂蛋白测定）SouthernBlot/荧光光谱（残留DNA）开发什么方法适用于所有分子的方法13开发什么方法适用于特定分子的方法分子鉴定肽图（纯度较高）WesternBlot（使用范围广）紫外扫描图（纯度及基质要求高）氨基酸测序(纯度及基质要求高，样品末端无封闭）偶联密度ADC（抗体药物偶联物）抗原与载体蛋白偶联物（疫苗类药物）结合力

抗原与佐剂相互作用开发什么方法适用于特定分子的方法14开发什么方法适用于特定分子的方法活性测定Elisa（体外评价）动物实验（体内评价）中和实验（细胞测定特定表位）降解物测定HPLC/MS（基于标准样校正或自身对照）凝胶电泳（基于特异分子带）SEC/荧光光谱（解聚或聚合）开发什么方法适用于特定分子的方法15开发什么方法开发什么方法16检测方法初识——电泳及毛细管电泳检测方法初识——电泳及毛细管电泳17检测方法初识——SEC检测方法初识——SEC18检测方法初识——DAD光谱检测方法初识——DAD光谱19检测方法初识——荧光光谱检测方法初识——荧光光谱20检测方法初识——HPLC肽图检测方法初识——HPLC肽图21检测方法初识——UVCp-Temp检测方法初识——UVCp-Temp22检测方法初识——HPLC肽图睫状神经营养因子(ciliaryneurotrophicfactor,CNTF)检测方法初识——HPLC肽图睫状神经营养因子(ciliary23检测方法初识——ESI-MS检测方法初识——ESI-MS24分析方法验证——法规要求资料6.质量研究资料，临床前有效性及安全性研究资料（1）质量研究及注册标准研究资料；（2）检定方法的研究以及验证资料；（3）与同类制品比较研究资料；（4）产品抗原性、免疫原性和动物试验保护性的分析资料；（5）动物过敏试验研究资料；（6）动物安全性评价资料。分析方法验证——法规要求资料6.质量研究资料，临床前有效性及25分析方法验证——法规要求1.6探索性研究及其检验结果分析1.6.1开展探索性研究项目及其目的。叙述开展探索性研究的项目，研究目的，采用的主要方法。1.6.2探索性研究及其检验结果分析。逐项叙述探索性研究项目详细研究方法，样品与对照品的典型图谱或照片，研究结果与结论。该项目的方法学按中国药典附录验证，详细方法学验证内容在附件中列出。分析方法验证——法规要求1.6探索性研究及其检验结果分析26分析方法验证——法规要求分析方法验证——法规要求27分析方法验证——法规要求分析方法验证——法规要求28分析方法验证——法规要求第十二条质量控制的基本要求：（四）检验方法应当经过验证或确认；第二百二十三条物料和不同生产阶段产品的检验应当至少符合以下要求：（二）符合下列情形之一的，应当对检验方法进行验证：1.采用新的检验方法；2.检验方法需变更的；3.采用《中华人民共和国药典》及其他法定标准未收载的检验方法；4.法规规定的其他需要验证的检验方法。（三）对不需要进行验证的检验方法，企业应当对检验方法进行确认，以确保检验数据准确、可靠；分析方法验证——法规要求第十二条质量控制的基本要求：第二29分析方法验证——验证项目验证项目ChP鉴别试验杂质定量杂质限度活性测定含量测定准确性-+-++精密度-+-++耐用性+++++线性-+-++范围-+-++专属性+++++检测限--+--定量限-+----不强制要求+必须进行限度、鉴定等定性或半定量试验，无标准曲线，不作精密度、准确度要求。分析方法验证——验证项目验证项目鉴别试验杂质定量杂质限度活性30分析方法验证——验证项目验证项目USPI类II类III类IV类定量限度检查准确度++**-精密度++-+-专属性+++*+检测限--+*-定量限-+-*-线性++-*-范围++**--不强制要求+必须进行*根据不同的方法特点也可能需要I类方法：制剂中原料药或活性成分（包括防腐剂）的定量分析方法；II类方法：原料药中杂质或制剂中降解化合物的分析方法；包括定量方法和限度检查；III类方法：药物性能特征分析方法：溶出，药物释放IV类方法：鉴别实验分析方法验证——验证项目验证项目I类II类III类IV类31分析方法验证——验证项目参数（parameler)机构（organization）专属性/特异性（specificity）USP,EP,ChP,ICH选择性（selectivity）ISO17025精密度（precision）USP,EP,ChP,ICH重复性（repeatability）ICH,ChP,ISO17025中间精密度（intermediateprecision）ICH,ChP重现性（reproducibility）USP,ChP,ICH,ISO17025准确度（accuracy）USP,EP,ChP,ICH,ISO17025线性（linearity）USP,EP,ChP,ICH,ISO17025范围（range）USP,ChP,ICH检测限（detectionlimit）USP,EP,ChP,ICH,ISO17025定量限（quantitationlimit）USP,EP,ChP,ICH,ISO17025耐用性（robustness）USP,EP,ChP,ISO17025分析方法验证——验证项目参数（parameler)机构（or32定义：指一种方法在有可能的干扰物质（如杂质、降解产物和基质）存在时，能够准确无误地评估被分析物的能力分析方法验证——专属性鉴别:确保可以鉴别被分析物纯度检查：确保所有的分析过程能够为杂质的含量提供准确的数据，如相关物质检查、重金属限度检查、有机挥发性杂质检查等含量测定：提供准确的检测结果以保证含量样品中被分析物的含量或效价值准确无误定义：指一种方法在有可能的干扰物质（如杂质、降解产物和基质）33在其他成分（杂质、降解产物、辅料等）存在下，采用的分析方法能够正确测定被测物的能力。作为分析方法的成立基础。一般采用相似物、不含API空白样品作为阴性对照，以标准品或经认可样品作为阳性对照。如采用免疫印迹试验进行生物制品的鉴别，应首先对所使用抗体的特异性进行分析；若供试品中还存在其它组分，则应进一步验证被检测物中其它物质能否引起非特异性免疫反应。例如：如采用细胞测定方法检测生物活性，应首先说明被测物质与特定的细胞应答之间的相关性，如二者的相关性较好，则一般认为该方法的特异性较好。为表明细胞测定方法的特异性，可进行相关试验进行验证，如加入抗体或特异抑制剂的封闭实验等。如果成品中加入了可能影响活性测定的辅料，应进行相关验证以排除此种影响。如采用ELISA法检测重组产品的残余宿主蛋白含量，可采用与表达体系相同的宿主细胞的蛋白作为免疫原制备抗体，若采用与产品相似工艺进行处理后再免疫动物，则所获得抗体的特异性更好。另外，产品中存在的大量目的蛋白可能影响残余宿主蛋白的测定，应进行相关验证以排除此种影响。分析方法验证——专属性在其他成分（杂质、降解产物、辅料等）存在下，采用的分析方法能34定性分析（鉴别）：样品阳性结果＋空白阴性结果＋结构相似物质的阴性结果；分析方法验证——专属性杂质检查（对照品可得）：将可能的杂质对照品加入样品中；杂质检查（对照品不可得）：用另外一种官方的标准或经验证的方法对样品和经降解的样品分析，比较两种方法得到的杂质概况使用其他技术对峰纯度进行检查，如二极管阵列检测器、MS等含量测定：被分析物与其他干扰峰完成分离。向样品中加入一定量的干扰物，含量测定的结果不受干扰；检查主峰的纯度鉴别：采用与被测物结构类似的化合物以及被测物分别进行鉴别试验。被测物为正反应。被测物结构类似的化合物为负反应。测物结构类似的化合物可选用中间体、副产物或降解产物等。定性分析（鉴别）：样品阳性结果＋空白阴性结果＋结构相似物质的35定义：对均一样品重复取样检测每个检测结果间的接近程度，RSD%,CV%分析方法验证——精密度重复性repeatability：短时间内同一分析人员使用同一仪器中间精密度intermediateprecision:在同一实验室内的变化，如不同分析时间、不同分析人员、不同分析仪器重现性reproducibility:在不同实验室内重复方法100％浓度≥6次3浓度×3次定义：对均一样品重复取样检测每个检测结果间的接近程度，RSD36定义：方法的检测结果与真实值的接近程度。分析方法验证——准确度－方法：原料药：分析已知含量的对照品；第二种确定的方法分析，结果比较制剂：加样回收；第二种确定的方法分析，结果比较应在方法的范围内计算回收率：3浓度×3次定义：方法的检测结果与真实值的接近程度。分析方法验证——准确37分析方法验证——精密度与准确度分析方法验证——精密度与准确度38定义：在声明的实验条件下所能检测到的被分析物的最小量。限度检查的指标；表示为在样品中的浓度％,ppm分析方法验证——检测限方法：检测已知浓度的样品(对照品)杂质的DL<0.05%信噪比2:1/3:1定义：在声明的实验条件下所能检测到的被分析物的最小量。限度检39分析方法验证——定量限定义：在声明的实验条件下被分析物可被定量分析并能满足合格的精密度和准确度的最小值。微量物质的定量分析：有关物质定量分析，有机挥发性物质的定量分析。％，ppm方法：已知浓度样品（对照品）相关物质<0.05％证明精密度和准确度信噪比10:1分析方法验证——定量限定义：在声明的实验条件下被分析物可被定40分析方法验证——标准曲线及线性范围标准曲线：一定浓度范围内，仪器对分析物的响应，可通过一定浓度的分析物（或内标物）与被分析物比较，计算其含量。基质应尽可能保持与样品一致，但不应参与样品前处理工序。因为样品前处理工序中，可能有不同程度的损失。若在任何转换后均不能证明呈线性，或呈线性关系的范围较小，可以采用曲线拟合方法，通过测定全范围曲线，在标准品或参考品的矫正下，依ED50或IC50值计算活性单位。应提供拟合曲线方程及各参数，并提供相关系数。线性范围：在适当的精密度、准确度和线性基础上检测到的被分析物的最低水平到最高水平区间分析方法验证——标准曲线及线性范围标准曲线：一定浓度范围内，41分析方法验证——标准曲线及线性范围一定范围内的不同浓度点进样，绘制响应值（y）与浓度(x)之间的回归线，计算回归方程，相关系数（r,r2）主成分含量测定：80％－120％检测浓度杂质含量测定：定量限（50％）－120％标准装量差异：70％－130％检测值溶出实验：±20％规定范围分析方法验证——标准曲线及线性范围一定范围内的不同浓度点进样42分析方法验证——标准曲线样品吸收值为：1.314测定值为：869.3μg/ml若标准曲线处理后，出现2%的损耗，则

测定值为：910.6μg/ml测定值为：4.75%分析方法验证——标准曲线样品吸收值为：1.314测定值为：843分析方法验证——耐用性定义：分析方法的某些参数发生微小变化时方法抗干扰的能力，表示在正常使用时的可靠性方法：刻意改变参数，考察结果的变化流动相的pH值、流动相的组成（极性的变化）、不同供应商柱子、柱温、流速等液相：评估柱温、流速、色谱柱、缓冲盐pH、有机相比例、流动相比例、溶液放置时间对检测结果的影响气相：评估柱温、流速、色谱柱、溶液放置时间对检测结果的影响分析方法验证——耐用性定义：分析方法的某些参数发生微小变化时44分析方法验证——SEC基本要求确定无标准品，假设单体、聚合物或VLP在214nm/280nm响应因子基本相同，以峰面积百分比代表重量百分比有标准品，进标准品，测定各自响应因子，以校正峰面积百分比代表重量百分比对于蛋白样品而言，214nm肽键特异波长段响应值高，280nm为蛋白特异波长段响应值低。通常以280nm作为检测波长。要求能够对样品不同聚集、结合状态进行分离。分析方法验证——SEC基本要求确定45分析方法验证——SEC系统精密度将加入了5%聚合物的单个样品连续进样6次，计算6次进样的聚合物峰面积的相对标准偏差(RSD)值方法精密度和中间精密度

使用分别由两位分析人员制备的加入了浓度为2.5%、5.0%和7.5%聚合物的各三份重复样品(总共18份配制液)方法精密度是三份重复样品的最大相对标准偏差(RSD)值中间精密度是所有样品的相对标准偏差(RSD)值分析方法验证——SEC系统精密度方法精密度和中间精密度46分析方法验证——SEC线性及范围使用1.0%、2.5%、3.7%、5.0%、6.3%、7.5%和9.0%聚合物的样品计算聚合物%与聚合物峰面积的线性回归准确度使用1.0%、2.5%、3.7%、5.0%、6.3%、7.5%和9.0%聚合物的样品根据高纯度单体样品中的单体和聚合物含量、聚合物富集样品中的单体和聚合物含量以及加样中所用的体积来计算加样样品中的理论预期聚合物含量分析方法验证——SEC线性及范围准确度47分析方法验证——SEC红线：药源；蓝线：空白；黑线：稀释液专属性分析方法验证——SEC红线：药源；蓝线：空白；黑线：稀释48分析方法验证——SEC验证数据验证参数验收标准精密度系统精密度RSD≤3%方法精密度RSD≤3%中间精密度RSD≤5%专属性单体、聚合物色谱峰充分分离，空白和稀释液不干扰色谱峰线性R>0.99范围2.5%-7.5%准确度85%~115%定量限≤2.5%耐用性流动相pH±0.5、缓冲盐±5%内、同填料同厂家色谱柱，色谱分离无异常分析方法验证——SEC验证数据验证参数验收标准精密度系统精密49分析方法验证——报告部分第二百二十三条

物料和不同生产阶段产品的检验应当至少符合以下要求（六）检验记录应当至少包括以下内容1.产品或物料的名称、剂型、规格、批号或供货批号，必要时注明供应商和生产商（如不同）的名称或来源；2.依据的质量标准和检验操作规程；3.检验所用的仪器或设备的型号和编号；4.检验所用的试液和培养基的配制批号、对照品或标准品的来源和批号；5.检验所用动物的相关信息；6.检验过程，包括对照品溶液的配制、各项具体的检验操作、必要的环境温湿度；7.检验结果，包括观察情况、计算和图谱或曲线图，以及依据的检验报告编号；8.检验日期；9.检验人员的签名和日期；10.检验、计算复核人员的签名和日期。（七）所有中间控制（包括生产人员所进行的中间控制），均应当按照经质量管理部门批准的方法进行，检验应当有记录；（八）应当对实验室容量分析用玻璃仪器、试剂、试液、对照品以及培养基进行质量检查；分析方法验证——报告部分第二百二十三条物料和不同生产阶段50分析方法确认——适用范围适用于药典方法和其他已验证的法定标准。因为药典方法和其他法定标准被认为是验证过的分析方法，不需要验证，但需要通过方法确认来证明方法在该实验室条件下的适应性。分析方法确认——适用范围适用于药典方法和其他已验证的法定标准51分析方法确认——操作方式对于方法确认，通常采用两种方式：一、由两名检验人员分别独立对同一批产品进行检验（如可能使用不同的仪器）比较两人的检测结果来证明方法在本实验室（人员，分析仪器，试剂）的适用性；二、根据验证目的和评估结果选择相关项目进行确认：（具体见下表）检验项目准确度精密度专属性检测限定量限线性范围耐用性原料药鉴别--±-----有关物质-±+-+---含量测定-±±-----制剂鉴别--+-----溶出度±++-±---有关物质±++-+---含量测定±++------表示该项内容不需要确认；+表示该项内容需要确认；±表示该项内容视情况评估是否需要确认分析方法确认——操作方式对于方法确认，通常采用两种方式：检验52分析方法再验证在某些情况下，如原料药合成工艺改变、制剂处方改变、分析方法发生部分改变等，均有必要对分析方法再次进行部分或完整的再验证，以保证分析方法可靠当原料药合成工艺发生改变时，可能引入新的杂质，杂质检查方法和含量测定方法的专属性就需要再进行验证，以证明有关物质检查方法能够检测新引入的杂质，且新引入的杂质对主成份的含量测定应无干扰。当制剂的处方组成改变、辅料变更时，可能会影响鉴别的专属性、溶出度和含量测定的准确度，因此需要对鉴别、含量测定方法再验证。当原料药产地来源发生变更时，可能会影响杂质检查和含量测定的专属性和准确度，因此需要对杂质检查方法和含量测定方法进行再验证。再验证原则：根据改变的程度进行相应的再验证。当这种改变到达一定程度时，则需要完整的验证。如分析方法完全改变时，则应视为新方法并需要完整的验证。方法再验证是对分析方法的完善过程，应根据实际改变情况进行再验证，从而保证所采用的分析方法能够控制药品的内在质量。分析方法再验证在某些情况下，如原料药合成工艺改变、制剂处方改53药品分析方法建立及验证_从质量控制出发课件54推荐推荐55推荐推荐56推荐推荐57推荐推荐58药品分析方法建立及验证——从质量控制出发2016.03.23健康元生物医药有限公司药品分析方法建立及验证2016.03.23健康元生物医药有限59目录

方法开发考虑方法哪里来开发什么方法

检测方法初识

分析方法验证分析方法确认及再验证目录方法开发考虑方法哪里来开发什么方法检测方法初识分析60方法考虑原则预期的监督机构期望产品质量参数对安全性和有效性的预期影响分子的具体开发经验来自之前以开发的类似分子的平台经验方法考虑原则预期的监督机构期望61方法开发考虑折叠结构可以防止生物制品降解，但同时使分子的某些部分难以被检测到被结构所保护的易受影响基团延缓了降解过程（氧化、脱酰胺基、切断和聚合）完整结构使得分析方法很难检测到内部的变化在某些分析中保持三维结构是很重要的（如SEC），但在其他一些分析中则需拆开折叠结构（如变性凝胶电泳）方法开发考虑折叠结构可以防止生物制品降解，但同时使分子的某些62方法开发考虑如何解释不是针对完整分子而是针对裂解部分所进行的检测而获得的数据有时有必要将一个蛋白分子裂解为所需的片段，然后对所关注的片段进行分析，如用于蛋氨酸氧化测定肽图多数时候片段并非以简单直接或线性的方式与完整分子相关联（不再是1：1）需要明确地确定完整分子的片段进行分析而得到的某些参数的报告值方法开发考虑如何解释不是针对完整分子而是针对裂解部分所进行的63方法开发考虑从不同正交试验或从主要和辅助试验所得的杂质量并不是可以累加的生物制品需要多项检测来检量其多种特性，如电荷、分子大小等如果一个分子包含多种修饰，则它将被多次计算，但是降解的分子仍然只有一个所以不同检测所得到的值是不能累加的方法开发考虑从不同正交试验或从主要和辅助试验所得的杂质量并不64方法开发考虑对于所要分析的蛋白质物种，通常无法获得纯的样品用来进行加样/回收的物质是所要分析的蛋白质物种（杂质）的富集物，而不是纯化物很多时候，峰并不能达到基线分离可容许实验误差较大定量限较高方法开发考虑对于所要分析的蛋白质物种，通常无法获得纯的样品很65方法开发考虑基质（配方组成）或酸碱度变化、自由巯基的出现等，可能在分析过程中形成原来并不存在的杂质通过溶液交换消除基质影响减少暴露于过高或过低酸碱度溶液的时间在某些特定方法中，自由巯基会导致分析方法造成的杂质这些都是要设法避免方法开发考虑基质（配方组成）或酸碱度变化、自由巯基的出现等，66方法开发考虑1.生物学活性：是反映生物技术药物质量的重要指标，通常使用细胞或动物进行测定，误差相对较大。不同批细胞、血清、或其它易变性物质对测定方法的准确度和精密性均有影响。2.生物技术药物多为生物大分子药物，具有分子量大、结构多样性和可变性等特点，结构的细微变化可影响药物的活性和质量。3.对酸、碱、高温、冻融等不稳定，保存、运输条件不当会影响药品质量，并可能导致方法转移困难或失败。4.标准物质：活性标准品、含量标准品、理化对照品，根据情况可能分别制备，保存、运输条件相对较高，需对其稳定性进行认真分析与评价。方法开发考虑1.生物学活性：是反映生物技术药物质量的重要指67方法哪里来标准方法（或正式方法、法定方法）一般是指已有国家标准的质控方法，WHO推荐的质控方法也可作为重要参考。此类方法在被确定为标准方法前已经过了适当的验证。申报者应说明方法的来源，并附具体方法。研制单位在首次采用此类方法前，也应对该方法进行适当的验证，如进行专属性和精密度的验证，以便证明在实际的使用条件下该方法也是适用的。标准方法的替代方法此类方法系指由申报者提出的可取代标准方法的替代方法。申报者在决定采用此类方法时应持慎重的态度，并需提供表明新方法等同于或优于原方法的依据以及全面的验证资料，包括两种方法的比较性资料。来自参考文献的方法是指在专业杂志或著作上发表并介绍的方法，一般要认真对待此类方法，并需进行全面的验证。应说明参考文献的出处，附原文及译文。自己建立的方法对于某些产品，尤其是创新性产品来讲，由于缺少可参考的方法，通常需要自己建立一种新的分析方法，对于这类方法需进行全面而严格的验证。方法哪里来标准方法（或正式方法、法定方法）来自参考文献的方68开发什么方法适用于所有分子的方法蛋白浓度或含量紫外/可见光光度法（基于消光系数，灵敏度低，干扰物多）高效液相色谱法（基于标准样校正）BCA/TCA/G250（基于标准样校正，基质有可能干扰)电荷概括离子交换色谱（原始状态）毛细管等电聚焦法（原始状态和局部变性状态）开发什么方法适用于所有分子的方法69开发什么方法适用于所有分子的方法分子大小概况SEC（原始状态）凝胶电泳法（非折叠（变性）状态）病毒样颗粒概况电镜（局部原始状态，人为影响因素大）DLS（原始状态，分辨率差，大小精准）SEC（原始状态，流动相会影响蛋白状态）开发什么方法适用于所有分子的方法70开发什么方法适用于所有分子的方法杂质残留量HPLC（基于标准样校正或自身对照）GC（对残留溶剂）ICP/AAS（对元素测定）Elisa（宿主蛋白、杂蛋白测定）SouthernBlot/荧光光谱（残留DNA）开发什么方法适用于所有分子的方法71开发什么方法适用于特定分子的方法分子鉴定肽图（纯度较高）WesternBlot（使用范围广）紫外扫描图（纯度及基质要求高）氨基酸测序(纯度及基质要求高，样品末端无封闭）偶联密度ADC（抗体药物偶联物）抗原与载体蛋白偶联物（疫苗类药物）结合力

抗原与佐剂相互作用开发什么方法适用于特定分子的方法72开发什么方法适用于特定分子的方法活性测定Elisa（体外评价）动物实验（体内评价）中和实验（细胞测定特定表位）降解物测定HPLC/MS（基于标准样校正或自身对照）凝胶电泳（基于特异分子带）SEC/荧光光谱（解聚或聚合）开发什么方法适用于特定分子的方法73开发什么方法开发什么方法74检测方法初识——电泳及毛细管电泳检测方法初识——电泳及毛细管电泳75检测方法初识——SEC检测方法初识——SEC76检测方法初识——DAD光谱检测方法初识——DAD光谱77检测方法初识——荧光光谱检测方法初识——荧光光谱78检测方法初识——HPLC肽图检测方法初识——HPLC肽图79检测方法初识——UVCp-Temp检测方法初识——UVCp-Temp80检测方法初识——HPLC肽图睫状神经营养因子(ciliaryneurotrophicfactor,CNTF)检测方法初识——HPLC肽图睫状神经营养因子(ciliary81检测方法初识——ESI-MS检测方法初识——ESI-MS82分析方法验证——法规要求资料6.质量研究资料，临床前有效性及安全性研究资料（1）质量研究及注册标准研究资料；（2）检定方法的研究以及验证资料；（3）与同类制品比较研究资料；（4）产品抗原性、免疫原性和动物试验保护性的分析资料；（5）动物过敏试验研究资料；（6）动物安全性评价资料。分析方法验证——法规要求资料6.质量研究资料，临床前有效性及83分析方法验证——法规要求1.6探索性研究及其检验结果分析1.6.1开展探索性研究项目及其目的。叙述开展探索性研究的项目，研究目的，采用的主要方法。1.6.2探索性研究及其检验结果分析。逐项叙述探索性研究项目详细研究方法，样品与对照品的典型图谱或照片，研究结果与结论。该项目的方法学按中国药典附录验证，详细方法学验证内容在附件中列出。分析方法验证——法规要求1.6探索性研究及其检验结果分析84分析方法验证——法规要求分析方法验证——法规要求85分析方法验证——法规要求分析方法验证——法规要求86分析方法验证——法规要求第十二条质量控制的基本要求：（四）检验方法应当经过验证或确认；第二百二十三条物料和不同生产阶段产品的检验应当至少符合以下要求：（二）符合下列情形之一的，应当对检验方法进行验证：1.采用新的检验方法；2.检验方法需变更的；3.采用《中华人民共和国药典》及其他法定标准未收载的检验方法；4.法规规定的其他需要验证的检验方法。（三）对不需要进行验证的检验方法，企业应当对检验方法进行确认，以确保检验数据准确、可靠；分析方法验证——法规要求第十二条质量控制的基本要求：第二87分析方法验证——验证项目验证项目ChP鉴别试验杂质定量杂质限度活性测定含量测定准确性-+-++精密度-+-++耐用性+++++线性-+-++范围-+-++专属性+++++检测限--+--定量限-+----不强制要求+必须进行限度、鉴定等定性或半定量试验，无标准曲线，不作精密度、准确度要求。分析方法验证——验证项目验证项目鉴别试验杂质定量杂质限度活性88分析方法验证——验证项目验证项目USPI类II类III类IV类定量限度检查准确度++**-精密度++-+-专属性+++*+检测限--+*-定量限-+-*-线性++-*-范围++**--不强制要求+必须进行*根据不同的方法特点也可能需要I类方法：制剂中原料药或活性成分（包括防腐剂）的定量分析方法；II类方法：原料药中杂质或制剂中降解化合物的分析方法；包括定量方法和限度检查；III类方法：药物性能特征分析方法：溶出，药物释放IV类方法：鉴别实验分析方法验证——验证项目验证项目I类II类III类IV类89分析方法验证——验证项目参数（parameler)机构（organization）专属性/特异性（specificity）USP,EP,ChP,ICH选择性（selectivity）ISO17025精密度（precision）USP,EP,ChP,ICH重复性（repeatability）ICH,ChP,ISO17025中间精密度（intermediateprecision）ICH,ChP重现性（reproducibility）USP,ChP,ICH,ISO17025准确度（accuracy）USP,EP,ChP,ICH,ISO17025线性（linearity）USP,EP,ChP,ICH,ISO17025范围（range）USP,ChP,ICH检测限（detectionlimit）USP,EP,ChP,ICH,ISO17025定量限（quantitationlimit）USP,EP,ChP,ICH,ISO17025耐用性（robustness）USP,EP,ChP,ISO17025分析方法验证——验证项目参数（parameler)机构（or90定义：指一种方法在有可能的干扰物质（如杂质、降解产物和基质）存在时，能够准确无误地评估被分析物的能力分析方法验证——专属性鉴别:确保可以鉴别被分析物纯度检查：确保所有的分析过程能够为杂质的含量提供准确的数据，如相关物质检查、重金属限度检查、有机挥发性杂质检查等含量测定：提供准确的检测结果以保证含量样品中被分析物的含量或效价值准确无误定义：指一种方法在有可能的干扰物质（如杂质、降解产物和基质）91在其他成分（杂质、降解产物、辅料等）存在下，采用的分析方法能够正确测定被测物的能力。作为分析方法的成立基础。一般采用相似物、不含API空白样品作为阴性对照，以标准品或经认可样品作为阳性对照。如采用免疫印迹试验进行生物制品的鉴别，应首先对所使用抗体的特异性进行分析；若供试品中还存在其它组分，则应进一步验证被检测物中其它物质能否引起非特异性免疫反应。例如：如采用细胞测定方法检测生物活性，应首先说明被测物质与特定的细胞应答之间的相关性，如二者的相关性较好，则一般认为该方法的特异性较好。为表明细胞测定方法的特异性，可进行相关试验进行验证，如加入抗体或特异抑制剂的封闭实验等。如果成品中加入了可能影响活性测定的辅料，应进行相关验证以排除此种影响。如采用ELISA法检测重组产品的残余宿主蛋白含量，可采用与表达体系相同的宿主细胞的蛋白作为免疫原制备抗体，若采用与产品相似工艺进行处理后再免疫动物，则所获得抗体的特异性更好。另外，产品中存在的大量目的蛋白可能影响残余宿主蛋白的测定，应进行相关验证以排除此种影响。分析方法验证——专属性在其他成分（杂质、降解产物、辅料等）存在下，采用的分析方法能92定性分析（鉴别）：样品阳性结果＋空白阴性结果＋结构相似物质的阴性结果；分析方法验证——专属性杂质检查（对照品可得）：将可能的杂质对照品加入样品中；杂质检查（对照品不可得）：用另外一种官方的标准或经验证的方法对样品和经降解的样品分析，比较两种方法得到的杂质概况使用其他技术对峰纯度进行检查，如二极管阵列检测器、MS等含量测定：被分析物与其他干扰峰完成分离。向样品中加入一定量的干扰物，含量测定的结果不受干扰；检查主峰的纯度鉴别：采用与被测物结构类似的化合物以及被测物分别进行鉴别试验。被测物为正反应。被测物结构类似的化合物为负反应。测物结构类似的化合物可选用中间体、副产物或降解产物等。定性分析（鉴别）：样品阳性结果＋空白阴性结果＋结构相似物质的93定义：对均一样品重复取样检测每个检测结果间的接近程度，RSD%,CV%分析方法验证——精密度重复性repeatability：短时间内同一分析人员使用同一仪器中间精密度intermediateprecision:在同一实验室内的变化，如不同分析时间、不同分析人员、不同分析仪器重现性reproducibility:在不同实验室内重复方法100％浓度≥6次3浓度×3次定义：对均一样品重复取样检测每个检测结果间的接近程度，RSD94定义：方法的检测结果与真实值的接近程度。分析方法验证——准确度－方法：原料药：分析已知含量的对照品；第二种确定的方法分析，结果比较制剂：加样回收；第二种确定的方法分析，结果比较应在方法的范围内计算回收率：3浓度×3次定义：方法的检测结果与真实值的接近程度。分析方法验证——准确95分析方法验证——精密度与准确度分析方法验证——精密度与准确度96定义：在声明的实验条件下所能检测到的被分析物的最小量。限度检查的指标；表示为在样品中的浓度％,ppm分析方法验证——检测限方法：检测已知浓度的样品(对照品)杂质的DL<0.05%信噪比2:1/3:1定义：在声明的实验条件下所能检测到的被分析物的最小量。限度检97分析方法验证——定量限定义：在声明的实验条件下被分析物可被定量分析并能满足合格的精密度和准确度的最小值。微量物质的定量分析：有关物质定量分析，有机挥发性物质的定量分析。％，ppm方法：已知浓度样品（对照品）相关物质<0.05％证明精密度和准确度信噪比10:1分析方法验证——定量限定义：在声明的实验条件下被分析物可被定98分析方法验证——标准曲线及线性范围标准曲线：一定浓度范围内，仪器对分析物的响应，可通过一定浓度的分析物（或内标物）与被分析物比较，计算其含量。基质应尽可能保持与样品一致，但不应参与样品前处理工序。因为样品前处理工序中，可能有不同程度的损失。若在任何转换后均不能证明呈线性，或呈线性关系的范围较小，可以采用曲线拟合方法，通过测定全范围曲线，在标准品或参考品的矫正下，依ED50或IC50值计算活性单位。应提供拟合曲线方程及各参数，并提供相关系数。线性范围：在适当的精密度、准确度和线性基础上检测到的被分析物的最低水平到最高水平区间分析方法验证——标准曲线及线性范围标准曲线：一定浓度范围内，99分析方法验证——标准曲线及线性范围一定范围内的不同浓度点进样，绘制响应值（y）与浓度(x)之间的回归线，计算回归方程，相关系数（r,r2）主成分含量测定：80％－120％检测浓度杂质含量测定：定量限（50％）－120％标准装量差异：70％－130％检测值溶出实验：±20％规定范围分析方法验证——标准曲线及线性范围一定范围内的不同浓度点进样100分析方法验证——标准曲线样品吸收值为：1.314测定值为：869.3μg/ml若标准曲线处理后，出现2%的损耗，则

测定值为：910.6μg/ml测定值为：4.75%分析方法验证——标准曲线样品吸收值为：1.314测定值为：8101分析方法验证——耐用性定义：分析方法的某些参数发生微小变化时方法抗干扰的能力，表示在正常使用时的可靠性方法：刻意改变参数，考察结果的变化流动相的pH值、流动相的组成（极性的变化）、不同供应商柱子、柱温、流速等液相：评估柱温、流速、色谱柱、缓冲盐pH、有机相比例、流动相比例、溶液放置时间对检测结果的影响气相：评估柱温、流速、色谱柱、溶液放置时间对检测结果的影响分析方法验证——耐用性定义：分析方法的某些参数发生微小变化时102分析方法验证——SEC基本要求确定无标准品，假设单体、聚合物或VLP在214nm/280nm响应因子基本相同，以峰面积百分比代表重量百分比有标准品，进标准品，测定各自响应因子，以校正峰面积百分比代表重量百分比对于蛋白样品而言，214nm肽键特异波长段响应值高，280nm为蛋白特异波长段响应值低。通常以280nm作为检测波长。要求能够对样品不同聚集、结合状态进行分离。分析方法验证——SEC基本要求确定103分析方法验证——SEC系统精密度将加入了5%聚合物的单个样品连续进样6次，计算6次进样的聚合物峰面积的相对标准偏差(RSD)值方法精密度和中间精密度

使用分别由两位分析人员制备的加入了浓度为2.5%、5.0%和7.5%聚合物的各三份重复样品(总共18份配制液)方法精密度是三份重复样品的最大相对标准偏差(RSD)值中间精密度是所有样品的相对标准偏差(RSD)值分析方法验证——SEC系统精密度方法精密度和中间精密度104分析方法验证——SEC线性及范围使用1.0%、2.5%、3.7%、5.0%、6.3%、7.5%