临床微生物学和微生物学检验

抗菌药物敏感性试验

南华大学预防医学与放射卫生实验教学中心教学对象：高等医学院校卫生检验专业学生实验课时：4学时课程类型：专业实验课课程要求：必修每组人数：2人实验目的和要求掌握纸片扩散法（K－B法）的原理、操作方法等、结果判断、意义及质量控制；熟悉肉汤稀释法抗生素敏感性试验的原理、操作方法、结果判断及意义等；了解稀释法的质量控制。实验内容常用抗菌药物敏感性试验与耐药检测方法介绍。纸片扩散法。肉汤稀释法。

一、常用抗菌药物敏感性试验与耐药检测方法介绍纸片扩散法（Kirby-Bauertest）稀释法（dilutiontest）E试验法（Etest）联合药物敏感试验特殊耐药菌及耐药酶的表型检测耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）的检测β-内酰胺酶、超广谱β-内酰胺酶检测等二、纸片扩散法（K-B法）

原理：含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌生长被抑制，形成透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑制浓度（minimalinhibitoryconcentration，MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。抑菌圈

含药纸片

方法：菌液制备：挑取孵育16-24h的血平板上数个菌落置于生理盐水管中，校正浓度至0.5麦氏标准；涂布接种：无菌棉拭蘸取菌液，在试管壁旋转挤去多余菌液后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60º，最后沿平板内缘涂抹1周；贴含药纸片：平板在室温下干燥3-5min，用无菌镊子将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心相距应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm；孵育：35ºC16-18h，量取抑菌圈直径。结果判读：用刻度尺量取抑菌圈直径，根据CLSI（ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute）标准判读结果；报告：细菌对该抗生素是敏感（susceptible，S）；耐药（resistant，R）；还是中介（intermediate，I）。表1金金黄黄色色葡葡萄萄球球菌菌抗抗菌菌药药物物敏敏感感性性试试验验评评价价结结果果抗菌药物纸片含药量抑菌圈直径(mm)相应MIC值(μg/ml)耐药中介敏感耐药敏感青霉素10U≤28—≥29β-内酰胺酶≤0.12苯唑西林1μg≤1011～12≥13≥4≤2万古霉素30μg——≥15—≤4庆大霉素10μg≤1213～14≥15≥8≤4红霉素15μg≤1314～22≥23≥8≤0.5克林霉素2μg≤1415～20≥21≥4≤0.5磺胺药1.25/23.75μg≤1011～15≥16≥8/152≤2/38三、、肉肉汤汤稀稀释释法法原理理：：以水水解解酪酪蛋蛋白白（（MH））液液体体培培养养基基将将抗抗生生素素做做不不同同浓浓度度的的稀稀释释，，然然后后种种入入待待检检细细菌菌，，定定量量测测定定抗抗菌菌药药物物对对被被测测菌菌的的最最低低抑抑菌菌浓浓度度（（MIC））或或最最低低杀杀菌菌浓浓度度（（MBC））。。方法法：：试管管编编号号：取取26只只试试管管排排成成两两排排（（测测试试菌菌排排，，质质控控菌菌排排））每每排排13支支编编号号。。另另取取3支支试试管管，，分分别别标标记记上上““肉肉汤汤对对照照””、、““测测试试菌菌生生长长对对照照””和和““质质控控菌菌生生长长对对照照””等等对对照照。。抗菌菌药药物物稀稀释释：用用MH肉肉汤汤倍倍比比稀稀释释抗抗菌菌药药物物至至13管管，，稀稀释释后后使使每每管管含含抗抗菌菌药药物物稀稀释释液液2ml。。肉汤对对照、、测试试菌生生长对对照、、质控控菌生生长对对照管管：分分别加加入MH肉肉汤2ml。方法：：菌液制制备：生理理盐水水校正正测试试菌和和质控控菌至至0.5麦麦氏比比浊标标准，，再用用MH肉汤汤稀释释到107CFU/ml；；加菌液液：用微微量加加样器器取0.1ml稀释释菌液液由低低到高高加于于各排排试管管中，，其最最终的的接种种量为为5××105CFU/ml。。测试试菌排排、测测试菌菌生长长对照照管加加测试试菌液液；质质控菌菌排、、质控控菌生生长对对照管管加质质控菌菌液。。孵育：35ººC24h观观察结结果。。结果：：测试菌菌（或或质控控菌））不出出现肉肉眼可可见生生长的的最低低药物物浓度度为该该药对对测试试菌（（质控控菌））的MIC。注意事事项：：培养基基、接接种细细菌的的菌量量、抗抗菌药药物纸纸片的的质量量、孵孵育温温度和和观察察时间间、操操作是是否规规范等等均能能影响响本试试验的的结果果。为保证证结果果的可可靠性性，需需同时时采用用相应应标准准菌株株同时时进行行药敏敏试验验作为为质量量控制制的方方式。。