2012-贵州大学-酶工程

第一章酶工程（enzymeengineering）是从应用的目的出发研究酶，是在一定生物反应装置中利用酶的催化性质，将相应原料转化成有用物质的技术，是生物工程的重要组成部分。由4个部分组成：酶的产生；酶的分离纯化；酶的固定化；生物反应器。酶的结构特点一级结构（肽链结构，指多肽链中的氨基酸排列顺序）二级结构（多肽链主链骨架盘绕折叠形成的有规律性的结构）超二级结构（相邻二级结构的聚集体）结构域（在空间上可明显区分的、相对独立的区域性结构）三级结构（球状蛋白质中所右原子在空间中的相对位置）四级结构（亚基聚合体）酶的活性中心常为酶分子的凹穴。此处常为非极性或疏水性的氨基酸残基。疏水区域的特点是介电常数低，并排出极性高的水分子???酶的作用机制学说？蛋白质的大规模分离纯化（一）蛋白质的来源及释放对于大规模纯化来说，还是以微生物作为来源为好，这是因为微生物含有很多哺乳动物中没有的有用蛋白质和酶制品，而且可以采用微生物遗传较容易地筛选出新的高活力蛋白质和酶制品；细菌可以任何规模生产，这就保证了供应的连续性；利用遗传工程方法足可在细菌中高水平表达所需要的蛋白质和酶。胞外微生物蛋白质和酶：可以很容易从发酵液中分离出来，并能用最少的步骤纯化成便于使用的状态。它们通常是非常稳定的低分子量蛋白质。胞内的蛋白质和酶：很多有用蛋白质和酶是在胞内的，要用较复杂的技术才能纯化它们。发酵条件：随着表达水平的提高，遗传工程将对蛋白质和酶纯化产生深刻的影响。（二）分离和浓缩（1）离心；大规模纯化需要工业用连续流动离心机。（2）过滤：过滤是从细胞抽提物中除掉固体的另一种方式。然而，微生物抽提液常有凝胶化的趋向，难于用传统方法有效过滤，常发生严重堵塞，除非加大过滤面积，但这是一个花钱多的解决办法。最近一个技术上的进步是研制了涡流膜过滤法它可以代替离心法。（3双水相体系萃取法：该技术是近年涌现出来的具有工业开发潜力的各种新型分离技术之一，特别适用于直接从含有菌体等杂质的酶液中提取纯化目的酶。此法不仅可以克服离心和过滤中的限制因素，而且可使酶与多糖、核酸等可溶性杂质分离，具有一定的提纯效果，有相当的实用价值。（4）浓缩技术：发酵液或粗提液的体积往往很大，而有效蛋白质的浓度又十分低，为了更好地与后续工艺衔接，浓缩是十分必要的。常用的适于大规模操作的浓缩技术有两种：沉淀法和超滤法，这两种方法都有一定的提纯效果。沉淀法:沉淀技术，特别是使用硫酸铵的盐析法是实验室中广泛采用的方法，但容易使离心机腐蚀.超滤法：：超滤法是浓缩蛋白质溶液的标准实验室方法。常用具有单一膜的搅拌式超滤器。对于大规模浓缩有两种方法，蛋白质的粗分离材料的选择和细胞抽提液的制备材料的选择：目的蛋白质含量要高，而且容易获得细胞破碎方法及细胞抽提液的制备为了确保可溶性细胞成分全部抽提出来，（1）应当使用类似于生理条件下的缓冲液。（2）动物组织和器官要尽可能除去结缔组织和脂肪，切碎后放人捣碎机中。（3）完全破碎酵母和细菌细胞，膜蛋白的释放:膜蛋白存在于细胞膜或有关细胞器的膜上。按其所在位置大体可分为外周蛋白质和固有蛋白质两种类型胞外酶的分离:胞外酶是在微生物发酵时分泌到发酵液中的。发酵后可通过离心或过滤将菌体从发酵液中分离弃去，所得发酵清液通常要适当浓缩，然后再作进一步纯化。目前常用的浓缩方法是超滤法。第二章天然酶的缺点：（1）各种因素均有可能使酶丧失生物活力。（2）随着反应时间的延长，反应速度会逐渐下降，反应后不能回收，只能采用分批法进行生产等。固定化酶优点：1）极易将固定化酶与底物、产物分开；2）可以反复分批反应和装柱连续反应；3）多数情况下，能够提高酶的稳定性；4）酶反应过程能够加以严格控制；5）产物中没有酶的残留，简化了提纯工艺；6）适合于多酶反应；7）增加产物的收率，提高产物的质量；8）酶的使用效率提高，成本降低。缺点：1）酶活力有损失；2）增加了成本，初始投资大；3）只能用于可溶性、小分子底物；5）胞内酶必须经过酶的分离手续。固定化酶的制备原则遵循几个基本原则：必须注意维持酶的催化活性及专一性。固定化的载体必须有一定的机械强度，不能因机械搅拌而破碎或脱落。固定化酶应有最小的空间位阻，尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量酶与载体必须结合牢固，从而使固定化酶能回收贮藏，利于反复使用。固定化酶应有最大的稳定性，所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。固定化酶成本要低，以利于工业使用各种固定化酶方法的优缺点比较比较项目吸附法结合法交联法同法物理吸附-共价键结合离枷结合制备滩易易难易固定化程度弱强中等强强活力回收率较高低高中等高载耕生可能不可能可能不可能理能费用低高低中等低底物专一性町变不变适用性酶源多广泛小:底物、药用酶固定化酶的性质（一）固定化后酶活力的变化固定化酶的活力要低于等摩尔原酶的活力的原因可能是：1）酶分子在固定化过程中，空间构象会有所变化，甚至影响了活性中心的氨基酸；2）酶分子空间自由度受到限制（空间位阻），会直接影响到活性中心对底物的定位作用；3）内扩散阻力使底物分子与活性中心的接近受阻；4）包埋时酶被高分子物质半透膜包围，大分子底物不能透过膜与酶接近。（二）固定化对酶稳定性的影响固定化酶表现在热稳定性提高2.对各种有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高。3.固定化酶对不同pH（酸度）稳定性、对蛋白酶稳定性、贮存稳定性和操作稳定性都有影响。（三）固定化酶的最适温度变化由于固定化后，酶的热稳定性提高，所以最适温度也随之提高，这是非常有利的结果。（四）固定化酶的最适pH变化酶固定化后，对底物作用的最适pH和酶活力-pH曲线常常发生偏移。曲线偏移的原因是微环境表面电荷性质的影响。用带负电荷载体（阴离子聚合物）制备的固定化酶，其最适pH较游离酶偏高，使用带正电荷的载体其最适pH向酸性偏移。评价固定化酶（细胞）的指标（一）固定化酶（细胞）的活力固定化酶（细胞）的单位：可定义为每毫克干重固定化酶（细胞）每分钟转化底物（或生产产物）的量，表示为pmol•min-1•mg-1。如是酶膜、酶管、酶板，则以单位面积的反应初速度来表示，即pmol•min-1•cm-2。固定化酶（细胞）的活力：即是固定化酶（细胞）催化某一特定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度来表示。第三章如何控制酶蛋白修饰反应的专一性试剂的选择（1）选择性地与一个氨基酸残基反应；（2）反应在酶蛋白不变性的条件下进行；标记的残基在肽中稳定，很易通过降解分离出来，进行鉴定；（3）反应的程度能用简单的技术测定。反应条件的选择（1）是不造成蛋白质的不可逆变性；（2）是有利于专一性修饰蛋白质。反应的专一性（1）利用蛋白质分子中某些基团的特殊性；（2）选择不同的反应pH；（3）利用某些产物的不稳定性；（4）亲和标记；（5）差别标记；（6）利用蛋白质状态的差异。酶蛋白侧链的修饰主要包括哪些内容？羧基的化学修饰；氨基的化学修饰；精氨酸胍基的修饰；巯基的化学修饰；组氨酸咪唑基的修饰；色氨酸吲哚基的修饰；酪氨酸残基和脂肪族羟基的修饰；甲硫氨酸甲硫基的修饰；酶的化学修饰在结构与功能研究中有何应用？研究酶空间结构2.确定氨基酸残基的功能3.测定酶分子中某种氨基酸的数量化学修饰在医药和生物技术中有何应用？酶作为生物催化剂，其高效性和专一性是其他催化剂所无法比拟的。因此，愈来愈多的酶制剂已用于疾病的诊断治疗和预防；食品发酵和化工产品的生产；环境保护和监测以及基因工程等生物技术领域。酶的表面化学修饰（1）大分子修饰（2）小分子修饰（3）交联修饰（如戊二醛、PEG）（4）固定化修饰酶分子内部修饰（1）、非催化活性基团的修饰（2）蛋白主链的修饰（3）催化活性基团的修饰（4）与辅因子相关的修饰结合定点突变的化学修饰第四章酶蛋白稳定的分子原因有哪些？（1）金属离子、底物、辅因子和其他相对分子质量配体的结合作用（2）蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂的作用（3）盐桥和氢键（4）二硫键（5）对氧化修饰敏感的氨基酸含量较低（6）氨基酸残基的坚实装配（7）疏水相互作用谈谈引起酶蛋白不可逆失活的原因和机理失aOfr务ft变1点合侑时作觥二觥）加蛾慨慷姬虬SDS,嗣一（D8M般觥新唇意M聊用神辩用⑵的麒靴伴解嬲制娘婀耕）（3）二藤我份子肥缺枚”（糊ffitt航辅场产机觥峻清pH,勰傩乳二觥物（秘需糠觥学蜥金属鼾，二觥物（漪白质遍化（硼油龊中由我应中般住魏觥某）腕失活机理iftft（7）瓣毓州健化映嬲pHrj嬲切耽成醐基敌（贼两麝序甜如*高pH（9）天冬岫翩有pH3甯酎于从融融上瞩龄礼翻牌郃离子化学修仇蟠pH屈表醐酬肩派就福MW贫白质眦虬蛾籍可SO象缺娜撤端p"机溶礼招航稳定天然酶的方法主要有哪些（1）固定化：（2）非共价修饰：1.反相胶束；2.添加剂；3.蛋白质间非共价相连；（3）化学修饰：1、可溶性大分子修饰酶；2.小分子修饰酶（4）蛋白质工程（5）酶的失活和再活化第五章非水相酶的催化作用有何优点？（1）增强难溶于水的反应物的溶解度；（2）改变反应平衡；（3）易于回收再利用；（4）增强酶的稳定性；（5）改变酶的选择性；（6）不会或很少发生微生物污染。非水酶学中的反应介质包括哪些？（1）水-有机溶剂单相系统；（2）水-有机溶剂两相系统；（3）含有表面活性剂的乳液或微乳液系统；（4）微水有机溶剂单相系统；（5）无溶剂或少溶剂反应系统；（6）超临界流体系统；（7）离子液体；（8）气相反应介质非水介质中酶催化的选择性有何特点？（1）底物特异性：酶在有机溶剂中对底物的化学结构和立体结构均有严格的选择性；（2）对映体选择性：酶识别外消旋化合物中某种构象对映体的能力；（3）位置选择性：有机溶剂中的酶催化还具有位置选择性；（4）化学键选择性。有机溶剂对酶的催化活力的影响表现在哪些方面？（1）有机溶剂对酶的结合水的影响；（2）有机溶剂对酶的影响：1、有机溶剂对酶的动态的影响2、溶剂对酶结构的影响3、溶剂对酶活性中心的影响4、酶活力和溶剂属性的定量关系模型；（3）溶剂对底物和产物的影响；（4）溶剂对酶活性和选择性的调节和控制怎样进行有机溶剂中酶活性和选择性的调控？选择性曾被看成是酶的一个固有特性，要改变其选择性，就要改变酶分子自身，比如通过定点突变。只要酶是在水中发挥作用，或者说当反应介质固定不变时，这一概念是正确的。但许多文献报道，当从一种溶剂中换到另一种溶剂中时，酶的各种选择性（包括底物选择性、区域选择性、化学选择性、对映体选择性和潜手性选择性笠）都会发生变化。第六章（1）按照模拟酶的属性，模拟酶可以分为哪些类？有何特点？答：可分为：主-客体酶模型、胶束酶模型、肽酶、抗体酶、分子印记酶模型、半合成酶，以及杂化酶和进化酶。（2）制备分子印迹聚合物的过程一般包括哪些步骤？答：①选定印记分子和单体，让他们之间充分作用；②在印记分子周围发生聚合反应；③将印记分子从聚合物中抽提出去。于是，此聚合物就产生了恰似印记分子的空间，并对印记分子产生识别能力。（3）分子印迹酶的方法主要有哪些？答：1.印记底物及其类似物。2.印记过渡态类似物。3.表面印记过渡态类似物第七章（1）抗体酶的制备方法有哪些？答：一、稳定过渡态法。二、抗体与半抗原互补法。三、熵阱法。四、多底物类似物法。五、抗体结合部位修饰法。六、蛋白质工程法。七、抗体库法。（2）抗体酶的活性部位修饰有哪两种方法？答：一、定点突变：定点突变即蛋白质工程法，用此法可以精确地改变蛋白质肽链上的任一氨基酸残基，可用来阐明其在抗体结合和催化中的作用。二、化学修饰法：修饰抗体酶可以改善抗体酶的性质，如酶活力，专一性等。第八章（1）常见的小分子核酶有哪几种？有何结构特点？答：没找到（2）根据催化能力可将核酶分为哪几类？答：剪切型核酶：这类核酶主要催化自身或异体RNA的切割，相当于核酸内切酶的作用。目前发现的剪切型核酶包括三种：①锤头型核酶②发卡型核酶③蛋白质一RNA复合酶剪接型核酶：这类核酶主要催化mRNA前体的修饰加工，切除内含子，并完成片段的拼接；主要包括组I内含子和组II内含子。（3）影响核酶活性的因素有哪些？答：1、pH值对活性的影响。2、二价金属阳离子对活性的影响。3、抗生素对活性的影响大多数为抑制效应。4、变性剂对活性的影响。5、温度对活性的影响。（4）核酶和脱氧核酶的体外筛选途径有哪几种？第九章蛋白质进化机理：进化的第一原因是基因突变。自然界中的蛋白质进化是通过遗传物质再组织而表现出各种蛋白质重排来实现的。主要形式有复制、环状变换、融合以及大片段的缺失和插入，以创造出全新的结构组合，并赋予新的功能。这些遗传物质再组织的结果创造了蛋白质新的序列空间，促进了进化蛋白质定向进化多样化基本方法1、易错PCR技术定向分子进化的基本策略如图9-2所示。对于单一基因的操作，第一轮随机突变中所选择的突变体再重复进行随机突变和选择，以积累更多的有益突变（图9-2a），应用DNA改组或其他方法改进突变体的重组，可使有益突变组合并消除有害突变（图9-2b）。当同源基因重组产生嵌合体时，可以产生新功能2、DNA改组又称为有性PCR。是将一组密切相关的序列（通常是进化上相关的DNA序列或曾筛选出的性能改迸的突变序列）片段化，再通过重组创造新基因的方法。若将已经获得的、存在于不同突变基因内的有益突变进行重组合，则可加速积累有益突变，构建出最大变异的突变基因库，最终可选择/筛选出最优化的突变体。因此，目前人们常把DNA改组与易错PCR结合。用于构建突变基因文库DNA改组能将亲本基因群中的优势突变尽可能地组合在一起，获得最佳突变组合。DNA改组是一种在无性进化基础上的有性进化技术。第十章产生杂合酶的方法大致分两类：一是非合理设计法：主要是通过构建各种库,再从库中筛选出所需性质的杂合体，实际上就是进化酶；二是合理设计法：要对操作对象的结构和功能有详尽了解，才能实现结构元件从一个蛋白质转移至另一蛋白质，从而产生性能新奇的杂合体。功能域转移可采取3种不同的类型：第一：将一种蛋白的功能基转移至同系结构蛋白上；第二：将功能肽序列转移至宿主骨架蛋白上，而不考虑同系结构问题。目的只是限制该序列的柔性；第三：将排列有序的活性部位转移至结构不同的适当天然骨架蛋白上名词解释化学酶工程指自然酶、化学修饰酶、固定化酶及化学人工酶的研究和应用；生物酶工程是酶学和以基因重组技术为主的现代分子固定化酶，是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。固定化细胞:细胞受到物理化学等因素约束或限制在一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力。偶联率=（加入蛋白活力一上清液蛋白活力）伽入蛋白活力X100%相对活力=固定化酶总活力/（加入酶的总活力一上清液中未偶联酶活力）X100%活力回收：是指固定化后固定化酶（或细胞）所显示的活力占被固定的等当量游离酶（细胞）总活力的百分数。固定化酶（细胞）的半衰期：是指在连续测定条件下，固定化酶（细胞）的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示。固定化酶（细胞）的活力：即是固定化酶（细胞）催化某一特定化学反应的能力，其大小可用在一定条件下它所催化的某一反应的反应初速度来表示。蛋白质的化学修饰：凡通过化学基团的引入或除去，使酶分子共价结构发生改变，从而改变酶的某种特性和功能的过程。交联剂：具有两个反应活性部位的双功能基团，可以在相隔较近的两个氨基酸残基之间，或酶与其他分子之间发生交联反应。交联修饰：使用双功能基团试剂将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内不同肽链部分间进行共价交联。固定化修饰：通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上。蛋白质的稳定性：指的是蛋白质抵抗各种因素的影响，保持其生物活力的能力。蛋白质工程：指用基因操纵技术高度专一性地改变目标蛋白质。水活度：aw=rwXxw式中xw为水的摩尔比；rw为活度系数。必需水：是酶在非水介质中进行催化反应所必需的，它直接影响酶的催化活性和选择性。光学活性化合物：指那些具有旋光性质的化合物，它们的化学组成相同，但是立体结构不同而成为恰如人的左右手一样的对映体表面分子印迹:在某些载体表面产生分子印记空腔或进行表面修饰产生印记结合部位的过程称为表面分子印记。生物印记：是分子印记的一种形式，它是指以天然的生物材料，如蛋白质和糖类物质为骨架，在其上进行分子印记而产生对印记分子具有特异性识别空腔的过程。模拟酶：是在分子水平上模拟酶活性部位的形状、大小及其微环境等结构特征，以及酶的作用机理和立体化学等特性，模拟酶具备催化基团，与底物之间具有相互匹配的立体化学特征。“主——客体”化学：Cram把主体与客体通过配位键或其他次级键形成稳定复合物的化学领域称为“主一客体”化学（host—guestchemistry）o肽酶：就是模拟天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽半合成酶：是以天然蛋白质或酶为母体，用化学或生物学方法引进适当的活性部位或催化基团，或改变其结构从而形成一种新的“人工酶”。分子印迹：是制备对某一化合物具有选择性的聚合物的过程抗体酶：又叫催化抗体，是一类免疫系统产生的、具有催化活性等的抗体。核酶：某些具有生物催化功能RNA分子。脱氧核酶：利用体外分子进化技术合成的一种具有催化功能的单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力。酶分子的