遗传性疾病的分子诊断

遗传性疾病诊断策略1.点突变的诊断

方法有等位基因特异性寡核苷酸杂交（ASO）、PCR－ELISA、等位基因特异性扩增（ASA）、PCR－RFLP、基因芯片技术进行诊断；对于一些基因背景未知的点突变，可以采用单链构象多态性（SSCP）、变性梯度凝胶电泳（DEEG）、异源双链分析（HA）、DNA序列测定、蛋白截短测试等方法。

2.片段性突变的检测

片段性突变是指DNA分子中较大范围的碱基发生突变，如碱基的缺失、插入、扩增和重组。对于少数核苷酸缺失或插入，可以采用检测点突变的方法，而对于大的片段突变，则使用Southern印迹技术和多重PCR技术。杜氏和贝氏肌营养不良症的基因诊断

多重PCR检测患者缺失凝胶电泳图（9对引物）P1除外显子1外其余均缺失；

P2外显子8－19有小的缺失；P3外显子44-50缺失；

P4外显子45－52有小的缺失；B1空白对照；C1、C2正常对照。DNAmRNA蛋白质转录反转录

翻译

核酸的分子杂交

基因结构异常基因表达异常PCR

DNA测序

Nothern-blot

实时荧光定量PCR

反转录PCR

蛋白质芯片

ELISA

蛋白组织化学染色Western-blot基因芯片

基因诊断的技术和方法一、限制性酶切图谱直接分析法

导致某一限制酶识别位点移位的大片段缺失或插入，

导致某一限制酶识别位点丧失或获得的点突变，均可引起相应限制性片段的长度和数量发生变化。分析限制性酶切图，即可诊断出此类突变。×MstⅡ酶切位点(GCTNAGG)5´3´正常基因5´3´突变基因1.15kb1.35kb镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析+﹣0.2kb1.15kb1.35kb正常人突变携带着患者镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析二、ASO探针杂交受检者基因组DNA或含突变位点的PCR扩增产物与标记的ASO探针杂交主要适用于检测已知点突变ASO1ASO2NormalHeteroHomo

将与致病基因连锁的某种多态性标志作为遗传标志，在同一个家系成员中探查是否存在致病基因的方法即为基因连锁分析法。

基因连锁分析

遗传性疾病的主要分子机理是基因突变，因而是基因诊断的最佳适应症。用分子生物学技术直接检测病原体，可对感染性疾病特异、快速地作出早期诊断。基因诊断在遗传性疾病中的应用

血红蛋白病最早成功进行产前基因诊断可分为两大类：异常血红蛋白病（abnormalhemoglobinsyndrome）地中海贫血（thalassemia）一、

遗传性疾病1）异常血红蛋白病珠蛋白基因突变（单硷基替代、缺失或插入等）

镰状细胞贫血：

b-珠蛋白基因第6位密码子GAG→GTG(E6V)

该突变使限制酶MstII位点消失(CCTGAGG→CCTGTGG)

诊断方法：限制性酶切图谱直接分析法(基因组DNA或PCR产物)ASO斑点印迹杂交分析法

(ASO=等位基因特异性寡核苷酸探针)

b-珠蛋白基因点突变

GAG(Glu)-->GTG(Val)

bAprobeACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCbSprobeACTCCTGTGGAGAAGTCTGCC

HeterobAprobebSprobeHomoNormal

a-地中海贫血：

不同数量(1-4个)a-珠蛋白基因缺失

aa

14kbBamHIBamHIaa/aaaa/--aa/a-a-/----/--10kb14kb10kb

a

2）地中海贫血

珠蛋白基因缺失或基因中某些硷基替代→影响a-或b-珠蛋白链的合成速率→a-或b-地贫b-地中海贫血主要是b-珠蛋白基因点突变。突变常不涉及限制酶识别位点不能用限制性酶切图谱进行直接分析。诊断方法：

RFLP连锁分析间接检测病变基因

ASO斑点印迹杂交分析直接检测病变基因点突变

DNA芯片（包括各种基因突变位点的所有探针）可快速、简便地检出所有已知突变

甲型血友病（血友病A）凝血因子IIIV（FIIIV）缺乏所致，发病的分子机制是FIIIV基因突变，主要为点突变或少数硷基的缺失和插入以及第22内含子的大片段倒位。乙型血友病（血友病B）起因于凝血因子IX的缺乏其分子机制是分布于整个基因各处的多种形式的突变。

诊断方法：PCR/ASO直接检测法（点突变）

PCR/RFLP连锁分析法（多种不定突变）（2）血友病（haemophilia）

人类基因组上的DNA遗传标记

限制性片段长度多态性(RFLPs)1985短串联重复序列(shorttendemrepeats,STRs,mini-satellites)1990s单核苷酸多态性(single-nucleotidepolymor-phismsSNPs)短串联重复序列STRs(shorttendemrepeats,Microsatellites)STR广泛存在于人基因组，占约5%，基本单位是1bp-8bp的串联重复，重复次数n=15-60，已知8000多个，主要形式为：

(CA)n，(GA)n，(AA)n，(GG)n，(CAA)n，

(CGG)n，其中以

(CA)n，(GT)n为多见。1992年，Welssenbanch等以STR为标记的第二代连锁图取代了RFLP连锁图。

定义:主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。与RFLP与STR不同,它是直接以序列的变异作为标记,而不是以片段的长度差异作为标记.

人类基因组图谱的初步分析表明，共有3万至3.5万个基因。有300多万个单核苷酸多态性,SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，3-4个相邻的标记构成的单倍型（haplotype）就可有8-16种。

1996年，Lander报道了用单核苷酸多态性标记制备第三代遗传连锁图的遗传标记。单核苷酸多态性（singlenucleotidpolymorphism，SNP）

SNP用作遗传标记具有以下优点：①SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因频率都可估计出来。②它在基因组中的分布较微卫星标记广泛得多。③与串联重复的微卫星位点(STR)相比，SNP是高度稳定的.尤其是处于编码区的SNP(cSNP),而前者的高突变率容易引起对人群的遗传分析出现困难。④部分位于基因内部的SNP可能会直接影响产物蛋白质的结构或基因表达水平，因此，它们本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。⑤易于进行自动化分析，缩短了研究时间.点突变(pointmutation)包括错义突变、无义突变、移码突变。各种点突变所造成的后果：

蛋白质分子量改变蛋白质合成量下降无蛋白质合成片段性突变(fragememtalmutation)核苷酸的丢失和增多缺失：基因中硷基（遗传物质）的丢失插入：外来基因片段插入某一基因序列中倍增：基因内部某一段序列发生重复基因重排：基因组中原来不在一起的基因由于某些原因组合排列在一起DMD的基因检测

Duchennemusculardystrophy(DMD)是一种高发病率、高致残、高致死的X连锁的遗传性疾病，在3500个活产男婴中即有一个患者。

DMD基因的全长为250kb，有79个外显子。

DMD的最主要遗传缺陷是外显子缺失，约占

60%~70%。单拷贝序列在基因组中仅出现一次或少数几次，大多数基因(50%-80%)在单倍体中都为单拷贝。中度重复序列

重复次数为数十至数万(<105)次，长度多在300-7000bp，多为不编码序列，与单拷贝基因间隔排列。如Alu家族、KpnI家族、rRNA等。高度重复序列存在于基因组的间隔区和基因的内含子等非编码区重复频率可高达106以上，不转录具高度多态性，成为有效的遗传标记志已广泛用于基因定位和基因诊断双等位基因(bi-allele）多态性：限制性片段长度多态性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）第一代DNA遗传标记，所含信息量有限。

检测技术：Southern印迹技术多等位基因多态性(multi-allele)小卫星序列又称串联重复可变数目（variablenumbertandemrepeats，VNTR）第二代DNA遗传标志，属高度重复序列以6~70bp为单位，以串联形式排列，构成数量可变的串联重复序列等位基因常常达10个以上，信息量比RFLP大检测技术：PCR

微卫星序列(microsatellite)以2~6bp为单位(如CArepeat)，又称短串联重复序列(STR)

。在基因组中分布广泛，重复次数可达几十次，具高度多态性。检测技术：PCR单核苷酸多态性(singlenucleotidepoly-morphism，SNP)第三代DNA的遗传标志，其多态性仅表现为单个核苷酸的变异。在人类基因组中的数目可达300万个，是一种信息量非常大的标记系统。

检测技术：DNA芯片技术凝血因子Ⅷ(F8)基因的主要遗传缺陷主要为点突变和基因缺失 缺失 169种

插入 28种

点突变 347种第22号内含子倒位:40%-50%重型HA

一DNA多态

DNA多态（DNAPolymorphism）：群体中每个个体DNA区域中等位基因（或片段）存在两种或两种以上的形式，对基因功能没有影响，称DNA多态。它通过孟德尔方式遗传。常用做遗传分析中的标记。DNA分析中常用的遗传性多态性标记有3类：1）RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记；2）重复序列多态性（VNTR）：如短串联重复序列（STR），为第二代多态性标记；3）单碱基多态性（SNP）：DNA序列的单个核苷酸的差别，为第三代多态性标记。二)数目变异串联重复，variablenumbertandemrepeats,VNTR）重复序列以各自的核心序列（重复单元），首尾相连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态即VNTR。散在分布于染色体上。重复单位6~25bp长，称为小卫星DNA。

重复单位2~6bp长，如（TA）n,(CGG)n等，称为微卫星DNA。VNTR两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。DNA多态可以通过PCR扩增后电泳来检出，称扩增片段长度多态（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,Amp-FLP）VNTR酶切，电泳后的检测结果

大小PCR-VNTR检测PCR-VNTR三)单核苷酸多态性（SNP）（SingleNucleiotidePolymorphism）SNP：发生在基因组中的单个核苷酸的替代根据SNP在基因中的位置，分为：基因编码区SNP

基因周边SNP

基因间SNP在人类基因组中每100~300个核苷酸就有一个SNP1Southernblot--RFLP诊断(PKU)PAH基因两侧有Msp1酶切位点,用该酶消化可产生23kb、19kb两种等位片段，以PAHcDNA为探针与PKU家系成员外周血DNA杂交。间接基因诊断患者为19kb片段的纯合子,说明患者缺陷的PAH基因与19kb片段连锁其父、母亲缺陷的PAH基