电子显微镜原理2015年新

上海水产大学生命学院周平凡光镜与电镜技术

1电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第1页!第二部分:电子显微镜技术（电子显微镜和电子显微术的总称）2电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第2页!

一、概述：章:电子显微镜的原理和结构

节:几个常用的基本概念

第二节:透射电子显微镜

第三节:扫描电子显微镜

第四节:其他类型的电子显微镜第二部分:电镜技术3电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第3页!

第二章:超薄切片技术

节:取材

第二节:固定和固定剂

第三节:脱水

第四节:浸透和包埋

第五节:超薄切片

第二部分:电镜技术4电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第4页!第四章:扫描电镜生物样品制备技术

节:取材和标本的预处理

第二节:生物样品的干燥

第三节:生物样品的导电法第二部分:电镜技术5电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第5页!6电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第6页!电子显微镜照片透射电子显微镜拍摄的照片扫描电子显微镜拍摄的照片细胞核红血球7电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第7页!一、概述8电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第8页!通过多种电子显微术的配合----能了解生物样品的化学组成、形态结构和生理功能的关系。

电镜技术----无论在生物技术的基础研究中、还是在临床医学,都有着广阔的发展前景。一、概述9电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第9页!（一）透射电镜

透射电镜----是利用电子射线穿透样品后放大而成像的一种电镜。

主要优点----分辨率高,可用来观察组织和细胞内部的超微结构以及微生物和生物大分子的全貌,在生物医学上的应用最为广泛。

加速电压----一般透射电镜（加速电压小于120KV）,高压透射电镜（加速电压在120KV与500KV之间）,超高压透射电镜（加速电压大于500KV）。

一、概述10电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第10页!二、电镜成象的原理11电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第11页!1、一般透射电镜：就是最常用的100KV电镜。

这种电镜的分辨率高(点3A,晶格1.4A),但穿透本领小,观察样品必须很薄,如小于0.1微米的超薄切片、负染样品和复型膜等。

这种电镜在生物医学上的应用已相当普及。

一、概述12电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第12页!

东京大学工学院125万伏超高压电镜（JEOL–ARM–1250），该电镜价值1000万美元，有三层楼那么高，是世界上精确度最高的电镜之一，主要用于原子结构和物质的特性研究。13电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第13页!14电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第14页!用户的样品不需要在这样高水平的电镜上测试，即便是付费，他们也不予测试，因为这等于是浪费了高水平的资源。相反，如果用户提出的样品或课题有很高的学术、科学技术价值，即便资费不够，他们也会主动接受。每年提供3％的运行费用。15电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第15页!用户提出的样品和研究有很高的价值，他们甚至可以提供几个月的免费食宿和测试，开展合作研究。正因为如此，他们也做出了很多高水平的成果，在全世界的同行中享有很高的知名度。16电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第16页!17电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第17页!UCLA纳米系统实验室18电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第18页!19电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第19页!20电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第20页!21电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第21页!22电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第22页!23电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第23页!24电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第24页!25电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第25页!26电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第26页!（二）扫描电镜

扫描电镜是利用电子射线轰击样品表面,引起二次电子等信号的发射,经检测装置接收后成像的一种电镜。

特点是景深长,所获得的图象立体感强,可用来观察生物样品的各种形貌特征。

在生物医学中,采用不同的样品制备技术可观察不同的结构,如用临界点干燥方法可观察样品的表面形貌；

用冷冻割裂方法可观察样品割裂面的结构,用铸型方法可观察管腔内表面的结构等。一、概述27电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第27页!1、

一般扫描电镜

目前一般商品扫描电镜采用热发射电子枪,分辩率为60A左右,若采用六棚化镧电子枪,分辨率可提高到40-50A。

这种电镜在生物医学中的应用也已相当普及。

一、概述28电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第28页!一、概述29电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第29页!

1、超薄切片技术

由于电子射线穿透本领很差,对厚于0.1微米的切片就很难透过。因此,必须把生物标本切得很薄才能在透射电镜下观察。

超薄切片技术就是通过固定、脱水、包埋、切片和染色等步骤,将生物标本切成薄于0.1微米超薄切片的样品制备技术,用于生物组织的内部超微结构研究。

超薄切片技术是所有电镜生物样品制备技术中最常用、最基本的一种技术。

（一）与透射电镜有关的电子显微术30电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第30页!4、电镜细胞化学技术

利用各种细胞化学反应,在超微结构水平上研究细胞成分的分布和变化的方法称电镜细胞化学技术。

这一技术把细胞超微结构与其化学组成有机地联系起来,目前主要用于研究细胞内各种大分子物质和酶的定位等。

（一）与透射电镜有关的电子显微术31电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第31页!

1、表面观察样品制备技术

扫描电镜适合于研究生物样品的表面特征,样品制备包括观察面暴露、固定、干燥和导电等步骤,使表面特征充分暴露而不变形。

这一技术是扫描电镜样品制备的常规技术,主要用于组织、细胞、寄生虫等表面形貌的研究。

（二）与扫描电镜有关的电子显微术32电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第32页!（一）在细胞和分子生物学方面的应用

电镜技术有力地推动了细胞生物学的发展,使许多在光学显微镜下长期不能解决的问题找到了答案。

由于电镜具有很高的分辩率,使人们对细胞结构的认识不断深入,从光学显微镜的显微结构水平提高到超微结构水平。三、电镜技术在生物医学上的应用33电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第33页!（二）在解剖学中的应用

对人体结构的认识是医学的重要基础,而这一种认识是随着技术的发展而不断深入的。

光学显微镜的出现使解剖学在大体解剖的基础上发展了显微解剖学（组织学）,

电子显微镜的出现则进一步发展了超微解剖学,使人们对人体的认识达到了超微结构水平。三、电镜技术在生物医学上的应用34电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第34页!（四）在病理研究和临床诊断方面的应用

传统的病理学在疾病诊断上起着重要作用,但由于医学已发展到分子水平,原布的病理学知识已不能满足需要。近年来,随着电镜技术的发展,超微结构病理学和超微结构诊断学取得了很大的进展,有效地应用于病因研究和临床诊断上。三、电镜技术在生物医学上的应用35电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第35页!透射电子显微镜

（transmissionelectronmicroscopeTEM）现代电子显微镜的基本形式36电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第36页!

透射电子显微镜中，物镜、中间镜、投影镜是以积木方式成像，如果电子显微镜是三级成像，那么总的放大倍数就是各个透镜倍率的乘积。M=M0*Mi*Mp电磁透镜的光学性质

37电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第37页!在电镜中：电子射线在几万伏的加速电压作用下，以极高的速度聚到样品上，高速的电子与样品中的原子发生碰撞，从而产生散射现象。

由于标本中各部分结构的厚度和密度不同，电子束受阻和产生散射情况也不同，因此透过标本的电子束就有疏密的区别，射到荧光屏上就会出现明暗不同的影像。第二节：透射电子显微镜38电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第38页!样品中各部分质量厚度的差异会引起不同的散射，当均匀的电子束穿过样品时就受到样品上信息的处理，变成一束疏密相间的电子束。散射角度较大的电子在通过物镜光栏是就被去除了。

在生物样品中细胞和组织主要由较轻的低原子序数的原子如碳、氢、氧、氮等组成，这些原子的电子散射能力很小。

电镜成象的原理39电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第39页!

透射电镜是以电子束透过样品经过聚焦与放大后所产生的物像，投射到荧光屏上或照相底片上进行观察。分辨率为0.1～0.2nm，放大倍数为几万～几十万倍。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必须制备更薄的超薄切片（通常为50～100nm）。并用重金属盐如柠檬酸铅和醋酸铀等染色。

透射电镜原理40电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第40页!

由于电子的穿透力很弱，唯有在高真空条件下才可能达到一定的自由行程，故电镜镜筒必须保持高真空（10-4乇以上），样品必须很薄，一般在100KV加速电压时，样品厚度不应超过0.1微米。

电子束对人眼不能引起视觉反应，但可激发荧光物质产生荧光，故电镜的观察部份设有荧光屏。电子束和电磁透镜41电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第41页!一、电子束和电磁透镜42电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第42页!第二节：透射电子显微镜透射电镜内部结构43电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第43页!第二节：透射电子显微镜真空泵管路44电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第44页!电子显微镜是利用电子射线即电子束作光源使物体成像，

要了解电子显微镜的原理，首先就要了解电子射线的特性。一、电子束和电磁透镜45电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第45页!

1924年，DeBroglie证明粒子在高速运动的时候会发射出一定波长的电磁辐射，它的波长用公式表示为：

λ是代表波长；

h是Planck（普郎克）常数；

m是粒子的质量；

v是粒子运动的速度。一、电子束和电磁透镜46电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第46页!从上述式中可以算出电子的速度为:

由于电子的质量m约为质子e的1/1840，把m，v都代入公式，公式可改写成:

一、电子束和电磁透镜47电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第47页!加速电压（kV）1.0

5.0

10.0

25.0

50.0

75.0

100.0

300.0

500.0

1000.0

3000.0 电子束波长(λ)0.387

0.173

0.122

0.077

0.053

0.044

0.037

0.022

0.017

0.012

0.007 加速电压与波长的关系一、电子束和电磁透镜48电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第48页!什么是电磁透镜？能使电子束聚焦的装置称为电磁透镜（electronlens）电磁透镜是一种焦距(或放大倍数)可调的会聚透镜。改变激磁电流，电磁透镜可使电子束会聚。电磁透镜结构示意图49电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第49页!电子在轴对称磁场作用下的行为与光学透镜一样，也服从几何光学定律，磁透镜的焦距可以用光学透镜的公式计算出。

透镜焦距和所采用的磁场强度有关，磁场越强，焦距越短，放大倍数也就越高。现代电子显微镜的成像物镜大多数采用短焦距的强磁透镜。一、电子束和电磁透镜50电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第50页!电子束和电磁透镜的关系51电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第51页!一、电子束和电磁透镜52电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第52页!1、球面象差及畸变

2、衍射象差

3、色差

4、象散

5、景深

6、焦深

7、磁滞

8、反差与成像电磁透镜的特性53电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第53页!二、电镜成象的原理1-2、畸变54电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第54页!二、电镜成象的原理5、景深55电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第55页!普通光学显微镜以互不作用的光子流——可见光为照明源，当光线透过样品组织结构部分时，产生不同程度的吸收、反射、折射和散射，从而形成明暗不同的组织结构影像。

吸收产生振幅差即强度差（反差），肉眼对此最为敏感，它是光学显微镜成像中最重要的因素。二、电镜成象的原理56电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第56页!任何一个物体都是由原子组成的，原子则是由原子核与轨道电子(电子云)组成的。

原子与原子的间距，比原子核或电子本身的大小要长几百万倍。二、电镜成象的原理57电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第57页!二、电镜成象的原理58电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第58页!二、电镜成象的原理59电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第59页!透射式电镜主要由三大部分组成：

部分:电子光学系统

第二部分:真空系统

第三部分:供电系统60电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第60页!

照明系统电子枪聚光镜样品室成像系统物镜1、电子光学照明系统中间镜投影镜观察室观察与记录系统照相室自动曝光装置

（部分）61电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第61页!交直流电源高压电源透镜电源真空电源与自动控制系统束偏转，消散器等电源及控制系统安全系统和辅助电源3、电子学系统第三部分62电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第62页!63电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第63页!64电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第64页!一、电子光学系统电子光学系统即电镜的镜体，它基本上是一个电子透镜系统，一端是电子源，另一端是观查和记录系统，中间是安放样品的装置。其结构示意图见图1—18所示。分述如下：

65电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第65页!1．照明系统

照明系统是由电子枪和聚光镜组成。其作用是为成像系统提供一个亮度高，尺寸小、高稳定的照明电于束。电子束的亮度由电子发射强度决定，束斑大小主要由聚光镜的性能决定。66电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第66页!67电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第67页!栅极用于控制电子束形状和发射强度。现代电镜一般采用自给栅偏电子枪（图1-20）。把负高压接到栅板上，经过一个可变电阻(棚偏压电阻)接到灯丝上。其优点是栅偏压电阻起负反馈作用，从而能稳定电子束流的作用；图1-20表明自偏压电子枪电子发射的示意图。由于栅极的排斥作用，使电子会聚成束。其中束交叉点处束径小于100μ，电子密度最高，是电镜的实际电子源。68电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第68页!在开始时，随着灯丝加热电流增大，灯丝温度上升，束流也增加，但由于栅偏压电阻的反馈作用，束流增长逐渐变慢，当灯温度到达某值时，束流不再随灯丝温度的上升而增大，此称为束流的饱和点。栅偏压电阻值不同有不同的饱和点。饱和现象使束流稳定从而稳定了终像的亮度。如果调节加热电流使之比饱和点稍小一点，此时屏上出现如图1-21的图像。69电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第69页!（2）聚光镜

聚光镜的作用是将来自电子枪的电子会聚到样品上，通过它来控制照明电子束斑大小，电流密度和孔径角。照明束斑过大时，会引起样品热漂移和污染，使图像模糊不清，并会因电流密度不足而使像亮度差，故电镜多有两个聚光镜。聚光镜（C1）是一个强透镜，它的作用是把有效光源的尺寸缩小，即缩小束斑直径，最小可达1-2μ。70电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第70页!实际操作中在像的亮度足够的条件下，第二聚光镜尽可能散焦，以获得尽可能小的孔径角（孔径角增大，球差增大）。为了缩小照明孔径角，在第二聚光镜之下装有第二聚光镜可动光栏（φ100、300、400微米的圆孔)，根据需要可选取不同的光栏孔。第二聚光镜如存在像散，亮斑成椭圆将会降低终像的亮度。第二聚光镜都装备有消散器。71电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第71页!2．成像系统

成像系统包括样品室、物镜、中间镜和投射镜（或有两个中间镜，或有两个投射镜构成4-5个透镜系统）。（1）样品室第二聚光镜下面是样品室。室内有样品台，样品台支承样品并使样品可在两个相互垂直的方向移动。移动是极端精密的，在高倍放大时，重复精度应达到±100A以内。多数电镜的样品台还装有使样品旋转和倾斜的装置。72电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第72页!高性能的电镜，在样品室中常装有防污染装置。电镜镜简的真空度常在10-5-10-6乇，多是采用油扩散泵来获得高真空。由于扩散泵油和密封橡皮垫圈的真空脂的挥发，使镜筒内含有大量的碳化氢分子。这些碳化氢分子落到样品表面上形成无定形的覆盖层，它使样品的反差降低。这个覆盖层受到电子束的轰击时会分解为碳和氢。氢气进入真空中，而碳则留在样品上。这种现象称为“污染”。73电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第73页!铜片连接铜棒，铜棒经过真空密封通到镜简外，浸在充满液氮的杜瓦瓶中。热量通过铜棒迅速传走，使铜片保持在-150℃温度。于是碳化氢分子首先凝集在冷却的铜片表面上，从而防止这些碳化氢分子去“污染”样品。

74电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第74页!为了减少像差从而提高分辨本领，物镜应是强激励短焦距的。高性能电镜的物镜最短焦距约为1-2毫米，放大率约为100—200倍，分辨本领约达2埃。为了减少色差，要求激励电流高度稳定，常要求达1×10-6／分钟。在电镜观察中，像的漂移是一个很讨厌的现象。75电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第75页!物镜光栏除能提高像的反差外，还起控制物镜孔径角的作用：通常样品是放在物镜的前焦面附近，而物镜光栏放在物镜的后焦面附近，物镜孔径角在焦距变化不大时，近似为光栏孔半径（R）与物镜焦距（f）之比，即α≈R/f。选择合适的孔径角是重要的，它对提高分辨本领和像反差有明显的影响。76电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第76页!电镜总放大倍率的改变主要利用中间镜倍率的变化来达到，电镜的总放大率为所有透镜放大率之积，即；M总=M0×M1×MPM0-物镜放大率；M1-中间镜放大率；MP-投射镜放大率。投射镜的作用是把中间镜形成的二级放大像再放大投射到萤光屏上，从而形成终像。77电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第77页!同样在成像系统中也必须备有一个重要的合轴机构。3、像的观察和记录系统

在投射镜下面是像的观察和记录系统，终像是用萤光屏来显示。除了用于观察的大萤光屏外，还有一个用于聚焦的小萤光屏和放大10倍的长焦距的双目光学显微镜。78电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第78页!在萤光屏下面是照相暗盒，它和电磁快门、曝光表组成像的记录系统，用于把终像拍摄记录下来。把终像拍摄下来不但能把像长期保留以便研究分析，而且由于照相底片的分辨本领大大高于萤光屏，因此，拍摄出来的底片往往含有在萤光屏直接观察中看不到的细节。79电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第79页!2、真空系统80电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第80页!

一个空间的真空程度与它的气压是密切相关。气压越接近常压——大气压的空间的真空度就越低，反之气压越低，则真空度就越高。

真空度用气压表示。

一个大气压=760毫米水银柱的压力。国际上用“乇”（Torr）表示即：

1乇=1毫米水银柱压力=1/760大气压81电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第81页!

电镜的真空系统——是用于从镜筒中排除空气和其它气体，

镜筒内有较高的气压时就会发生：①气体分子与高速电子碰撞而散射电子；这样会引起“炫光”或降低像的反差。②电子枪的负高压会引起电离和放电，使电子束不稳定或“闪烁”。②残余气体与炽热的灯丝作用，不断腐蚀灯丝，缩短其寿命。④残余气体会污染样品。82电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第82页!级：是机械泵获得10-1-10-2乇的低真空，作为第二级泵的预真空；第二级：采用油扩散泵使真空到达10-5乇。对于要求真空度高于10-5乇的电镜，往往需要三级串联系统，第三级：多采用吸附泵或油扩散泵，泵系统通过真空管道和阀门与镜筒连接，83电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第83页!对于真空度高于10-5乇的真空系统，都用金属垫圈或非橡胶垫圈来密封。即电子枪附近的接口用的O环不能用真空脂。（二）、电镜的真空指示器（常称为真空规）是用来检测和监视镜简的真空状态的，一般的真空规都是只适用于测量某一段的真空度的，因此，电镜常用二个真空规：84电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第84页!产生的原因：气体会不断地通过一些很小的漏气孔进入镜筒，同时镜筒内壁表面，尤其是照相底片会不断放出气体使真空度下降。解决的办法：1、在电镜工作状态时，真空系统以连续不断地工作方式不断把气体排出。

（电镜的真空系统是一个金属真空系统，目前还未有理想的捡查漏气的方法和仪器）。85电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第85页!3、电子学系统86电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第86页!电子学系统主要包括：1、交直流电源2、高压电源3、透镜电流电源4、真空电源与自动控制系统5、束偏转、消散器等电源6、控制系统7、安全系统和辅助电源等。87电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第87页!第三章:电子染色技术

节:电子显微镜标本的正染色

第二节:电子显微镜标本的负染色

第三节:半薄切片染色

第二部分:电镜技术88电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第88页!一、概述89电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第89页!透射电镜TEM（transmissionelectronmicroscope）

观察细胞内部结构

扫描电镜SEM（scanningelectronmicroscope)

观察组织或细胞表面的立体结构透射电子显微镜扫描电子显微镜电子显微镜的分类：

90电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第90页!一、概述91电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第91页!

电镜具有很高的分辨本领,能观察极微小的结构。但是电镜不能直接观察天然状态下的生物标本,必须通过各种技术将生物标本制成特殊的电镜生物样品,才能放入电镜进行观察,这些电镜样品制备技术称为电子显微术。

电镜能在生物医学领域中广泛使用,在很大程度上是由于电子显微术的改进和发展。电子显微术种类很多,这里仅介绍几种常用的技术。一、概述92电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第92页!一、电子显微镜的概况

透射电镜的点分辨率达到了2-3A,晶格分辩率已达到1A左右,已使人们能用电镜直接观察原子象；

除透射电镜外,发展了多种电镜,如扫描电镜、扫描透射电镜、分析电镜等,使我们能对样品进行综合研究。一、概述93电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第93页!一、概述94电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第94页!一、概述95电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第95页!3、超高压透射电镜：已有500KV、1000KV和3000KV的超高压电镜。

这种电镜具有穿透能力强、辐射损伤小、可以配备环境样品室及进行各种动态观察等优点,分辨率也已达到或超过100KV电镜的水平。

在超高压电镜上附加充气样品室,使人们有可能观察活细胞内超微结构的动态变化,对生物医学工作者很有吸引力。这种电镜庞大而且昂贵,远非一般实验室所能装备。

一、概述96电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第96页!97电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第97页!该电镜的开放管理时，该电镜的技术工作委员会主任市野漱告诉我们，他的电镜每天24小时向“全世界”开放。

尽管是高精度特大型电镜，他们仍然实行用户经培训合格后自行上机的开放模式。

原则上，电镜实行测试收费管理，但他们电镜开放的重点是从事高水平的测试服务与科学研究。

98电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第98页!可以根据用户项目水平的高低，他们可以采用合作方式开展测试研究，甚至免费提供测试和研究。正由于他们有这样的开放与合作原则，多年来，他们的电镜在高水平研究方面发挥了重要作用，取得了许多世界一流的学术成果。99电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第99页!国外实验室倡导电子显微镜室对外开放：1、高年级学生2、研究生3、博士生4、科研人员100电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第100页!101电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第101页!102电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第102页!103电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第103页!104电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第104页!105电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第105页!106电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第106页!107电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第107页!108电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第108页!109电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第109页!110电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第110页!一、概述111电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第111页!一、概述112电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第112页!（四）扫描透射电镜

扫描电镜中电子射线作用于样品后,其中一部分电子可透过样品成为透射电子,将透过样品的透射电子和散射电子用检测器接收成像,即成为扫描透射电镜。

这种电镜一般用场发射电子枪,兼有透射电镜、扫描电镜和分析电镜的特点,能观察较厚的样品,分辨本领和成象质量都很好,是近年来电镜技术的最大改进之一。

一、概述113电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第113页!2、负染色技术

利用电子密度比标本高的重金属盐（如磷鸽酸纳、醋酸铀等）将生物标本包围起来,增强背景散射电子的能力以提高反差,在黑暗的背景下显示标本的形态结构,称负染色技术。

这一技术操作简便,主要用于颗粒状标本（如细菌、病毒、分离细胞器等）的研究。

（一）与透射电镜有关的电子显微术114电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第114页!5、免疫电镜技术

这是一种使抗原在超微结构水平上定位的技术,应用与抗原相应的标记抗体,在电镜下观察标记物的位置,从而定位相应抗原。

这一技术有灵敏度高、特异性强的特点。

（一）与透射电镜有关的电子显微术115电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第115页!2、生物标本割裂技术

将生物标本放在特殊包埋剂中经冷冻或其他方法国化,然后把固化的标本割裂,暴露组织和细胞的内部结构,再经干燥和导电后在扫描电镜下观察。

这一技术使扫描电镜能观察生物标本的内部结构,目前最常用的是冷冻割裂技术。

（二）与扫描电镜有关的电子显微术116电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第116页!对光镜下已经发现的细胞器如线粒体、中心体等的结构和功能,在电镜下有了新的和更深入的了解；

对光镜下争论不休的细胞器如高尔基体,在电镜下得到了证实并作了深入的研究；

在电镜下发现了很多新的细胞器和结构,如内质网、微体、微管、微丝等；电镜技术还对细胞的膜系统、细胞骨架和细胞联结的研究起着重要作用。

采用多种电子显微术相结合,使人们能够对细胞各部分的结构、代谢和功能联系起来进行动态的研究,从而极大地丰富了细胞生物学的内容。

三、电镜技术在生物医学上的应用117电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第117页!（三）在微生物学中的应用

电镜技术在微生物学中的应用主要包括两个方面：

对光学显微镜下看得见的原虫、真菌、细菌等作进一步的超微结构研究；

对病毒的研究。现以病毒研究为例,说明电镜技术在微生物学中的应用。

三、电镜技术在生物医学上的应用118电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第118页!一、透射电子显微镜原理透射电子显微镜:简称“透镜”119电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第119页!电镜与光镜主要区别显微镜分辨本领光源透镜真空成像原理LMEM200nm0.1nm可见光（400-700）电子束（0.01-0.9）玻璃透镜电磁透镜不要求真空要求真空利用样品对光的吸收形成明暗反差和颜色变化利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差120电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第120页!在光镜中：光束透过样品时，由于样品与光子流的相互作用产生不同程度的吸收、反射、折射和散射，其中主要是样品各部分对光的吸收特性不同而形成明暗不同的像。吸收光线少的部位，其像明亮，吸收光线多的部位，像黑暗。电子显微镜与光学显微镜的区别

121电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第121页!电子束投射到样品时，可随组织构成成分的密度不同而发生相应的电子发射，如电子束投射到质量大的结构时，电子被散射的多，因此投射到荧光屏上的电子少而呈暗像，电子照片上则呈黑色。称电子密度高（electrondense）。反之，则称为电子密度低（electronlucent）。122电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第122页!

成像电子通过样品时，所碰到的原子数目越多，散射的可能性就越大。散射量和样品的厚度成正比。

原子核的大小和原子序数直接有关，就是和样品本身的密度有关。

原子核越大，它带的正电越多，则核周围电子云中的电子也就越多，这样散射的机率就越大。电镜成象的原理123电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第123页!

由于物体上不同部位的结构不同，它们散射电子的能力也各不相同，结果使透过样品的电子束发生疏密的差别。

在散射电子能力强的地方，透过去的电子数目就少，因而打在荧光屏上所发出的光就弱，显现为暗区；

而散射电子弱的地方，透过的电子数目多，打在荧光屏上所发出的光就强，显现为亮区。

这样便在终像上造成了有亮有暗的区域，因而出现了反差，人眼就可以辨别。电镜成象的原理124电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第124页!

样品被切成菲薄的切片，质量厚度很小，电子散射能力很弱，因而反差很低，所以必须增加生物样品的相对散射能力。

在样品制备过程中要用重金属进行染色，以提高样品的散射能力。电镜成象的原理125电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第125页!

透射电子显微镜具有和光学显微镜相似结构系统，不同的是：1、用电子射线代替了照明的光线，2、用电磁透镜代替光学显微镜的聚光镜、物镜和目镜，3、用荧光屏代替肉眼直接观察，4、使用了极短的电子波，能获得极高的分辨本领。5、结构复杂。2、透射电子显微镜的结构126电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第126页!

电子显微镜的镜筒内部要求高度真空，并且要有一整套的供电系统。

127电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第127页!一、电子束和电磁透镜第二节：透射电子显微镜128电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第128页!

电子束实际上是一种阴极射线，是带负电荷的粒子，它和其它的光线一样，具有双重性:

1、具有波动性，

2、具有粒子性。一、电子束和电磁透镜129电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第129页!如果高速运动的粒子是电子，那么，电子在真空中运动的速度与加速电压有关，根据能量守恒定律:

e是电子的电荷绝对值，

V是加速电压(KV)一、电子束和电磁透镜130电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第130页!根据上述公式：

当V=50KV的时候，λ=0.053埃，

当V=100KV的时候，λ=0.037埃。

可见，加速电压越高，电子束的波长越短。

现将由上式计算得出的电子束波长值列入附表：一、电子束和电磁透镜131电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第131页!电子是带负电荷的粒子，其运动方式不同于光，电子的运动主要受所处磁场和电场强度的影响，而改变其行进方向。

德国物理学家Busch早在1926年即已指出:“具有轴对称性的磁场对电子束说来起着透镜的作用”。他从理论上奠定了可利用磁场作为电子透镜的基础。一、电子束和电磁透镜132电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第132页!电镜的电磁透镜在线圈外包有软铁的屏蔽外壳，线圈内侧多数装有高精度加工的铁钴合金极靴，极靴的作用是使形成的高强度磁场尽可能集中在沿轴的-个很窄的范围内。

极靴的形状直接影响成象质量，所以，极靴(特别是物镜成像极靴)是电子显微镜中最重要的部件。一、电子束和电磁透镜133电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第133页!当线圈中通以电流时，线圈周围形成磁场，从线圈中心轴某一点发出的电子，在磁场中沿螺旋线轨迹前进，然后会聚在中心轴的其它一点上。

电子束来说，磁场起着透镜的作用，有聚焦的特性，故称之为“电磁透镜”。一、电子束和电磁透镜134电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第134页!一、电子束和电磁透镜135电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第135页!在理想的情况下，电镜中的物镜、中间镜和投射镜可以利用光学中透镜成像公式，与光学的简单作图法相似：

一、电子束和电磁透镜136电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第136页!二、电镜成象的原理1-1、球面象差137电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第137页!二、电镜成象的原理4、象散138电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第138页!二、电镜成象的原理6、焦深139电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第139页!电镜是以电子束为照射源，当由热阴极发射的电子，在几十到几百万伏电压作用下，经电子聚光镜聚焦成电子束，以较高的速度投射到样品上，并和样品中的原子发生碰撞产生了一系列的现象，形成了反差。二、电镜成象的原理140电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第140页!对于电子来说，物体就好象是一个实体，它在空间的分布是非常稀疏的。当电子束照射在样品上的时候，大部份电子都能从原子与原子之间的空隙中穿透过去，而只有极少一部分的电子会与原子的原子核或原子轨道电子发生碰撞。二、电镜成象的原理141电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第141页!

如果电子是和原子核发生碰撞，电子基本上不损失能量，而只是改变运动方向，这种碰撞称为弹性碰撞，此电子发生了“弹性散射”作用。

如果电子是和轨道电子碰撞，电子不仅会改变原来运动的方向，而且还会损失一部分能量，这种碰撞称为非弹性碰撞，此电子发生了“非弹性散射”作用。二、电镜成象的原理142电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第142页!三、电镜的主要构成部件及性能第二节：透射电子显微镜143电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第143页!电镜的主要构成部件及性能144电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第144页!机械泵油扩散泵管道及自动阀门系统冷阱，预抽室，真空干燥器真空检测系统（第二部分）2、真空系统145电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第145页!JEOLJEM100CX-II透射电镜146电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第146页!147电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第147页!一、电子光学系统148电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第148页!透射电子显微镜的结构1．阴极组件2．阳极3．聚光镜4．第二聚光镜5．聚光镜可动光栏6．第二聚光镜消散器7.摆动器8．样品架9．物镜可动光栏10．物镜消散器11．物镜12．视野光栏13．中间镜14．第二中间镜15．投影镜16．双目显微镜17.快门18．观察窗19．荧光屏20．照相室21．底片暗盒149电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第149页!（1）电子枪：

它是电镜的照明源，其重要性仅次于物镜。因为电镜的放大率很高，而终像的亮度是电子透过样品后亮度的1／M2倍（M是电镜总放大率）。而且电镜的孔径角很小，因此，要求电子枪能产生很亮(即单位立体角的电流密度很高)的细电子束。电子枪由灯丝阴极、栅极(或称韦氏圆筒)和加速阳极组成，参阅图1-19。150电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第150页!

灯丝是用0.1毫米的钨丝做成V字形，通电加热至2,500-2,800K时，在尖端即产生热电子发射，形成照明束。在灯丝下方有一加速电极——阳极，用来加速电子。电压通常在50-100kV(千伏)之间。为了防止产生色差，加速电压要求高度稳定，其稳定度通常要求达到10-6/分的数量级。

在灯丝和阳极之间有一电位比阴极要负（-100—-500V)的栅极。151电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第151页!152电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第152页!灯丝像，中心亮斑是灯丝尖的像，显出制造灯丝时钨丝的拉线，周围的“晕轮”是栅极帽的像。此灯丝像在电镜调整中很有用。153电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第153页!第二聚光镜（C2）是一个弱透镜，采用长焦距的弱透镜是为了使照明孔径角足够小和在聚光镜与物镜之间提供一个较大的样品空间，以便能够放进样品台以及其它的附件。第二聚光镜用以控制照明亮度、照明孔径角和照明斑的尺寸，但只能在聚光镜决定的范围内变化照明斑的大小。154电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第154页!电子枪和聚光镜（C1和C2）都装备有平移和倾斜的调整机构（机械式的或电磁式的），以进行相互之间或与物镜之间进行合轴调整。

155电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第155页!电镜的样品载于铜网上，铜网放在样品架（或称样品筒）上。样品架如从上向下落入物镜中，称为顶落式。顶落式由于稳定性较好，能获得较高分辨率。样品架如从侧面插进物镜中称侧插式。侧插式样品架便于样品倾斜，旋转等，适用于分析性电镜。

156电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第156页!在一些脏的镜简中，“污染”引起的碳的沉积层可达每秒5A的速度生长。“污染”层与样品一起成像显著降低分辨本领。因此，需要防污染装置。它是一块尽可能靠近样品的冷冻金属块。通常用金属铜制成，中央有一小孔以便电子能正常通过。铜片放在样品上方或下方，或者上下方各放一块。157电子显微镜原理2015年新共171页，您现在浏览的是第157页!（2）物镜：在样品室下面是物镜。其作用有二种：形成样品的级放大像和通过调节物镜线圈的激励电流，相应地改变物镜的焦距从而对像进行聚焦。物镜是电镜的最关键部分，由它获得幅具有一定分辨本领的电子放大像，物镜中任何缺陷都将被成像系统其它透镜进一步放大。电镜的分辨本领主要取决于物镜的分辨本领。158电子显微