青霉素类药物工业分析与检测方法

关于青霉素类药物工业分析与检测方法第1页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六第一部分：青霉素类药物生产工艺第2页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六菌种优化抗生素发酵及提取精制工业生产方法及总的工艺抗生素生产菌的菌种菌种来源抗生素工业生产

内容速览第3页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六抗生素总的生产工艺过程菌种孢子制备种子制备发酵发酵液预处理及过滤出厂检验提取过程成品包装精制过程成品检验第4页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六微生物合成抗生素下游：提取预处理过滤进一步提取菌种保存、选育、孢子及种子制备发酵——适宜的培养基碳源氮源无机盐（微量元素）前体上游：结晶干燥纯品成品:制剂工作第5页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六第6页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六★发酵控制1）发酵时间：视抗生素品种和发酵工艺而定。2）溶氧：在整个发酵过程中，需不断通无菌空气和搅拌，以维持一定罐压或溶氧。3）控制灌温：在罐的夹层或蛇管中需通冷却水以维持一定罐温。4）消泡：加泡沫剂以控制泡沫，必要时还加入酸、碱以调节发酵液的pH。第7页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六成品检验《中华人民共和国药典》抗生素成品常规检验的主要项目有：①鉴别实验：用化学或生物方法证明是何种抗生素；②效价测定：测定有效成分的含量；③毒性试验：限制产品中的致毒杂质⑤水分测定：限制过高水分以免影响稳定性；④无菌实验：检查有无杂菌污染；⑥pH测定：规定水溶液的酸碱度，保证产品稳定和临床的安全应用；第8页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六第二部分：青霉素类药物的分析与检测第9页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六（一）、鉴别实验一、化学结构与性质1、化学结构①

青霉素类结构NSRCONHCH3CH3COOHO1234567青霉素类:氢化噻唑环或氢化噻嗪环与β-内酰胺并合的杂环，分别构成二者的母体：6-APA、7-ACA。母核:由-内酰胺环和氢化噻唑环组成的双杂环。

6-APA6-AminopenicillanicAcid

侧链:RCO-

第10页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六2、性质青霉素类和头孢菌素类结构共同特点具有-内酰胺环。青霉素分子中都有一个游离羧基和酰胺侧链。①

酸性

有羧基，具有酸性pKa值在2.5~2.8之间与碱成盐如：青霉素G钠、青霉素G钾等分子中游离羧基具有相当强的酸性，能与无机碱或某些有机碱形成盐。其碱金属盐易溶于水，而有机碱盐难溶于水，易溶于甲醇等有机溶剂。第11页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六②

旋光性青霉素分子中含有三个手性碳原子(C3，、C5、C6)有手性碳原子，具有旋光性，根据此性质，可用于青霉素药物的定性和定量分析第12页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六③紫外吸收特性青霉素类母核无明显UV多数有苯环取代基

＊但青霉素类药物在弱酸性下水解，可以产生具有共轭双键的青霉烯酸，在紫外光区有吸收。＊侧链中有苯环等取代基的药物，在紫外光区也有吸收。像苄青霉素。第13页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六头孢菌素类分子中有共轭体系（O＝C－N－C＝C）在260nm处有最大吸收。第14页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六④不稳定性干燥条件下青霉素盐稳定。青霉素水溶液在pH6-6.8时较稳定。β-内酰胺环是该类抗生素结构最不稳定的部分。不稳定性因素：四元环张力大，酰胺键易水解青霉素类药物遇到某些氧化剂（酸、碱、青霉素酶，或某些金属离子）或遭遇某种温度，药物将降解失效。第15页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六二、青霉素类药物的鉴别反应（一）官能团的呈色反应：1、羟肟酸铁反应：碱性环境中与羟胺作用β-内酰胺环破裂生成羟肟酸在稀酸中与高铁离子呈色。【鉴别】（1）取本品约20mg，加水15ml溶解后，加盐酸羟胺试液与氢氧化钠试液各2ml，放置5分钟后，加盐酸溶液（1→100）3ml与三氯化铁试液1ml，随即振摇，即显赤褐色。第16页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六2、硫酸-硝酸呈色反应：头孢菌素能与硫酸-硝酸反应后呈黄色。此显色反应可区别某些头孢菌素族抗生素，因此被一些国家药典采用供鉴别。3、茚三酮反应：α-氨基酸的反应,如氨苄西林遇茚三酮显蓝紫色4、与斐林试剂反应：分子中具有(-CONH-)结构，可使碱性酒石酸铜还原显紫色,5、变色酸-硫酸呈色反应：中国药典(1995年版)采用本法鉴别。如阿莫西林林加变色酸-硫酸试剂混合后，于150℃加热2-3min，因分解出甲醛与变色酸缩合而呈深褐色。6、各种盐的反应：火焰反应在火焰下遇钾显紫色遇钠显淡黄色青霉素族、头孢菌素族药品中，许多制成钾盐或钠盐供临床使用，因而可利用其火焰反应进行鉴别。第17页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六（二）沉淀反应1、在稀盐酸中生成白色沉淀：青霉素钾(钠)白色游离基沉淀2、有机胺盐的特殊反应：侧链含有苯羟基基团时，能与重氮苯磺酸试液产生偶合反应而呈色。如：第18页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六（三）类似肽键的反应双缩脲反应【鉴别】（2）取样本约10mg，加水6ml溶解后，加碱性酒石酸铜试液0.5ml，即显紫色。(四)生物学法（抑菌能力）如青霉素钠鉴别取本品与已知含量的青霉素适量，分别加水制成每1ml中约含50μg的溶液，各取1ml，加入不少于200单位的青霉素酶溶液1ml,在37℃灭活1小时后，取灭菌滤纸片，分别用上述溶液浸湿后，用滤纸吸去多余的液体，置摊布金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]的培养基上，在37℃培养约16小时后均无抑菌作用，而用同一方法检查未经青霉素酶灭活的溶液均有抑菌作用。

第19页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六第20页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六二、药物中有效物质含量测定（1）容量法：容量分析是依据已知浓度的标准试剂溶液与被测定的一定量供试品药物完全作用所消耗的标准试剂的体积，来计算被测定药物中有效物质含量的方法。在抗生素类药物分析中，常用的有酸碱滴定法、碘量法。青霉素含量的测定,青霉素在水溶液中经水解后，产生青霉噻唑酸，可用酸碱滴定法测定。或用直接滴定法，或用逆滴法进行测定，最后均以碱标准溶液的消耗量来计算青霉素的含量。第21页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六终点观察：用目视指示剂或电位滴定均可。温度对指示剂的变色范围有影响。碱性指示剂，温度升高时，对氢离子的灵敏度降低，变色范围偏向较低的pH值，如甲基橙在室温时为pH3.1～4.4，在100℃时，移到2.5～3.7。酸性指示剂对温度的影响不太敏感。指示剂的用量不宜多，过多时，因指示剂本身也消耗酸或碱，变色较慢。在水溶液中，大部分羧酸在pH约8.4时中和，一般可用酚酞指示剂（无色到红色），也可采用百里酚酞（无色到蓝色）或百里酚蓝（黄色到蓝色）等。滴定剂的选择，一般选用氢氧化钠或氢氧化钾标准溶液作滴定剂。标准碱液一般采用新沸冷却蒸馏水进行稀释制备。贮存标准碱液的容器要密封，以免吸收二氧化碳而影响碱液质量。青霉素钠的含量测定精密称取本品约0.3～0.4g，加新沸过的蒸馏水20mL使其溶解，加0.01mol/L氢氧化钠液中和后，精密加0.1mol/L氢氧化钠液25mL，95℃左右水浴20min。冷却后，加酚酞指示剂2滴，用0.1mol/L盐酸滴定，从粉红色至无色。不加供试样品作为空白，重复以上操作。两者滴定数的差即为所消耗氢氧化钠的量。第22页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六（2）光谱学测定法

①旋光法:平面偏振光通过含有某些光学活性的化合物液体或溶液时，能引起旋光现象，使偏振光的平面向左或向右旋转。偏振光平面旋转的度数，称为旋光度。使偏振光向右旋转（顺时针方向）为右旋，以“＋”符号表示；使偏振光向左旋（逆时针方向）为左旋，以“－”符号表示。偏振光透过长1dm并每1mL中含有旋光物质1g的溶液，在一定波长与温度下测得的旋光度称为比旋度。旋光法亦用于红霉素、螺旋霉素等的效价测定。②分光光度法:紫外分光光度法多用于抗生素制剂中抗生素含量的测定。如测定奥格门汀（复合制剂）中羟氨苄青霉素和克拉维酸的含量；测定麦迪霉素胶囊中麦迪霉素的含量；用金属离子络合物测定土霉素制剂中的土霉素含量等等。比色法用于多种抗生素的效价测定。如青霉素和头孢菌素的羟胺比色法测定抗生素效价；链霉素的麦芽酚法测定链霉素效价；三氯化铁比色法测定土霉素效价等。第23页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六③色谱法测定法色谱法在抗生素药物分析中，主要用于鉴别定性及定量（如杂质、异构体的限度试验和组分分析）。第24页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六④高效液相测定法：在每种抗生素进行检测前要求对仪器进行系统适应性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子。高效液相色谱在抗生素类药物的定性、定量分析中应用的愈来愈多，如半合成青霉素的衍生物的含量测定。（3）碘量法（剩余碘量法）

原理

*β－内酰胺类不直接与碘反应*β－内酰胺类水解产物可与碘发生定量反应：

第25页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六取装量差异项下的内容物，精密称取约0.12g，置100ml量瓶中，加水使溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置碘瓶中，加1mol/L氢氧化钠溶液1ml放置20分钟，再加1mol/L盐酸溶液1ml与醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.5）5ml,精密加入碘滴定液（0.01mol/L）15ml，密塞，摇匀，在20~25℃暗处放置20分钟，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定，近终点时加淀粉指示液，继续滴定并强力振摇，至蓝色消失；另精密量取供试品溶液5ml，置碘瓶中，加醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.5）5ml，精密加入碘滴定液（0.01mol/L）15ml，密塞，摇匀，在暗处放置20分钟，用硫代硫酸钠滴定液（0.01mol/L）滴定，作为空白。同时用青霉素对照品同法测定作对照，算出供试品的含量。第26页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六（4）电位配位滴定法——汞量法1.原理*β－内酰胺类不直接与汞盐反应*β－内酰胺类水解产物可与汞盐2.青霉胺发生定量反应：青霉素药物与硝酸汞发生络合反应。先按2分子青霉胺与1分子汞离子的比例络合，发生第一次滴定突跃，但突跃范围很小，变化比较平缓，不宜用于做终点，继续用硝酸汞滴定时，青霉胺分子与汞离子按1:1的比例络合，生成稳定的络合物——青霉胺络汞，发生第二次滴定突跃。其突跃范围较大，变化较急剧，宜于确定终点。计算青霉素胺含量并进行结果讨论：（1）电位法指示终点，以第二次滴定突跃为终点反应摩尔比1:1（2）空白试验用未降解样品测定（3）优点不需标准品第27页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六三、抗生素效价测定和微生物检定法1、稀释法：稀释法是抗生素效价测定最简单的方法之一。一般是在一系列的试管中用液体培养基逐管将抗生素做2倍稀释，并于各个试管中加入同量的对该抗生素有高度敏感性的试验菌液。将各个试管放置于37℃的培养箱中培养24h，观察能抑制细菌生长的最低抗生素浓度作为测定终点。再与同法测得的抗生素标准品终点做比较，即可求得被测定抗生素的效价。第28页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六2、比浊法：细菌生长产生的浊度与细菌数的增加、细菌群体质量的增加和细菌细胞容积的增加之间，存在着相关性，在一定的范围内符合比耳定律。将抗生素标准品的稀释液与供试品的稀释液分别加入试管中，再加入已接种试验菌的液体培养基，摇匀，置37℃的培养箱中培养24h后，观察试验菌生长情况。由于抗生素浓度不同，试验菌受抑制的程度也不同，因而产生不同程度的混浊。用分光光度计测定其透光率或吸收度，用标准曲线法可测定出供试品的效价。取每mL含24.0、26.8、29.9、33.5和37.5U的链霉素标准品溶液各1mL，分别加入15支试管中(3个平行)。另取试管3支，每管中各加入供试品溶液1mL。于18支试管中各加入已接种试验菌的液体培养基9mL，摇匀。将标准品管和供试品管置37℃培养箱中培养2～4h后，取出，分别于每管中各加入12％甲醛溶液0.5mL，摇匀，即可于分光光度计上530nm处以未接种试验菌的液体培养基9mL，加蒸馏水1mL，12％甲醛溶液0.5mL，摇匀作为空白，测定各管内培养物的透光率。以透光度为纵坐标，链霉素浓度为横坐标绘制标准曲线，则可在标准曲线上查出供试品的效价。第29页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六3、琼脂扩散法：（即管碟法)管碟法是目前国际上测定抗生素效价的通用方法。我国药典收载的微生物检定法也是管碟法。此法灵敏度高，但操作较麻烦，影响试验结果的因素较多，需要从各个操作步骤严格控制试验条件，尽可能减小试验误差，才能使试验结果达到精密、准确。第30页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六管碟法的原理：管碟法是利用抗生素在摊布特定试验菌的琼脂培养基内扩散，形成含一定浓度抗生素的球型区，抑制了试验菌的繁殖，通过透明琼脂培养基，可观察到透明的抑菌圈。在一定的抗生素浓度范围内，对数浓度（剂量）与抑菌圈面积或直径成正比。方法设计是在同样条件下将已知效价的标准品溶液与未知效价的供试品溶液的剂量反应（抑菌圈）进行比较；当标准品和供试品是属于同一性质的抗生素时，标准品溶液和供试品溶液，对一定试验菌所得的剂量反应曲线，在一定剂量范围内应互相平行。根据以上原理，可设计为一剂量法、二剂量法及三剂量法等，从而可以较为准确地测定供试品的效价。第31页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六四、青霉素药物杂质检查高分子杂质——分子量大于青霉素药物本身的杂质总称。外源性杂质蛋白、多肽、多糖或抗生素与蛋白、多肽、多糖的结合物。主要来自于发酵工艺，致敏，如青霉噻唑蛋白、青霉噻唑多肽。杂质分类：基本特点－对青霉素而言,青霉噻唑多肽－外源性的（2400～3500）青霉素聚合物－内源性的（聚合度）母核参与的聚合反应－N型聚合反应,侧链参与的聚合反应－L型聚合反应,特点：第32页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六（1）生产过程中的任何蛋白或碎片都可带入产品中，易与药物形成多肽类杂质（2）形成的聚合物也可发生不同程度的降解（3）异构体之间可以相互聚合－L-L、D-D、L-D（4）高分子杂质与生产工艺密切相关第33页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六高分子杂质的控制方法1、凝胶色谱－自身对照外标法*凝胶色谱法：利用凝胶的分子筛作用，让药物分子自由的进入到凝胶颗粒内部，而高分子杂质被排阻的原理进行的。故此大分子则先流出色谱柱，小分子后出峰而得以分离。*分析方法：1、HPLC系统2、简单测定系统3、色谱适用性条件：（1）蓝色葡聚糖在高分子分离中的N＞2500/m，拖尾因子0.75～1.5（2）峰面积的RSD＜5％第34页，共42页，2022年，5月20日，13点13分，星期六2、分子排阻色谱法

【检查】青霉素聚合物填充剂葡聚糖凝胶G-10（