2022-2023 学年 苏教版 选择性必修三 基因工程的基本操作程序之将目的基因导入受体细胞、目的基因及其表达产物的检测鉴定 教案

第3课时基因工程的基本操作程序之将目的基因导入受体细胞、目的基因及其表达产物的检测鉴定课程内容标准核心素养对接阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞和目的基因及其表达产物的检测鉴定。科学思维——比较目的基因导入不同受体细胞的方法、目的基因及其表达产物的检测鉴定方法。知识点1将目的基因导入受体细胞受体细胞不同，导入目的基因的方法不同：细胞类型转化方法转化过程植物细胞农杆菌转化法(主要)目的基因插入Ti质粒的T－DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→插入植物细胞中染色体的DNA上→目的基因的遗传和表达动物细胞显微注射法(主要)受精卵→显微注射→受精卵移植到处于相同发情周期的母畜子宫内→受精卵发育→获得具有新性状的动物病毒感染法用病毒DNA与目的基因一起构建的载体，去感染受体动物细胞，也能使目的基因导入动物细胞内微生物细胞Ca2＋处理法Ca2＋处理微生物细胞→感受态细胞→将重组的基因表达载体与感受态细胞混合在缓冲液中→在适宜的条件下完成转化知识点2目的基因及其表达产物的检测鉴定检测水平检测对象检测内容检测方法结果显示分子水平的检测DNA检测转基因生物的染色体上是否插入了目的基因DNA分子杂交法(基因探针＋待测转基因生物的DNA)是否显示出杂交带mRNA检测目的基因是否转录分子杂交法(基因探针＋待测转基因生物的mRNA)蛋白质检测目的基因是否翻译成蛋白质抗原—抗体杂交法个体水平的检测性状包括抗虫、抗病的接种试验，抗冻的耐寒试验，以确定是否有抗性及抗性程度(1)农杆菌转化过程中，含有目的基因的重组Ti质粒可转移到植物细胞内。(×)(2)可利用噬菌体DNA与目的基因一起构建的载体感染动物细胞。(×)(3)DNA分子杂交遵循碱基互补配对原则。(√)(4)基因探针是用放射性同位素或荧光标记的已知DNA片段。(√)(5)检测目的基因是否成功表达可用抗原—抗体杂交法。(√)(6)基因工程是否成功需进行个体生物学水平的鉴定。(√)eq\x(教材P97“旁栏思考题”)1.由于受体细胞的不同，导入目的基因的方法也不尽相同，那么，构建的基因表达载体会不会相同呢？提示当受体细胞不同时，导入目的基因的方法也有所不同。因此，构建的基因表达载体有可能不同。例如，用于构建番茄抗多聚半乳糖醛酸酶基因表达载体的是农杆菌Ti质粒，该质粒含有T－DNA(转移DNA)，能使目的基因插入植物细胞染色体的DNA上，使目的基因得到稳定的遗传和表达。而受体细胞是动物细胞时，常用某些病毒DNA与目的基因一起构建表达载体。eq\x(教材P98“旁栏思考题”)2.实验表明，感受态细胞由于细胞质膜通透性改变而容易接受外来的DNA。你能推测其原理吗？提示感受态细胞的细胞质膜通透性改变，使DNA易于通过细胞质膜进入细胞。所谓感受态细胞，就是受体细胞处于摄入DNA的状态。经Ca2＋处理后，细胞膨胀，细胞质膜通透性增大，使重组DNA容易进入细胞，转化效率提高。感受态细胞无特异性，对各种外来的DNA都能接受。探究点一将目的基因导入受体细胞下面为利用农杆菌转化法制备转基因植物的过程图，据图回答下列问题：(1)重组Ti质粒的构建需要哪些酶的作用？提示限制酶、DNA连接酶。(2)在用土壤农杆菌转化法将目的基因导入植物细胞的过程中，一定要将目的基因插入到Ti质粒的T－DNA上的原因是什么？提示农杆菌中的Ti质粒上的T－DNA(可转移的DNA)可转移至被侵染的细胞，并且整合到该细胞的染色体DNA上，使目的基因得到稳定的遗传和表达。(3)将基因表达载体导入农杆菌时，应怎样处理农杆菌？提示基因表达载体(重组质粒)导入农杆菌时，要用Ca2＋处理农杆菌，细胞质膜的通透性改变，使其处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态，利于重组质粒的导入。(4)图中过程①利用了什么技术？其原理是什么？提示利用了植物组织培养技术；原理是植物细胞的全能性。(5)在制备转基因动物的过程中常用的受体细胞是什么？欲培育转基因动物还需要什么技术？提示常用的受体细胞是受精卵。培育转基因动物还需要早期胚胎培养技术、胚胎移植技术。1.农杆菌转化法中的两次拼接、两次导入(1)两次拼接：第一次拼接是将目的基因拼接到Ti质粒的T－DNA上；第二次拼接(非人工操作)指被插入目的基因的T－DNA拼接到受体细胞染色体的DNA上。(2)两次导入：第一次导入是将含目的基因的重组Ti质粒导入农杆菌；第二次导入(非人工操作)是将含目的基因的T－DNA导入受体细胞。2.受体细胞类型(1)将目的基因导入植物细胞培育转基因植物时，受体细胞可以是体细胞和受精卵。(2)将目的基因导入动物细胞培育转基因动物时，受体细胞通常是受精卵，一般不能用体细胞，因为高度分化的动物体细胞的全能性受到限制。(3)大肠杆菌和酵母菌在基因工程中都可以作为受体细胞，但又有所不同。大肠杆菌为原核细胞，而酵母菌为真核细胞(具有多种细胞器)，所以当目的蛋白质需经内质网和高尔基体进一步加工时，酵母菌比大肠杆菌更有优势。[例1]下图为科学家通过基因工程培育抗虫棉时，从苏云金杆菌中提取抗虫基因“放入”棉花细胞中，与棉花的DNA分子“结合起来”而发挥作用的过程示意图。以下相关说法不正确的是()A.图中Ⅰ是质粒，步骤①需要用到限制酶和DNA连接酶B.图中Ⅱ是含目的基因的重组质粒，步骤②是将重组质粒导入棉花细胞C.图中Ⅲ是农杆菌，通过步骤③将目的基因导入植物细胞D.剔除培育成功的抗虫棉体内的四环素抗性基因不会影响抗虫基因的表达答案B解析图中Ⅰ为质粒，步骤①为基因表达载体的构建，需要用到限制酶和DNA连接酶，A正确；图中步骤②是将重组质粒导入农杆菌，B错误；基因的表达具有一定的独立性，剔除抗虫棉体内的四环素抗性基因不影响抗虫基因的表达，D正确。[例2](多选)下列关于将目的基因导入受体细胞的说法中，正确的是()A.农杆菌在自然条件下感染双子叶植物或裸子植物，不会感染大多数单子叶植物B.将目的基因导入动物细胞可采用显微注射法或病毒感染法C.将用Ca2＋处理的大肠杆菌和目的基因混合于缓冲液，适宜温度下便可完成转化D.在显微注射法中，可将目的基因直接注射进动物受精卵中实现转化答案AB解析导入受体细胞的不只是目的基因，而是目的基因与载体构建的基因表达载体。探究点二目的基因及其表达产物的检测鉴定1.在农杆菌转化法中怎样检测目的基因是否成功插入到受体细胞的染色体DNA上？提示用DNA分子杂交技术进行检测，即将转基因生物的染色体DNA提取出来，在含有目的基因的DNA片段上用放射性同位素作标记，以此为探针，使探针与染色体DNA杂交，如果出现杂交带，则表明目的基因已成功插入到染色体DNA上。2.怎样检测成功导入的目的基因是否转录出相应的mRNA分子？提示从待测转基因生物细胞中提取mRNA分子，用已标记的目的基因片段作为探针与mRNA杂交，如果出现杂交带，表明目的基因转录出相应的mRNA分子。3.检测目的基因是否表达出相应的蛋白质用什么方法？其原理是什么？提示方法是抗原—抗体杂交法。其原理是抗原和抗体的特异性结合。4.目的基因表达出蛋白质是不是就意味着基因工程取得了成功呢？如不是，还需怎样检测？提示目的基因表达出蛋白质并不意味着基因工程一定取得了成功。还需要进行个体水平的检测。5.如果目的基因是抗虫基因，在个体水平上应怎么检测？如果目的基因是耐盐基因呢？提示如果目的基因是抗虫基因，则要进行抗虫接种实验。如果目的基因是耐盐基因，则要用一定浓度的盐水浇灌。1.目的基因的检测鉴定的方法汇总2.不同分子检测的原理、场所、探针的异同[例3]研究表明，将豌豆早枯病毒(PEBV)的复制酶C端编码序列转入烟草后，转基因烟草会对PEBV表现出抗性。下列说法正确的是()A.该过程需要用到限制酶和DNA聚合酶来构建基因表达载体B.将豌豆早枯病毒(PEBV)的复制酶C端编码序列导入烟草细胞最常用的方法是Ca2＋处理法C.只要在转基因烟草细胞内检测出豌豆早枯病毒(PEBV)的复制酶C端编码序列就代表成功了D.检测转基因生物DNA上是否插入了目的基因，可以用DNA分子杂交法答案D解析该过程用到限制酶和DNA连接酶，A错误；将基因导入植物细胞常用农杆菌转化法，B错误；转基因烟草对PEBV表现出抗性才能代表成功，C错误；检测转基因生物DNA上是否插入目的基因，可以用DNA分子杂交法，D正确。[例4]在检测抗虫基因是否成功转入棉花基因组的方法中，不属于分子水平的是()A.观察害虫吃棉叶是否死亡B.检测目的基因片段与DNA探针能否形成杂交带C.检测目的基因转录形成的mRNA与DNA探针能否形成杂交带D.检测目的基因表达产物蛋白质能否与特定抗体形成杂交带答案A解析A项属于个体生物学水平的检测；B、C两项利用分子杂交技术，观察目的基因及目的基因转录形成的mRNA能否与DNA探针进行杂交形成杂交带，为分子水平的检测；D项利用抗原—抗体杂交的原理，检测基因表达产物能否与特定抗体形成杂交带，为分子水平的检测。思维导图晨读必背1.农杆菌Ti质粒的T－DNA可进入植物细胞并整合到其染色体DNA上。2.感受态细胞由于细胞质膜通透性改变而容易接受外来的DNA。3.基因探针是指用放射性同位素或荧光标记的已知DNA片段。4.抗原－抗体杂交法的原理是抗原与抗体的特异性结合。5.利用放射性同位素或荧光标记的已知DNA片段既可以检测基因，也可以检测基因的转录产物RNA。随堂检测1.在基因工程中，为将目的基因导入受体细胞常采用土壤农杆菌转化法，在土壤农杆菌中常含有一个Ti质粒。某科研小组欲将某抗虫基因导入某植物，下列分析错误的是()A.Ti质粒含有对宿主细胞生存具有决定性作用的基因，是基因工程中重要的载体B.用Ca2＋处理细菌是重组Ti质粒导入土壤农杆菌中的重要方法C.土壤农杆菌成功感染植物细胞，可通过植物组织培养技术将该细胞培养成具有抗虫性状的植物D.若能够在植物细胞中检测到抗虫基因，则说明将重组质粒成功地导入到了受体细胞答案A解析Ti质粒是基因工程中重要的载体，不含有对宿主细胞生存具有决定性作用的基因，A错误；用Ca2＋处理细菌可增加细胞质膜的通透性，是重组Ti质粒导入土壤农杆菌中的重要方法，B正确；转基因成功的植物细胞，可通过植物组织培养技术，获得转基因植物，C正确；在植物细胞中检测到抗虫目的基因，说明重组质粒成功地导入到了受体细胞，但不能证明其能表达，D正确。2.(多选)将目的基因导入受体细胞是实施基因工程的第三步，下列有关说法不正确的是()A.将目的基因导入裸子植物和单子叶植物细胞常用农杆菌转化法B.转基因动物的培育过程中受体细胞一般选择受精卵C.用Ca2＋处理受体细胞是将目的基因导入微生物细胞中采用最多的方法D.可利用噬菌体DNA与目的基因一起构建表达载体，感染动物细胞实现转化答案AD解析导入裸子植物和双子叶植物细胞常用农杆菌转化法，A错误；将目的基因导入动物细胞，因为受精卵全能性高，故一般选择受精卵作为受体细胞，B正确；Ca2＋处理可增大微生物细胞质膜的通透性，使其成为易于吸收周围环境中DNA分子的感受态，易于DNA的导入，C正确；噬菌体是细菌病毒，其宿主细胞是细菌，可利用动物病毒DNA与目的基因一起构建表达载体，感染动物细胞实现转化，D错误。3.当褐飞虱危害水稻时，某野生水稻中的抗褐飞虱基因Bph14可感知这一信号并调动其他基因的抗虫机制，即抑制害虫的取食和消化，使害虫的生长发育受阻，从而使野生水稻免受危害。为使种植水稻稳产和增产，科研人员将抗褐飞虱基因Bph14与大肠杆菌的质粒重组后导入普通水稻细胞，培育出转基因抗褐飞虱水稻。回答下列问题：(1)采用PCR技术在体外获得大量的基因Bph14时，扩增目的基因的前提是，以便设计合成种引物。引物的作用是_______________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)构建基因表达载体时，应选用两种不同限制酶分别切割目的基因和Ti质粒，目的是(答一点)。基因Bph14和质粒中抗生素抗性基因应位于Ti质粒的片段中，原因是__________________________________________________________________________________________________________________________________。(3)将构建的基因表达载体导入水稻组织细胞后，欲检测转基因水稻是否含有基因Bph14，可采用DNA分子杂交技术，该技术应以作为探针；若从个体水平上进行检测，则需要做实验。答案(1)有一段已知目的基因(基因Bph14)的核苷酸序列2使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸(2)防止质粒和目的基因(基因Bph14)自身环化；防止目的基因(基因Bph14)和质粒反向连接T－DNATi质粒上只有T－DNA片段能够转移并整合到水稻细胞的染色体DNA上(3)用放射性同位素标记的含有基因Bph14(目的基因)的DNA片段抗虫接种(将褐飞虱接种到转基因水稻植株的叶片上)解析(1)PCR技术扩增目的基因的前提是已知一段目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成2种引物，因为基因具有两条链，每一条链都需要一个引物，引物的作用是使热稳定的DNA聚合酶(Taq酶)能从引物的3