实验三、细胞色素C的制备课件

实验三、细胞色素C的制备和测定

9学时一、实验目的：1、通过细胞色素C的制备，了解蛋白质分离纯化的一般原理和步骤。2、掌握制备细胞色素C的操作技术及含量测定方法。二、原理：

细胞色素C包括多种能够传递电子的含铁蛋白质总称。广泛存在于各种动植物组织和微生物中。它是呼吸链中极重要的电子传递体，细胞色素C（cytochromec，CytC）只是细胞色素的一种。它在呼吸链上位于细胞色素还原酶和细胞色素氧化酶之间。线粒体中的细胞色素绝大部分与内膜紧密结合，仅有细胞色素C结合轻松，较易被分离纯化。

细胞色素C是一种细胞呼吸激活剂。在临床上可以纠正由于细胞呼吸障碍引起的一系列缺氧症状，使其物质代谢、细胞呼吸恢复正常，病情得到缓解或痊愈。在自然界中，细胞色素C存在于一切生物细胞里，其含量与组织的活动强度成正比。本实验以新鲜动物心脏为材料提取、纯化细胞色素C，制备其粗品溶液，方法简单易操作。

三、试验材料和方法1、材料：新鲜（冷冻）动物心脏2、试剂（1）25%(NH4)2SO4，12%BaCl2，联二亚硫酸钠。（2）人造沸石：白色颗粒，40-60目。（3）20%三氯乙酸（TCA）、1mol/LH2SO4、1mol/LNH4OH溶液、0.2%NaCl、细胞色素C标准液（3mg/ml）3、仪器：绞肉机、电磁搅拌器、离心机、分光光度计、透析袋、层析柱、烧杯、纱布等四、实验方法：1、材料处理

新鲜或冷冻动物心脏，除尽脂肪、血管和韧带，洗尽积血，切成小块，放入绞肉机中绞碎（两遍）。2、细胞色素C粗品制备（1）提取：称取动物心脏碎肉500克，加自来水800毫升酸化水（水预先用6-8毫升，1mol/L的硫酸酸化）。用电磁搅拌器搅拌提取，用1mol/L的硫酸调pH=4.0（需要不断调整），搅拌提取2小时。用1mol/L的氨水调pH=6.0，停止搅拌。四层纱布挤压过滤，收集滤液。（2）中和：

用1mol/L的氨水调滤液pH=7.2-7.5，利用等电点沉淀杂蛋白，静置20-30min，使沉淀沉下。虹吸上清夜，过滤除杂质，下部浑浊液离心（4000rpm,10min）。合并得到的红色清液，测量体积。

（4）洗脱吸附完毕，在柱内洗涤：依次用30ml自来水、去离子水、0.2%氯化钠溶液、去离子水洗柱。然后用25%硫酸铵溶液洗脱（流速小于1ml/min），收集红色洗脱液（洗脱液一旦变白，立即停止收集），测量体积（控制在15ml左右）。洗脱完毕，回收人造沸石，可再生使用。（6）三氯乙酸（TCA）沉淀按8%体积滴加20%TCA，边加边搅拌。此时细胞色素带正电荷，与其结合生成可逆沉淀析出，立即离心(4000rpm,10min),收集沉淀（若上清液仍为红色，倒出后再补加5%体积的TCA，再次离心，收集沉淀）。沉淀用少量去离子水溶解（体积不超过10mL）。

3、细胞色素C含量测定

细胞色素C含量的标准曲线试管编号1234567（样品液)(ml）标准溶液（ml）00.20.40.60.81.04蒸馏水（ml）43.83.63.43.23.00还原粉（联二亚硫酸钠）少许（约3mg）A520nm

以细胞色素C的浓度（mg/ml）为横坐标，以吸光度A520nm为纵坐标制作标准曲线，从标准曲线上计算出样品液中细胞色素C的质量（mg）。注意事项：1、酸水提取时，由于组织液的释出使pH上升，因此需不断调整pH直至稳定在pH3.5-4.0。2、为使细胞色素C充分被沸石柱吸附，吸附时流速应该慢些。洗脱时同样控制流速慢些，使细胞色素C在比较少体积内被充分洗脱出来。3、盐析时需加入粉末状硫酸铵，并且边加边搅拌，切忌一下子到进去，造成局部浓度过大使细胞色素C被盐析。4、三氯乙酸是一种蛋白变性剂，可使蛋白质变性沉淀。要通过控制三氯乙酸的浓度和作用时间，使其产生的是可逆沉淀，达到进一步纯化作用。因此必须要逐滴加入三氯乙酸，搅匀后尽快离心，避免局部酸浓度过大和接触时间过长，产生细胞色素C不可逆变性沉淀造成损失。5、透析脱盐是利用细胞色素C分子较大，不能通过一定截留值的半透膜，而其中的盐由于分子较小，浓度很高，容易透过半透膜从高浓度向低浓度的水相移动，达到去除效果。在透析前一定要检查透析袋有无渗漏6、为尽量减少损失，在每个操作过程都要细心，例如过滤用的纱布、滤纸事前一定要用少量水润湿。7、加入过多还原粉（联二亚硫酸钠）会使测定溶液迅速变混浊而无法比色，因此