研究生分子生物学知识点

6/6研究生分子生物学知识点分子生物学知识点总结

1.蛋白质组(proteome)：proteinsexpressedbyagenome,即基因组表达的

全套蛋白质。蛋白质组学（Protemics）则是以蛋白质组为研究对象，从整体角度，分析细胞或组织内蛋白质构成的动态变化和活动规律的科学。（相互作用网络PPI）

2.表达蛋白质组学研究的基本流程：蛋白样品的制备及定量-总蛋白的双向凝

胶电泳（染色）-凝胶分析软件分析-胶内酶解（胰肽酶）-质谱分析（肽质量指纹图谱）-数据库搜索鉴定蛋白性质

3.双向凝胶电泳：相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分

子量，先经等电聚焦电泳(isoelectricfocusing，IEF)，再经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）把复杂的蛋白质成分分离。

4.比较蛋白质组学：通过比较同一个体肿瘤细胞（组织）与正常细胞（组织）

之间蛋白质在表达数量、表达位置和修饰状态上的差异，发现与肿瘤发病或者发展有关的分子标记，用来作为肿瘤诊断的肿瘤相关蛋白。

5.软电离：所谓“软电离”是指样品分子电离时保留整个分子的完整性，不会

形成碎片离子。

6.肿瘤血清蛋白质分析方法（tumorserologicproteomeanalysis，SERPA）：

是从肿瘤免疫学观点出发建立的一种蛋白质组学和肿瘤免疫学相结合的方法。

SERPA其实验过程如下：

①双向电泳分离肿瘤组织（细胞）总蛋白质；

②转膜；

③建立westernblotting蛋白质印迹反应图谱（与患者或正常人血清反应）；

④软件分析确定差异反应的蛋白质斑点；

⑤质谱鉴定和生物信息对肿瘤组织平行胶(replicagel)中相应的差异蛋白

质点进行鉴定，筛选出肿瘤分子标志物；

⑥用ELISA、免疫组化等方法对该分子标志物进行原位验证，或者进一步分

析该蛋白功能，研究其在肿瘤进展中发挥的作用。

7.蛋白质芯片：是将大量蛋白质分子按预先设置的排列固定于一种载体表面，

形成微阵列，根据蛋白质分子间特异性结合的原理，构建微流体生物化学分析系统，以实现对生物分子的准确、快速、大信息量的检测。

8.功能蛋白质组学：是指对蛋白质间、蛋白质与DNA/RNA间的相互作用的研究。

以细胞内与某个功能有关或某种条件下的一群蛋白质为主要研究内容，由此建立细胞内外信号传递的复杂网络。研究方法主要有：

●蛋白质芯片技术

目前常用蛋白质芯片有：

1.SELDI-TOF-MS蛋白质芯片

2.抗体芯片

3.靶蛋白质芯片

4.液相蛋白质芯片

●噬菌体展示技术

●酵母双杂交系统

●免疫共沉淀

9.免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）：是以抗体和抗原之间的专一性作用

为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

10.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理：根据蛋白质分子量不同分离复杂蛋白质

成分。1.制备凝胶试剂：丙烯酰胺（单体）；亚甲双丙烯酰胺（胶联剂）二者比例29：1；母液浓度30%；过硫酸铵（引发剂引发交联）；N,N,N,’N’-四甲基乙二胺（TEMED）(加速剂)十二烷基磺酸钠（SDS）（阴离子变性剂）2.蛋白上样缓冲液3.电泳缓冲液4.考马斯亮蓝R250染色液5.脱色液

11.Westernblotting基本原理:将SDS分离的蛋白质转移至硝酸纤维素

膜(nitrocellulosemembrane)上,在膜上进行固相免疫化学染色,原位显示蛋白质带,从而在已知分子量的基础上对蛋白质进行定性、定量分析。

12.Southwesternblotting基本原理:细胞核蛋白提取物经SDS后,转移

至NCM上,然后用标记的DNA探针检测转移至膜上的蛋白质。细胞死亡形式

表现Celldeath

细胞坏死

Apoptosis

PCD:

细胞生命现象不可逆的停止细胞结构和功能的不可逆丧失。细胞死亡并非与机体死亡同步。正常组织中也发生细胞死亡，它是维持组织机能和形态所必需的。细胞受到外来的急性的强力的致病因素作用下，细胞正常代谢活动被强行中断而引起的“意外”的、被动性死亡过程；只见于病理情况下。细胞肿胀，线粒体和内质网肿胀。核染色质随机降解呈絮状,蛋白合成减少。细胞膜、溶酶体破裂,细胞内容物流出,引起周围炎症指在一定的生理和病理条件下，多细胞有机体为调控机体发育、维持内环境稳定，由基因控制并遵循一定程序的细胞主动性死亡过程.又程序性细胞死亡(programmedcelldeath,PCD).凋亡小体：胞膜皱缩内陷、反折，包围凝集断裂的染色质、胞质、细胞器等形成芽状、泡状突起并分离脱落，形成一些有膜包被，内涵物不外溢的小块，称凋亡小体（apoptoticbody）。多细胞生物体在生长发育过程中，细胞在基因调控下，按照一定时空顺序发生的受到严格程序控制的生理性死亡。“特殊的定时自杀”PCDApoptosis功能性概念发育学概念形态学概念仅存在于发育细胞可存在于发育和成体细胞

大部分凋亡是PCD。PCD的最终结果是凋亡

某些凋亡是非程序性。如细胞毒物诱导的凋亡

13.凋亡的生物学意义1、确保正常生长发育、2、维持内环境稳定、3、防御功能

14.细胞凋亡的形态学特征：细胞皱缩;2.细胞质浓缩;3.染色质边集核膜下，呈块状、新月形，4.凋亡小体形成；5.凋

亡小体内有结构完整的细胞器。

细胞凋亡的生化特征：染色质DNA片段化内源性核酸内切酶活化，将核小体间的连接DNA降解，形成长度为

180～200bp整倍数的寡聚核苷酸片段。在琼脂糖凝胶电泳中呈特征性的“梯状”条带（DNAladder：细胞凋亡时DNA在核小体间断裂(DNAfragmentation)形成一些

DNA片断，经过提取和纯化后在凝胶电泳上产生n条梯状条带，故称之为DNALadder，是判断DNA损伤的重要标准）

15.Caspase：含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，是一组对底物的天冬氨酸部位

有特异水解作用的，活性中心富含半胱氨酸的蛋白水解酶。

Caspase功能：1.细胞骨架蛋白和核纤层蛋白，导致细胞解体成凋亡小体

2激活DNA酶（Caspase-activatedDNase，CAD）。CAD:Caspase激活的DNA

酶正常情况下CAD与其抑制剂ICAD结合，在胞质内，无活性。凋亡时Caspase水解ICAD,游离的CAD有活性，进入胞核，切割DNA。

3灭活凋亡抑制物:如Bcl-2、ICAD

4水解与DNA损伤修复相关的酶和蛋白质

如聚ADP核糖多聚酶（poly-ADP-ribosepolymerase,PARP）

16.死亡受体途径外源性途径：死亡受体TNFR1、Fas、CAR1、NGFR、DR3、DR4、

DR5等是一类通过与相应配体结合，传递细胞凋亡信号的细胞膜蛋白。

通路（pathway）死亡配体（细胞外）-死亡受体（细胞膜）--相关蛋白（中介蛋白，细胞质内）--激活Caspase8—激活Caspase3细胞凋亡

17.线粒体损伤途径内源性途径：线粒体是细胞生命活动的控制中心，它不仅

是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中心，而且是细胞凋亡的调控中心。

①释放细胞色素C（Cyt.c）

②释放凋亡诱导因子（apoptosisinducingfactor，AIF）和限制性核酸内切酶G（EndoG）③释放Smac/Diablo(thesecondmitochondria-derivedactivatorofcaspase,Smac)(directIAPbingdingprotein,Diablo)④释放活性氧ROS18.细胞周期：

1.G1期（first）从到前的一段时期，又

称合成前期，此期主要合成RNA和。该期特

点是活跃，迅速合成RNA和蛋白质，细胞体

积显著增大。这一期的主要意义在于为下阶

段S期的DNA复制作好物质和能量的准备。

2.S期（synthesis）即DNA合成期，在此

期，除了合成DNA外，同时还要合成。DNA复

制所需要的酶都在这一时期合成。

3.G2期（secondgap）期为DNA合成后期，是有丝分裂的准备期。在这一时

期，DNA合成终止，大量合成RNA及蛋白质，包括和等。

4.M期：细胞分裂期。

19.细胞周期蛋白或周期素（Cyclins)：一类结构类似、能结合并调节CDK活性

的蛋白家族，哺乳动物至少有10种，14个成员（cyclinA、B1-2、C、D1-

3、E、F、G1-2、H、I、K）。cyclins-CDKs-CKIs系统

20.HIF-1a：几乎参与了对糖酵解每一步的调控；PI3K/Akt途径；Myc；P53等

21.Cyclin：周期素/周期蛋白，是CDK（周期素依赖的蛋白激酶）的调节亚基，

分别在细胞周期的不同时期积累，激活CDK，使其具有催化关键底物的磷酸化修饰并调节其活性。参与细胞周期中不同时相的调节。

/S检验点：在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restrictionpoint)，22.G

1

控制细胞由静止状态的G

进入DNA合成期，相关的事件包括：DNA是否损伤？

1

细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？

23.cyclinbox：各类周期蛋白均含有一段约100个氨基酸的保守序列，称为周

期蛋白盒(cyclinbox)，是与CDK相互作用的活性区域。

24.RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是将双链RNA导入细胞内引起特异基

因的mRNA降解的一种细胞反应过程。属于转录后基因沉默的一种。

25.试述CDK1活性的调控机制？

CDK的催化活性受到激活因素与抑制因素两方面的调节。激活因素中，目前认为CDK与周期素的结合以及保守的苏氨酸残基的磷酸化是较为重要的两种调节因素。抑制因素中，CDK的N-端氨基酸残基的抑制性磷酸化以及抑制蛋白的结合是主要的调节因素。磷酸化修饰的激活作用：CDK的激活还必须依赖于其保守的苏氨酸残基的磷酸化，如在人CDK1（p34cdc2）的Thr161和CDK2的Thr160的磷酸化，就与这两个酶的激活相关。催化CDK1和CDK2磷酸化的酶是CAK（CDKactivitingkinase），是另一种蛋白激酶CDK7-CyclinH复合物。当磷酸酶-1将此位点的磷酸水解，P34cdc2又失去激酶活性。磷酸化修饰的抑制作用在人的CDK1和CDK2中，Thr14和Tyr15残基的磷酸化可抑制CDK的催化活性。催化Thr14和Tyr15磷酸化的是两种不同的蛋白激酶，使Thr14磷酸化的为蛋白激酶Myt1，使Tyr15磷酸化的是蛋白激酶Wee1/Mik1。催化Thr14和Tyr15脱磷酸化的是蛋白磷酸酶CDC25。

26.DNA损伤又称基因突变：是DNA复制过程中发生的DNA核苷酸序列的改变，

从分子水平看是DNA分子碱基顺序或数目的改变。突变的形式包括：替换、插入、缺失、重排。

27.突变形式：（一）点突变：指DNA分子上一个碱基对的变异，碱基替换包括：

转换（同型）、颠换（异型）典型疾病：镰刀型细胞贫血，碱基颠换AT-TA；

（二）插入和缺失-框移突变（frame-shiftmutation）:缺失和插入引起的三联体密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸种类、排列顺序发生改变。

(地中海贫血)

（三）重排：指DNA分子内发生较大片段的交换，也称重组。移位的DNA片段可在新位点颠倒方向反置（倒位），也可在染色体之间发生交换重组。

突变的意义：产生新基因，出现新性状，为生物进化提供了最原始、最根本的的材料，是进化的分子基础

28.DNA损伤的修复：指针对已发生的缺陷而进行的补救机制。

直接修复：修复酶识别出损伤部位直接修复，不用切除DNA或切除碱基。包括1.光修复、2.链断裂的直接重接、3.碱基的直接插入、4.转甲基作用

切除修复(excissionrepair)：在DNA内切酶、外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等多种酶的共同作用下，先将DNA受损的单链部位切除，然后以另一条链为模板，合成一段正确配对的碱基序列来修补缺口。DNA损伤最普遍的修复形式。

切除修复的特点：（1）切除修复利用的是化学能ATP，也叫暗修复。（2）修复

发生在复制前。（3）修复的对象是亲代DNA。

重组修复：当DNA损伤较大、较严重，无法及时修复或缺乏切除修复酶系统，可跳跃损伤部位复制，子链形成缺口，复制结束后，在重组基因rec编码的酶（Rec蛋白）、DNA聚合酶、DNA连接酶等的作用下，将无损母链的DNA片段移到子链缺口，进行重组修复。发生在复制后，故又称“复制后修复”

DNA损伤重组修复的过程及特点：过程：（1）复制：损伤母链复制时，越过损伤部位，子链对应位点留下空缺；无损母链复制成完整双链。

(2)重组：空缺诱导产生重组酶(Rec蛋白)，RecA与空缺区结合，并催化子链空缺与无损母链相应片段重组交换(RecBCD蛋白);有缺子链与无损母链重组，空缺转移到无损母链，有缺子链完整，损伤母链仍然保留。

(3)再合成：转移后的母链空缺以新的互补子链为模板，在DNA聚合酶和连接酶的催化下，重新修复缺口;

DNA链的损伤并未除去，随着复制的继续，损伤ＤＮＡ链将在群体中逐步“稀释”。修复发生在复制后，对象是子代DNA.

SOS修复：DNA严重损伤难以复制或DNA复制系统受抑制的紧急情况下，为了保证DNA链的完整性，应急产生校对功能低的修复酶，采用填补任意碱基的修复方式。

这是具有差错的修复，是对极为不利的外界环境的应急反应，故称SOS修复，也称差错倾向修复。SOS反应广泛存在于原核生物和真核生物。细胞能存活，但变异率高，DNA保留错误较多，会引起广泛、长期的突变。自然界也因此而变得生物种类繁多。

信号转导通路★★★

29.受体：是细胞膜上或细胞内可以特异地识别与结合化学信号物质（配体）并

能激发靶细胞产生特异生物效应的特殊蛋白质分子。

G蛋白：广义的G蛋白是指所有能与GTP或GDP结合的蛋白质。细胞信号转导中扮演重要角色的G蛋白主要有两类：异三聚体G蛋白（与膜受体偶联，位于细胞膜内侧，由三个亚基组成，一般称为经典G蛋白或大G蛋白。）、单体G蛋白（存在于不同的细胞部位的小分子量G蛋白，也称为“小G蛋白”，是单亚基蛋白。Ras是第一个被发现的小G蛋白。）

SH2结构