层析分离技术二吸附层析课件

吸附(adsorption)：溶质从液相或气相转移到固相的现象。吸附操作：利用固体吸附的原理从液体或气体中除去有害成分或分离回收有用目标产物的过程。

应用：原料液脱色除臭，目标产物提取、浓缩和粗分离。吸附剂：吸附操作所使用的固体材料一般为多孔微粒或多孔膜，具有很大的比表面积，称为吸附剂或吸附介质。一、吸附概述吸附(adsorption)：溶质从液相或气相转移到固相的现1马王堆中有木炭，可能用于吸湿和防腐?...冰箱中除臭，活性炭。工业应用，产品分离、脱色。马王堆中有木炭，可能用于吸湿和防腐?...22005年11月13日下午，位于吉林省吉林市的中国石油天然气集团公司吉林石化分公司双苯厂的苯胺车间发生剧烈爆炸，泄漏进松花江的苯类污染物总量在100吨左右。

1400吨活性炭治理水污染

2005年11月13日下午，位于吉林省吉林市的中国石油天然气32012年1月广西龙江镉污染事件“目前使用聚合氯化铝将离子状态的镉固化，是目前治理龙江河镉污染最重要的措施之一，而烧碱则是将调节河水PH值促进聚合氯化铝发生反应的重要物质。”

吸附作用2012年1月广西龙江镉污染事件“目前使用聚合氯化铝将离子状4吸附的特点：（1）不用或少用有机溶剂（2）操作简便，安全（3）生产过程pH变化小（4）从稀溶液分离溶质（5）

吸附剂对溶质的作用小（6）

吸附平衡为非线性（7）选择性差吸附的特点：5

固体内部分子所受分子间的作用力是对称的，而固体表面分子所受力是不对称的。向内的一面受内部分子的作用力较大，而表面向外一面所受的作用力较小，因而当气体分子或溶液中溶质分子在运动过程中碰到固体表面时就会被吸引而停留在固体表面上。

界面上分子和内部分子所受的力二、吸附过程理论基础1、基本概念固体内部分子所受分子间的作用力是对称的，而固体表面分6固体表面分子(或原子)处于特殊的状态。固体内部分子所受的力是对称的，故彼此处于平衡。但在界面分子的力场是不饱和的，即存在一种固体的表面力，它能从外界吸附分子、原子、或离子，并在吸附表面上形成多分子层或单分子层。界面上分子和内部分子所受的力固体表面分子(或原子)处于特殊的状态。固体内部分子所受的力是7吸附作用：物质从流体相浓缩到固体表面吸附剂：表面上能发生吸附作用的固体吸附物：被吸附的物质多孔吸附剂：外表面与内表面组成非多孔吸附剂：比表面取决于外表面吸附作用：物质从流体相浓缩到固体表面8孔径和比表面积是评价吸附剂性能的重要参数一般来说，孔径越大，比表面积越小。比表面积直接影响溶质的吸附容量，而适当的孔径有利于溶质在空隙中的扩散，提高吸附容量和操作速度。孔径和比表面积是评价吸附剂性能的重要参数92、吸附的类型基于吸附剂与溶质之间的分子间力。溶质在吸附剂上吸附与否或吸附量的多少取决于溶质与吸附剂极性的相似性和溶剂的极性。可通过改变温度、pH值和盐浓度等物理条件脱附。物理吸附吸附剂表面活性点与溶质之间发生化学键合、产生电子转移现象，吸附稳定，不易脱附。采用破坏化学键合的化学试剂洗脱剂脱附。应用很少。化学吸附所用吸附剂称为离子交换剂，表面键合离子基团或可离子化基团，通过静电引力吸附带有相反电荷的离子，吸附过程发生电荷转移。一般通过提高离子强度或调节pH值的方法洗脱。离子交换2、吸附的类型基于吸附剂与溶质之间的分子间力。溶质在吸附剂上103、物理吸附力的本质定向力极性分子的永久偶极静电力诱导力极性分子与非极性分子之间的吸引力色散力非极性分子之间的引力（瞬间偶极）氢键力介于库仑引力与范德华引力之间的特殊分子间定向作用力非共价作用吸附质和吸附剂之间的作用力－范德华力3、物理吸附力的本质定向力极性分子的永久偶极静电力非共价11当分子间距离减小时，范德华力增大，但当分子间距离非常接近时，就明显地表现出斥力。当距离大于OB时，吸引力未表示出来。当吸附表面和分子间的距离减小时，其吸引力的能量逐渐增加，当距离减至分子半径OA时，达到最大值。当距离再减小时，推斥力急剧增加。当分子间距离减小时，范德华力增大，但当分子间距离非常接近时，124、吸附等温线吸附等温线：当溶质在液固两相间达到吸附平衡时，吸附剂上的平衡吸附质浓度q是液相游离溶质浓度c和温度T的函数。当温度一定时，q只和c有关，q=f(c)，q与c的关系曲线称为吸附等温线。生物分离中至少有四种等温吸附线(见图)。4、吸附等温线吸附等温线：当溶质在液固两相间达到吸附平衡时，131——Henry；2——Freundlich；3——Langmuir；4——矩形qc1234几种常见的吸附等温线qc1234几种常见的吸附等温线14（1）Henry型吸附平衡

在一定温度下，平衡时吸附剂吸附溶质浓度q*与液相溶质浓度c之间的关系为线性函数：

m为分配系数。

适应条件：在低浓度范围之内成立。当浓度较高时，吸附平衡常呈非线性，上式无效。（1）Henry型吸附平衡在一定温度下，平衡时15（2）Freundlich型吸附平衡

其经验公式为

其中，k和n为常数，n一般在1-10之间。

Freundlich等温线可描述大多数抗生素、类固醇、甾类激素等在溶液中的吸附过程。（2）Freundlich型吸附平衡其经验公式为16（3）Langmuir型吸附平衡Langmuir单分子层吸附理论：吸附剂表面有许多活性点，每个活性点具有相同的能量，只能吸附一个分子，并且被吸附的分子间无相互作用。A为表面活性中心。基于上述平衡，及假定单分子层吸附，得Langmuir型吸附平衡方程式中：qmax为吸附容量，kb为结合常数当n个分子在一个活性中心发生吸附时，即存在

此时有：（3）Langmuir型吸附平衡Langmuir单分子层吸17（4）矩形吸附平衡当吸附剂对溶质的吸附作用非常大时，存在n>10，或用前式表示Kb非常大，这时游离的溶质浓度对吸附浓度影响极小，接近不可逆吸附。吸附等温线为矩形（q＝常数）。如在固定化单克隆抗体的免疫亲和吸附中，一般存在n>10。（4）矩形吸附平衡当吸附剂对溶质的吸附作用非常大时，存在n18例：蔗渣木质素吸附重金属离子的吸附等温线Cd(II)Hg(II)Pb(II)例：蔗渣木质素吸附重金属离子的吸附等温线Cd(II)Hg(I19三、吸附层析1、基本原理在吸附层析法中，使用的固定相基质是颗粒状的吸附剂。在吸附剂的表面存在着许多随机分布的吸附位点吸附位点通过范德华力、静电引力与蛋白质和核酸等生物分子结合；其结合力的大小与各种生物分子的结构和吸附剂的性质有密切关系。三、吸附层析1、基本原理在吸附层析法中，使用的固定相基质是颗20在洗脱过程中，柱内不断地发生解吸、吸附，再解吸、再吸附的过程。经过一段时间以后，该物质会向下移动一定距离。此距离的长短与吸附剂对该物质的吸附力以及溶剂对该物质的解吸(溶解)能力有关。不同的物质由于吸附力和解吸力不同，移动速度也不同。在洗脱过程中，柱内不断地发生解吸、吸附，再解吸、再吸附的过程212、吸附剂的选择

具备条件：表面积大、吸附选择性好、稳定性强、颗粒均匀、成本低廉等

选择原则：由吸附剂本身和被吸附物质的理化性质而定。根据“相似相溶”原理，为了便于解吸附（洗脱），对于极性强的分离物，应选择极性小的吸附剂；而对于极性弱的分离物则选择极性强的吸附剂2、吸附剂的选择具备条件：表面积大、吸附选择性好、稳2220世纪50年代初期，Tiselius等用制备的羟基磷灰石[Ca5(P04)3OH]2（HA）分离蛋白质。目前国内已有商品出售

（1）羟基磷灰石

性质吸附容量高稳定性好（T＜85℃，pH5.5~10.0均可使用）使用广泛（可用于制备和纯化pro、酶、核酸等）分离效果好HA的Ca基团与生物分子表面的负电荷基团的作用，对分离起重要作用；而PO4基团与生物分子表面的正电荷的作用仅起次要作用20世纪50年代初期，Tiselius等用制备的23层析分离技术二吸附层析课件24使用HA作为固定相基质时应注意HA为干粉时，需事先浸泡膨胀达到2~3ml/g后，按1∶6加入缓冲液悬浮，除去细小的颗粒HA悬浮液需用旋涡振荡器混合，因为其他搅拌器如磁棒、玻棒等易破坏其晶体结构忌用柠檬酸缓冲液和pH＜5.5的缓冲液处理色谱柱再生时，先用1mol/LNaCl洗涤，然后用4倍床体积的平衡缓冲液冲洗即可细颗粒HA的操作容量和分辨率均较大颗粒高，但须采用较大直径的柱子使用HA作为固定相基质时应注意HA为干粉时，需事先浸泡膨胀达25

表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，当遇到较强的碱性化合物时，则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。（2）硅胶

柱层析硅胶变色硅胶（也称蓝胶）是以具有高活性吸附材料细孔硅胶为基础原料经过深加工制成的细孔硅胶为无色或微黄色透明状玻璃体，它的基本质量参数如下：平均孔距2.0-3.0MM表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，当遇到较26性质作用位点：含有很多硅醇基团(-Si-OH)的颗粒状极性吸附剂。它对氨基酸衍生物、甾体激素、皂甙类、类脂及色素等物质有结合力（吸附作用）。含水量：含水量高，则吸附性（活性）小，当其表面游离水含量＞17%时，其结合力很小；此时仅能作为分配层析的固定相粒度：粒度小，则分离效果较好（如用200~400目的硅胶能有效地分离多种主物的有效成分），但流速慢、时间长

活化：

110℃烘烤0.5~1h。活化后立即使用或短期贮存与干燥器中性质作用位点：含有很多硅醇基团(-Si-OH)的颗粒状极性吸27要想分离物质重复性好，每次所用的硅胶活性必须一致。活性测定习惯采用6种染料进行。

1．偶氮苯；2．对甲氧基偶氮苯；3．苏丹黄；

4．苏丹红；5．对氨基偶氮苯；6．对羟基偶氮苯。原理：在吸附柱上，因吸附剂对6种染料吸附的能力不同，所以它们经洗脱后的位置不同，借此即可测定吸附剂的活性级别。具体操作是：取上述6种染料各20mg溶于l0ml苯溶剂中，加50ml石油醚稀释，然后取20ml此溶液加到1.5cm×l0cm的硅胶柱上，再加20ml苯与石油醚(1：4)的混合液进行冲洗，洗毕根据各种染料的位置，找出硅胶的活性级别。要想分离物质重复性好，每次所用的硅胶活性必须一致。原理：在吸28活性级别IIIaIIbIIIaIIIbIVaIVbIVcVVI柱顶部23456柱中部23456柱底部12345流出液12345硅胶活性级别的标准化规格活性级别低的活性大，结合力强活性级别IIIaIIbIIIaIIIbIVaIVbIVcVV29

氧化铝可能带有碱性（因其中可混有碳酸钠等成分），对于分离一些碱性中草药成分，如生物碱类的分离颇为理想。但是碱性氧化铝不宜用于醛、酮、醋、内酯等类型的化合物分离。因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应，如异构化、氧化、消除反应等。（3）氧化铝

活性氧化铝

氧化铝空心球氧化铝可能带有碱性（因其中可混有碳酸钠等成分303、洗脱剂的选择能较完全地洗脱所要分离的成分，并力求用量少、洗脱时间短。纯度较高稳定性好能较完全地洗脱下被分离的成分黏度小易和所需的成分分开选择洗脱剂的顺序应从极性小大

一般，pro或核酸被极性强的HA吸附后，要用含有盐梯度的缓冲液洗脱；而甾体、色素等化合物被极性较弱的硅胶吸附后，则可用有机溶剂洗脱3、洗脱剂的选择能较完全地洗脱所要分离的成分，并力求用量少、314、层析操作（1）层析柱

绝多数层析柱是下端为细口并带有筛板的玻管。柱的直径与长度之比，一般为1：10～1：40。

采用极细颗粒吸附剂装柱时，宜用比例大的层析柱。反之，则宜用比例小的层析柱。这样有利于节省时间和提高分辨率。4、层析操作（1）层析柱绝多数层析柱是下端为细口并带32（2）吸附剂的用量根据其自身的操作容量和分离物中各成分的性质决定的。

当操作容量高时，吸附剂用量少。一般吸附剂的用量为被分离样品的30--50倍。

若样品中各成分的性质相似难以分开时，则吸附剂用量应增大，有时大于100倍。（2）吸附剂的用量根据其自身的操作容量和分离物中各成分的性质33（3）装柱

干法装柱直接加吸附剂至柱中，然后倒入溶剂此法不易排尽气泡，容易导致层析不均匀湿法装柱先加适量溶剂至柱内，排走空气，然后将预先浸泡好的吸附剂搅均，随即将此混悬液倾入柱中（图3-5）；待其自然沉淀至柱高的1/4~1/3时，打开下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱子上端悬浮液徐徐下降至需要的高度；并用2~3倍量的洗脱剂流过层析柱，使其达到平衡注：吸附剂表面要平整，应一直浸泡在溶剂液面以下，严防产生气泡。湿法装柱均匀，不易留有气泡（3）装柱干法装柱直接加吸附剂至柱中，然后倒入溶剂湿法装柱34（4）上样样品的溶解度好加入的样品量利于提高分辨率样品的浓度与粘度的考虑注意：加样时避免冲动基质（4）上样样品的溶解度好注意：加样时避免冲动基质35层析分离技术二吸附层析课件36

为了获得满意的分离结果，洗脱液的流速务必恰当控制。如果太快，洗脱物在两相中的平衡过程不完全；如果太慢，洗脱物会扩散。若峰与峰之间有重叠，宜降低洗脱剂的离子强度，若峰间距离过大，或某些成分不能洗脱时，宜加大洗脱剂的强度(极性)，成分复杂时，可采用洗脱剂由弱到强的梯度洗脱(方法属于离子交换层析)。（5）洗脱为了获得满意的分离结果，洗脱液的流速务必恰当37流速太慢，前峰拖尾与后峰相连流速太快，组分分不开正常的流速使组分完全分离流速太慢，前峰拖尾与后峰相连流速太快，组分分不开正常的流速使38（6）吸附剂的再生5-10倍1%氢氧化钠煮沸半小时后，趁热过滤，水洗三次，再用3-6倍的5%盐酸煮沸半小时，过滤，水洗至中性，凉干，120℃烘干12小时即可重新使用。硅胶的再生用0.4MpH6.8的PBS缓冲液洗柱至平衡即可重新使用。羟基磷灰石的再生（6）吸附剂的再生5-10倍1%氢氧化钠煮沸半小时后，趁热过39四、吸附层析工艺固定床吸附流化床吸附膨胀床吸附移动床吸附四、吸附层析工艺固定床吸附流化床吸附膨胀床吸附移动床吸附401、固定床吸附料液分析仪吸附塔液泵吸附柱内填充固相吸附介质，含目标产物的料液输入吸附柱，流经吸附剂后，溶质被吸附剂吸附。1、固定床吸附料液分析仪吸附塔液泵吸附柱内填充固相吸附介质，410.051.0时间穿透点c/c0穿透点：出口处溶质浓度开始上升的点。穿透时间：一般将出口浓度达到入口浓度5～10％的时间称为穿透时间。吸附过程中吸附柱出口溶质浓度的变化曲线称为穿透曲线。操作达到穿透点后，继续进料对增加吸附量的效果不大，而且出口溶质浓度迅速增大，造成目标产物的损失。应停止进料吸附操作，顺次转入杂质清洗、吸附溶质洗脱和吸附剂再生操作。0.051.0时间穿透点c/c0穿透点：出口处溶质浓度开始上421.0出口c/c0入口t=0t1t3t4t5t2柱内液相溶质浓度分布1.0时间c/c0t1t5t4t3t2穿透曲线吸附柱内轴向溶质浓度分布随时间的变化和对应的穿透曲线1.0出口c/c0入口t=0t1t3t4t5t2柱内液相溶质432、流化床吸附

当流体通过床层的速度逐渐提高到某值时，颗粒出现松动，颗粒间空隙增大，床层体积出现膨胀。如果再进一步提高流体速度，床层将不能维持固定状态。此时，颗粒全部悬浮与流体中，显示出相当不规则的运动。随着流速的提高，颗粒的运动愈加剧烈，床层的膨胀也随之增大，但是颗粒仍逗留在床层内而不被流体带出。床层的这种状态和液体相似成为流化床。流化床膨胀床固定床2、流化床吸附当流体通过床层的速度逐渐提高到443、膨胀床吸附

当流体通过床层的速度逐渐提高到某值时，颗粒出现松动，颗粒间空隙增大，床层体积出现膨胀。如果再进一步提高流体速度，床层将不能维持固定状态。此时，随着流速的增加，颗粒互相离开，并可看到少量的颗粒在一定的区间进行震动和游动，称为膨胀床。流化床膨胀床固定床3、膨胀床吸附当流体通过床层的速度逐渐提高到45固定床：在吸附颗粒确定以后，床层的膨胀与通过床层液体的表观流速U有关。当U不大时，颗粒之间仍保持静止并互相接触，这种床层称为固定床。

优缺点：固定床中流体在介质中基本上呈平推流，返混小，柱效率高；但无法处理含颗粒的料液，因为颗粒会堵塞床层，造成压力降增大而最终使操作无法进行，所以在固定床吸附前需先进行培养液的预处理和固液分离。固定床、流化床、膨胀床的对比固定床：在吸附颗粒确定以后，床层的膨胀与通过床层液体的表观流46流化床：当表观流速增大至最小流化速度，颗粒不再相互支撑，开始悬浮在液体中；进一步提高流速，床层随之膨胀，床层的压力降几乎不变，但床层中颗粒的运动加剧，这时的床层为流化床。优缺点：压降小，可直接吸附含颗粒的料液；但存在较严重的返混，吸附剂的利用率低，分离效率下降。固定床、流化床、膨胀床的对比流化床：当表观流速增大至最小流化速度，颗粒不再相互支撑，开始47膨胀床：是液固相返混程度较低的液固流化床，综合固定床和流化床吸附的优点，同时又克服了后两者的一些缺陷。膨胀床与流化床的最大区别：流化的固相介质基本可以悬浮在膨胀床内的固定位置，流体流动状态和固定床相近，以接近平推流的方式流经床层，所以液固两相的轴向混合程度都较低，从而使目标产物获得良好的吸附效率。固定床、流化床、膨胀床的对比膨胀床：是液固相返混程度较低的液固流化床，综合固定床和流化床48膨胀床与固定床的区别：膨胀床上的床层上部安装有可调节床层高度的调节器，当液体（料液或清洗液）从床底以高于吸附剂最小流化速率的流速输入时，吸附剂床层产生膨胀，高度调节器上升。由于床层空隙率高，可使菌体细胞或细胞碎片自由通过。可直接处理菌体发酵液或细胞匀浆液，回收其中的目标产物，从而可节省离心或过滤等预处理过程。固定床、流化床、膨胀床的对比膨胀床与固定床的区别：固定床、流化床、膨胀床的对比494、移动/模拟移动床吸附吸附操作中的固相可以连续输入和排出吸附塔，与料液形成逆流接触流动，则可实现连续稳态的吸附操作。移动床4、移动/模拟移动床吸附吸附操作中的固相可以连续输入和排出吸50层析分离技术二吸附层析课件51层析分离技术二吸附层析课件52模拟移动床由于固相吸附剂移动不便且易造成堵塞。可固定吸附剂，而移动切换液相（包括料液和洗脱液）的入口和出口位置，如同移动固相一样，产生与移动床相同的效果。模拟移动床由于固相吸附剂移动不便且易造成堵塞。可固定吸附剂，53层析分离技术二吸附层析课件54层析分离技术二吸附层析课件55层析分离技术二吸附层析课件56层析分离技术二吸附层析课件57可连续分离操作；可根据生物、药物活性成分的种类调试不同的分离方法（层析、离交、吸附等等）；制备效率高，提纯效果较一般工业制备色谱分离高出40%。运行成本低，使加工成本降50%，甚至80%。

模拟移动床的特点可连续分离操作；模拟移动床的特点58研究进展20世纪60年代发展起来的，主要用于石油化工产品的分离;1969年，美国UOP公司（环球石油公司）将SMB分离技术用于分离对二甲苯和间二甲苯;1993年，法国Seperex公司将SMB分离技术用于药物和精细化工领域;近些年，SMB分离技术研究主要集中在糖类分离、同分异构体分离、手性化合物分离等方面。研究进展20世纪60年代发展起来的，主要用于石油化工产品59研究进展国际上糖醇工业中多数采用了SMB分离技术。并利用SMB进行脱色、除蛋白、离子交换和脱盐等。

德国研究与应用居世界领先地位；

美国、法国、日本应用的也比较成熟；

国外已遍及石油化工、食品、精细化工、生物发酵和医药等领域应用。研究进展国际上糖醇工业中多数采用了SMB分离技术。德国60五、应用实例1、纯化生命物质

使用吸附剂的柱层析或分批吸附法可纯化生命物质。

如用羟基磷灰石吸附剂能把酸性、中性和碱性蛋白质分开，也能把不同结构的核酸分开。用该吸附剂分离含不同磷酸基团的蛋白质和脂类等化合物也是有效的。五、应用实例1、纯化生命物质61

混合样品：90μg胞质B型多角体病毒(CPV)双链RNA、2μg枯草杆菌(Bacillussubtilis)3H-双链DNA、2μg枯草杆菌14C-双链DNA上5mm直径的层析柱。用磷酸梯度缓冲液洗脱，其流量为30ml/h，以0.5ml／管进行收集。每管收集液经紫外分光光度仪和液闪仪的测定分析，根据得到的数据即可绘制出分离示意图。从图看出，双链RNA是在低磷酸盐缓冲液中先被洗出，而双链DNA则后被洗出。用HA层析柱分离胞质型多角体病毒双链RNA混合样品：90μg胞质B型多角体病毒(CP622、分离蛋白质的亚基

一般蛋白质经SDS(十二烷基硫酸钠)或TritonX-100(聚氧乙基十六烷基酚醚)等去污剂处理后，会产生分子质量不同的蛋白质亚基。这些物质可通过吸附柱层析方法得到分离。2、分离蛋白质的亚基633、浓缩溶液

有些稀的溶液经层析柱处理后，浓度可大幅度提高。例如，Tiselius把200ml稀的牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，BSA)溶液上HA层析柱，收集到的洗脱液仅有几毫升，其浓度提高数十倍。3、浓缩溶液64吸附(adsorption)：溶质从液相或气相转移到固相的现象。吸附操作：利用固体吸附的原理从液体或气体中除去有害成分或分离回收有用目标产物的过程。

应用：原料液脱色除臭，目标产物提取、浓缩和粗分离。吸附剂：吸附操作所使用的固体材料一般为多孔微粒或多孔膜，具有很大的比表面积，称为吸附剂或吸附介质。一、吸附概述吸附(adsorption)：溶质从液相或气相转移到固相的现65马王堆中有木炭，可能用于吸湿和防腐?...冰箱中除臭，活性炭。工业应用，产品分离、脱色。马王堆中有木炭，可能用于吸湿和防腐?...662005年11月13日下午，位于吉林省吉林市的中国石油天然气集团公司吉林石化分公司双苯厂的苯胺车间发生剧烈爆炸，泄漏进松花江的苯类污染物总量在100吨左右。

1400吨活性炭治理水污染

2005年11月13日下午，位于吉林省吉林市的中国石油天然气672012年1月广西龙江镉污染事件“目前使用聚合氯化铝将离子状态的镉固化，是目前治理龙江河镉污染最重要的措施之一，而烧碱则是将调节河水PH值促进聚合氯化铝发生反应的重要物质。”

吸附作用2012年1月广西龙江镉污染事件“目前使用聚合氯化铝将离子状68吸附的特点：（1）不用或少用有机溶剂（2）操作简便，安全（3）生产过程pH变化小（4）从稀溶液分离溶质（5）

吸附剂对溶质的作用小（6）

吸附平衡为非线性（7）选择性差吸附的特点：69

固体内部分子所受分子间的作用力是对称的，而固体表面分子所受力是不对称的。向内的一面受内部分子的作用力较大，而表面向外一面所受的作用力较小，因而当气体分子或溶液中溶质分子在运动过程中碰到固体表面时就会被吸引而停留在固体表面上。

界面上分子和内部分子所受的力二、吸附过程理论基础1、基本概念固体内部分子所受分子间的作用力是对称的，而固体表面分70固体表面分子(或原子)处于特殊的状态。固体内部分子所受的力是对称的，故彼此处于平衡。但在界面分子的力场是不饱和的，即存在一种固体的表面力，它能从外界吸附分子、原子、或离子，并在吸附表面上形成多分子层或单分子层。界面上分子和内部分子所受的力固体表面分子(或原子)处于特殊的状态。固体内部分子所受的力是71吸附作用：物质从流体相浓缩到固体表面吸附剂：表面上能发生吸附作用的固体吸附物：被吸附的物质多孔吸附剂：外表面与内表面组成非多孔吸附剂：比表面取决于外表面吸附作用：物质从流体相浓缩到固体表面72孔径和比表面积是评价吸附剂性能的重要参数一般来说，孔径越大，比表面积越小。比表面积直接影响溶质的吸附容量，而适当的孔径有利于溶质在空隙中的扩散，提高吸附容量和操作速度。孔径和比表面积是评价吸附剂性能的重要参数732、吸附的类型基于吸附剂与溶质之间的分子间力。溶质在吸附剂上吸附与否或吸附量的多少取决于溶质与吸附剂极性的相似性和溶剂的极性。可通过改变温度、pH值和盐浓度等物理条件脱附。物理吸附吸附剂表面活性点与溶质之间发生化学键合、产生电子转移现象，吸附稳定，不易脱附。采用破坏化学键合的化学试剂洗脱剂脱附。应用很少。化学吸附所用吸附剂称为离子交换剂，表面键合离子基团或可离子化基团，通过静电引力吸附带有相反电荷的离子，吸附过程发生电荷转移。一般通过提高离子强度或调节pH值的方法洗脱。离子交换2、吸附的类型基于吸附剂与溶质之间的分子间力。溶质在吸附剂上743、物理吸附力的本质定向力极性分子的永久偶极静电力诱导力极性分子与非极性分子之间的吸引力色散力非极性分子之间的引力（瞬间偶极）氢键力介于库仑引力与范德华引力之间的特殊分子间定向作用力非共价作用吸附质和吸附剂之间的作用力－范德华力3、物理吸附力的本质定向力极性分子的永久偶极静电力非共价75当分子间距离减小时，范德华力增大，但当分子间距离非常接近时，就明显地表现出斥力。当距离大于OB时，吸引力未表示出来。当吸附表面和分子间的距离减小时，其吸引力的能量逐渐增加，当距离减至分子半径OA时，达到最大值。当距离再减小时，推斥力急剧增加。当分子间距离减小时，范德华力增大，但当分子间距离非常接近时，764、吸附等温线吸附等温线：当溶质在液固两相间达到吸附平衡时，吸附剂上的平衡吸附质浓度q是液相游离溶质浓度c和温度T的函数。当温度一定时，q只和c有关，q=f(c)，q与c的关系曲线称为吸附等温线。生物分离中至少有四种等温吸附线(见图)。4、吸附等温线吸附等温线：当溶质在液固两相间达到吸附平衡时，771——Henry；2——Freundlich；3——Langmuir；4——矩形qc1234几种常见的吸附等温线qc1234几种常见的吸附等温线78（1）Henry型吸附平衡

在一定温度下，平衡时吸附剂吸附溶质浓度q*与液相溶质浓度c之间的关系为线性函数：

m为分配系数。

适应条件：在低浓度范围之内成立。当浓度较高时，吸附平衡常呈非线性，上式无效。（1）Henry型吸附平衡在一定温度下，平衡时79（2）Freundlich型吸附平衡

其经验公式为

其中，k和n为常数，n一般在1-10之间。

Freundlich等温线可描述大多数抗生素、类固醇、甾类激素等在溶液中的吸附过程。（2）Freundlich型吸附平衡其经验公式为80（3）Langmuir型吸附平衡Langmuir单分子层吸附理论：吸附剂表面有许多活性点，每个活性点具有相同的能量，只能吸附一个分子，并且被吸附的分子间无相互作用。A为表面活性中心。基于上述平衡，及假定单分子层吸附，得Langmuir型吸附平衡方程式中：qmax为吸附容量，kb为结合常数当n个分子在一个活性中心发生吸附时，即存在

此时有：（3）Langmuir型吸附平衡Langmuir单分子层吸81（4）矩形吸附平衡当吸附剂对溶质的吸附作用非常大时，存在n>10，或用前式表示Kb非常大，这时游离的溶质浓度对吸附浓度影响极小，接近不可逆吸附。吸附等温线为矩形（q＝常数）。如在固定化单克隆抗体的免疫亲和吸附中，一般存在n>10。（4）矩形吸附平衡当吸附剂对溶质的吸附作用非常大时，存在n82例：蔗渣木质素吸附重金属离子的吸附等温线Cd(II)Hg(II)Pb(II)例：蔗渣木质素吸附重金属离子的吸附等温线Cd(II)Hg(I83三、吸附层析1、基本原理在吸附层析法中，使用的固定相基质是颗粒状的吸附剂。在吸附剂的表面存在着许多随机分布的吸附位点吸附位点通过范德华力、静电引力与蛋白质和核酸等生物分子结合；其结合力的大小与各种生物分子的结构和吸附剂的性质有密切关系。三、吸附层析1、基本原理在吸附层析法中，使用的固定相基质是颗84在洗脱过程中，柱内不断地发生解吸、吸附，再解吸、再吸附的过程。经过一段时间以后，该物质会向下移动一定距离。此距离的长短与吸附剂对该物质的吸附力以及溶剂对该物质的解吸(溶解)能力有关。不同的物质由于吸附力和解吸力不同，移动速度也不同。在洗脱过程中，柱内不断地发生解吸、吸附，再解吸、再吸附的过程852、吸附剂的选择

具备条件：表面积大、吸附选择性好、稳定性强、颗粒均匀、成本低廉等

选择原则：由吸附剂本身和被吸附物质的理化性质而定。根据“相似相溶”原理，为了便于解吸附（洗脱），对于极性强的分离物，应选择极性小的吸附剂；而对于极性弱的分离物则选择极性强的吸附剂2、吸附剂的选择具备条件：表面积大、吸附选择性好、稳8620世纪50年代初期，Tiselius等用制备的羟基磷灰石[Ca5(P04)3OH]2（HA）分离蛋白质。目前国内已有商品出售

（1）羟基磷灰石

性质吸附容量高稳定性好（T＜85℃，pH5.5~10.0均可使用）使用广泛（可用于制备和纯化pro、酶、核酸等）分离效果好HA的Ca基团与生物分子表面的负电荷基团的作用，对分离起重要作用；而PO4基团与生物分子表面的正电荷的作用仅起次要作用20世纪50年代初期，Tiselius等用制备的87层析分离技术二吸附层析课件88使用HA作为固定相基质时应注意HA为干粉时，需事先浸泡膨胀达到2~3ml/g后，按1∶6加入缓冲液悬浮，除去细小的颗粒HA悬浮液需用旋涡振荡器混合，因为其他搅拌器如磁棒、玻棒等易破坏其晶体结构忌用柠檬酸缓冲液和pH＜5.5的缓冲液处理色谱柱再生时，先用1mol/LNaCl洗涤，然后用4倍床体积的平衡缓冲液冲洗即可细颗粒HA的操作容量和分辨率均较大颗粒高，但须采用较大直径的柱子使用HA作为固定相基质时应注意HA为干粉时，需事先浸泡膨胀达89

表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，当遇到较强的碱性化合物时，则可因离子交换反应而吸附碱性化合物。（2）硅胶

柱层析硅胶变色硅胶（也称蓝胶）是以具有高活性吸附材料细孔硅胶为基础原料经过深加工制成的细孔硅胶为无色或微黄色透明状玻璃体，它的基本质量参数如下：平均孔距2.0-3.0MM表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子，当遇到较90性质作用位点：含有很多硅醇基团(-Si-OH)的颗粒状极性吸附剂。它对氨基酸衍生物、甾体激素、皂甙类、类脂及色素等物质有结合力（吸附作用）。含水量：含水量高，则吸附性（活性）小，当其表面游离水含量＞17%时，其结合力很小；此时仅能作为分配层析的固定相粒度：粒度小，则分离效果较好（如用200~400目的硅胶能有效地分离多种主物的有效成分），但流速慢、时间长

活化：

110℃烘烤0.5~1h。活化后立即使用或短期贮存与干燥器中性质作用位点：含有很多硅醇基团(-Si-OH)的颗粒状极性吸91要想分离物质重复性好，每次所用的硅胶活性必须一致。活性测定习惯采用6种染料进行。

1．偶氮苯；2．对甲氧基偶氮苯；3．苏丹黄；

4．苏丹红；5．对氨基偶氮苯；6．对羟基偶氮苯。原理：在吸附柱上，因吸附剂对6种染料吸附的能力不同，所以它们经洗脱后的位置不同，借此即可测定吸附剂的活性级别。具体操作是：取上述6种染料各20mg溶于l0ml苯溶剂中，加50ml石油醚稀释，然后取20ml此溶液加到1.5cm×l0cm的硅胶柱上，再加20ml苯与石油醚(1：4)的混合液进行冲洗，洗毕根据各种染料的位置，找出硅胶的活性级别。要想分离物质重复性好，每次所用的硅胶活性必须一致。原理：在吸92活性级别IIIaIIbIIIaIIIbIVaIVbIVcVVI柱顶部23456柱中部23456柱底部12345流出液12345硅胶活性级别的标准化规格活性级别低的活性大，结合力强活性级别IIIaIIbIIIaIIIbIVaIVbIVcVV93

氧化铝可能带有碱性（因其中可混有碳酸钠等成分），对于分离一些碱性中草药成分，如生物碱类的分离颇为理想。但是碱性氧化铝不宜用于醛、酮、醋、内酯等类型的化合物分离。因为有时碱性氧化铝可与上述成分发生次级反应，如异构化、氧化、消除反应等。（3）氧化铝

活性氧化铝

氧化铝空心球氧化铝可能带有碱性（因其中可混有碳酸钠等成分943、洗脱剂的选择能较完全地洗脱所要分离的成分，并力求用量少、洗脱时间短。纯度较高稳定性好能较完全地洗脱下被分离的成分黏度小易和所需的成分分开选择洗脱剂的顺序应从极性小大

一般，pro或核酸被极性强的HA吸附后，要用含有盐梯度的缓冲液洗脱；而甾体、色素等化合物被极性较弱的硅胶吸附后，则可用有机溶剂洗脱3、洗脱剂的选择能较完全地洗脱所要分离的成分，并力求用量少、954、层析操作（1）层析柱

绝多数层析柱是下端为细口并带有筛板的玻管。柱的直径与长度之比，一般为1：10～1：40。

采用极细颗粒吸附剂装柱时，宜用比例大的层析柱。反之，则宜用比例小的层析柱。这样有利于节省时间和提高分辨率。4、层析操作（1）层析柱绝多数层析柱是下端为细口并带96（2）吸附剂的用量根据其自身的操作容量和分离物中各成分的性质决定的。

当操作容量高时，吸附剂用量少。一般吸附剂的用量为被分离样品的30--50倍。

若样品中各成分的性质相似难以分开时，则吸附剂用量应增大，有时大于100倍。（2）吸附剂的用量根据其自身的操作容量和分离物中各成分的性质97（3）装柱

干法装柱直接加吸附剂至柱中，然后倒入溶剂此法不易排尽气泡，容易导致层析不均匀湿法装柱先加适量溶剂至柱内，排走空气，然后将预先浸泡好的吸附剂搅均，随即将此混悬液倾入柱中（图3-5）；待其自然沉淀至柱高的1/4~1/3时，打开下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱子上端悬浮液徐徐下降至需要的高度；并用2~3倍量的洗脱剂流过层析柱，使其达到平衡注：吸附剂表面要平整，应一直浸泡在溶剂液面以下，严防产生气泡。湿法装柱均匀，不易留有气泡（3）装柱干法装柱直接加吸附剂至柱中，然后倒入溶剂湿法装柱98（4）上样样品的溶解度好加入的样品量利于提高分辨率样品的浓度与粘度的考虑注意：加样时避免冲动基质（4）上样样品的溶解度好注意：加样时避免冲动基质99层析分离技术二吸附层析课件100

为了获得满意的分离结果，洗脱液的流速务必恰当控制。如果太快，洗脱物在两相中的平衡过程不完全；如果太慢，洗脱物会扩散。若峰与峰之间有重叠，宜降低洗脱剂的离子强度，若峰间距离过大，或某些成分不能洗脱时，宜加大洗脱剂的强度(极性)，成分复杂时，可采用洗脱剂由弱到强的梯度洗脱(方法属于离子交换层析)。（5）洗脱为了获得满意的分离结果，洗脱液的流速务必恰当101流速太慢，前峰拖尾与后峰相连流速太快，组分分不开正常的流速使组分完全分离流速太慢，前峰拖尾与后峰相连流速太快，组分分不开正常的流速使102（6）吸附剂的再生5-10倍1%氢氧化钠煮沸半小时后，趁热过滤，水洗三次，再用3-6倍的5%盐酸煮沸半小时，过滤，水洗至中性，凉干，120℃烘干12小时即可重新使用。硅胶的再生用0.4MpH6.8的PBS缓冲液洗柱至平衡即可重新使用。羟基磷灰石的再生（6）吸附剂的再生5-10倍1%氢氧化钠煮沸半小时后，趁热过103四、吸附层析工艺固定床吸附流化床吸附膨胀床吸附移动床吸附四、吸附层析工艺固定床吸附流化床吸附膨胀床吸附移动床吸附1041、固定床吸附料液分析仪吸附塔液泵吸附柱内填充固相吸附介质，含目标产物的料液输入吸附柱，流经吸附剂后，溶质被吸附剂吸附。1、固定床吸附料液分析仪吸附塔液泵吸附柱内填充固相吸附介质，1050.051.0时间穿透点c/c0穿透点：出口处溶质浓度开始上升的点。穿透时间：一般将出口浓度达到入口浓度5～10％的时间称为穿透时间。吸附过程中吸附柱出口溶质浓度的变化曲线称为穿透曲线。操作达到穿透点后，继续进料对增加吸附量的效果不大，而且出口溶质浓度迅速增大，造成目标产物的损失。应停止进料吸附操作，顺次转入杂质清洗、吸附溶质洗脱和吸附剂再生操作。0.051.0时间穿透点c/c0穿透点：出口处溶质浓度开始上1061.0出口c/c0入口t=0t1t3t4t5t2柱内液相溶质浓度分布1.0时间c/c0t1t5t4t3t2穿透曲线吸附柱内轴向溶质浓度分布随时间的变化和对应的穿透曲线1.0出口c/c0入口t=0t1t3t4t5t2柱内液相溶质1072、流化床吸附

当流体通过床层的速度逐渐提高到某值时，颗粒出现松动，颗粒间空隙增大，床层体积出现膨胀。如果再进一步提高流体速度，床层将不能维持固定状态。此时，颗粒全部悬浮与流体中，显示出相当不规则的运动。随着流速的提高，颗粒的运动愈加剧烈，床层的膨胀也随之增大，但是颗粒仍逗留在床层内而不被流体带出。床层的这种状态和液体相似成为流化床。流化床膨胀床固定床2、流化床吸附当流体通过床层的速度逐渐提高到1083、膨胀床吸附

当流体通过床层的速度逐渐提高到某值时，颗粒出现松动，颗粒间空隙增大，床层体积出现膨胀。如果再进一步提高流体速度，床层将不能维持固定状态。此时，随着流速的增加，颗粒互相离开，并可看到少量的颗粒在一定的区间进行震动和游动，称为膨胀床。流化床膨胀床固定床3、膨胀床吸附当流体通过床层的速度逐渐提高到109固定床：在吸附颗粒确定以后，床层的膨胀与通过床层液体的表观流速U有关。当U不大时，颗粒之间仍保持静止并互相接触，这种床层称为固定床。

优缺点：固定床中流体在介质中基本上呈平推流，返混小，柱效率高；但无法处理含颗粒的料液，因为颗粒会堵塞床层，造成压力降增大而最终使操作无法进行，所以在固定床吸附前需先进行培养液的预处理和固液分离。固定床、流化床、膨胀床的对比固定床：在吸附颗粒确定以后，床层的膨胀与通过床层液体的表观流110流化床：当表观流速增大至最小流化速度，颗粒不再相互支撑，开始悬浮在液体中；进一步提高流速，床层随之膨胀，床层的压力降几乎不变，但床层中颗粒的运动加剧，这时的床层为流化床。优缺点：压降小，可直接吸附含颗粒的料液；但存在较严重的返混，吸附剂的利用率低，分离效率下降。固定床、流化床、膨胀床的对比流化床：当表观流速增大至最小流化速度，颗粒不再相互支撑，开始111膨胀床：是液固相返混程度较低的液固流化床，综合固定床和流化床吸附的优点，同时又克服了