莪术、黄芪诱导肝癌细胞凋亡机制研究

【】目的：证实中药莪术、黄芪对热休克肝癌细胞细胞株N1S1的促凋亡作用，并初步探讨其相关机制。方法：1.N1S12.分别用不同浓度的莪术、黄芪处理细胞，用Annecxin-V和PI双染流式细胞分析测定凋亡细胞数；3、用用western-blot方法检测BCL-2和HSP70表达变化。结果：莪术、黄芪能明显促进热休克处理N1S1细胞的凋亡，明显减少细胞内BCL-2及HSP70的表达。【】莪术黄芪热休克模型N1S1细胞 凋HS70是分子量约7kD的热休克蛋，是热休蛋白中组重的一员，被、、、、7kDa等的0多种蛋白。分子量7KD的热休克蛋白（）研究中最多一种。尤其是对S70的结构、功以及表达调控机理的研究较多，正常情况下HS70HS70迅速增加，浆内量存在细胞处于恢阶时，核内的HS70，浆仍有低水平HS70表达。目前，S70被认为是哺乳动物细胞HSs的HSs，这与它所有的生物学性密切相关：生界的普遍性从核生物到真核生物都有HS70HS70%-%HS70氨基酸序列的N端2/3部分较C端1/3部分还要保守得多。正常情况下HS70S70的合成速度显正常情况下HS70位于胞内，当细胞激作用时，S70迅速移入细胞核并包围核仁细胞浆内存在；而应激消后细胞处于复阶段时，细胞核内HS706S70成员在细胞的分布不，但均具有与核酸特别是与AP或ATP总蛋白量的%-1%。向外周逐渐衰减，至42-60℃的过度区内，残存的肿瘤细胞启动凋亡，但随着过渡区前预防RFA术后肿瘤复发的重要课题。N1S1肝癌细胞的热休克模型来观察莪术黄芪超滤膜提取物的诱导肝脏肿瘤细胞凋亡效应，进一步检测莪术黄芪诱导肿瘤细胞凋亡过程中HSP70的变化，探讨肝癌热休克模主要试剂与仪器RPMI1640培养基（Gibco公司），胎牛（Gibco公司），5%CO2恒温密闭式孵箱，流式细胞仪，电泳仪（HV3000型），紫外线透射反射分析仪（ZF3型），流式双染试剂盒，．抗人HSP70的多克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的抗IgG抗体均购自Abcam公司细胞株肝癌细胞株N1S1，常规培养于含有10%胎牛的RPMI1640培养基中,置于37℃、5%CO2恒温密闭式孵箱内培养和传代。莪术黄芪超滤膜提取物的莪术，黄芪以1:1比例混合，按正交试验结果，81h81h，4层纱布过滤滤液，再用脱脂棉过滤，两次药液混合，将滤液倒入平板超滤机，进行膜分离处理（PNA中空纤维超滤膜，压力5-6kg25℃，流量100ml/h）将超滤膜滤液取回后喷雾干燥，浓缩，制成每克生成药相当于0.159g的提取物干燥药粉，封装保存。肝癌热休克模型将肝癌肝癌细胞株N1S1稳定传代，细胞培养瓶内细胞贴45℃5%CO210min，直接实验分组分为药物干预组（0.2、0.4、0.81.6g/L组)和对照组以及空白对照组。其中药物干预组每组8个复孔，在热休克程序后，全湿条件下，37℃、5%CO2培养箱中培养24h，48h，72h，96h，对照72小时，空白对照组为无干预同条件培养下稳定传流式细胞仪测定细胞凋亡采用FITC-annexin-inV/PI双染法,分别收集各组细胞10mL10000/ml,80005min后弃去培养1次,80005minPI标记溶液重悬细胞室温下避光孵育15min,12000离心5min沉淀细胞,孵育缓冲液洗1次。加入AnnexinV-FITCPI5uL,420min400uLPBS用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。每个样品检测1万个细胞,用cellquest软件分析细胞凋亡情况。western-blot检测细胞中HSP70的表达：Westernblot检测HSP70蛋白表达：换用含药物的RPMI164072h后，终止培养，弃培养液，用预冷的PBS100“L含PMSF的裂解液，于冰上裂解．超声(150．200W)3S，10次．离心，分装倒0．5mL的离心管中．用BCA法将细胞的蛋白样品定量，并100℃，5rain100mL／L40mL／L的浓缩胶，按每孔60ug蛋白上样．电泳时电压调至最大，电流强度浓缩胶30mA，分离胶40mA(恒流)．用100V电压转膜60．90min．转膜完毕后用封闭液封闭1．5h．再用TBST液洗3次，每次10min．加入HSP70的一抗。4℃冰箱过夜．一抗浓度：均为l：500．用含50g／L脱脂牛奶的TBST稀释．一抗孵育成功后用TBST液洗3次，每次10min．加入二抗室温下孵育1h．二抗浓度为1：2000，用含50g／L脱脂牛奶的TBST稀释．最后再用TBST液洗3次，每次10min．每张膜加l：l的发光液1mL，在暗室中5．7min，等条带清晰后将胶片取出，扫描后用TanonGis3500软件半莪术黄芪超滤膜提取物增加热休克状态肝癌细胞株H1S1(1～3)不同浓度莪术黄芪超滤膜提取物对人肝癌细胞株H1S1有诱导凋亡作用，这种作用呈时间剂量依赖性。24h以上各实验组抑制率均高于对照组，与对照组比较差异有统计学意莪术黄芪超滤膜提取物减少热休克状态肝癌细胞株H1S1热休克蛋白70（HSP70） 不同浓度的莪术黄芪超滤膜提取物均能减少热休克状态肝癌细胞株H1S1热休克蛋白70的表达，在72小时内，莪术黄芪超滤膜提取物对HSP70的抑制作用呈时间剂量依赖性，其中1.6g/L组HSP70蛋白表达量最低，与各组有统计学差异，P小于0.03，96小时后0.8g/L组及1.6g/L组与72小时组无统计学差异，0.2g/L组及0.4g/L组在时间梯度上随着药物作用时间增加，HSP70表达量逐渐增加，但均低于72小时血药经典药对黄芪一莪术，观察其配伍使用对人肝癌细胞H1S1热点。中药与传统化疗药物比较，有副作用小、毒性低、骨髓抑制轻、成本优点。胞H1S1内热休克蛋白HSP70仪分析显示，提取物与细胞作用24h即可诱导典型的凋亡细胞出现；72h后，提取物浓度在1.6g/L时达到饱和，进一步证实了莪术黄芪超滤膜提取物可诱导人肝癌细胞株H1S1凋亡。总之，通过流式细胞仪法观察莪术黄芪超滤膜提取物增加热休克人肝癌细胞株H1S1的凋亡率，通过蛋白电泳发现热休克后的人肝癌H1S1细胞中HSP70H1S1中HSP70的通过抑制细胞内HSP70的表达，增加细胞对热的敏感性，从而增加细胞的凋亡，本研对人肝癌细胞H1S1的凋亡通路需进一步研究。[1],胡明月,,等.细胞凋亡与肿瘤[J].中华医学实杂志20032(783-汪朝阳,,,等.中医中药对细胞凋亡的影响研究进展[J].中国中西医结合杂志,2000,20(9):712-714.LiuQH,LiuSY,QiH,etal.PreliminarystudyonthemechanismofapoptosisinEhrlichascitestumorcellsbysonochemicalactivatedhematoporphyrin[J].ActaZoolSinica,2005,51(6):1073-1079.TanC,DlugoszPJ,PengJ,etal.Auto-activationofapoptosisproteinBaxincreasesmitochondrialmembranepermeabilityandisinhibitedbyBcl-2[J].JBiolChem,2006,281(21):14764-14775.Liu