实验准备与无菌操作规范

【实验目的】掌握细胞培育的基本观点认识细胞培育的基本条件掌握冲洗和消毒的基本方法学习细胞培育使用液的配制及准备方法【实验原理】1.体外培育（invitroculture)的基本观点将活体构造成分（甚至个体）从体内或其寄生体内拿出，放在近似于体内生计环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。依据体外培育的构造成分，可将体外培育人为地分为：组织培育（tissueculture）、器官培育（organculture）、细胞培育（cellculture)1）器官培育（OrganCulture）培育的是器官的原基、器官的一部分或整个器官，使之在体外生计、生长和保持必定功能的方法。2）组织培育(TissueCulture)是指从生物体内拿出活的组织（多指组织块）在模拟体内生理环境下，使之生计和生长并保持其构造和功能的方法。3）细胞培育(CellCulture)是指将活细胞（特别是分别的细胞）在体外进行培育的方法。组织细胞培育的长处可以长时间察看细胞的生命活动简单控制实验条件，有益于生物学研究简单直接收集细胞及亚细胞构造的图象便于各样细胞染色办理和标志培育细胞的单调性，有益于清除扰乱要素体外培育技术的应用：基础研究：细胞生物学以致整个生命科学研究中最基本的实验技术之一。被培育的组织或细胞是优秀的实验资料。细胞培育宽泛应用于现代医学和生物科学研究之中生产实践：疫苗生产、药物研制与肿瘤防治等医学实践供给了崭新的手段组织细胞培育的基本条件（1）无污染的环境条件（2）合适的温度:由酶和蛋白质所需要的最适温度决定35－37℃(人和哺乳动物细胞)3）气体环境与pH环境：(人和哺乳动物细胞)4）营养条件5）其余条件：等渗条件、附着底物无污染的环境条件凡混入细胞培育环境中对细胞生计有害的成分和造成细胞不纯的异物都应视为污染。（1）污染的种类A．物

理污染:温度:解决对策：孵箱放在温度较恒定的房间中,培育液从冰箱拿出后在室温搁置放射线与辐射:解决对策：试剂四周不可以放同位素,尽量不放在带有玻璃门的冰箱中.振动:解决对策：孵箱四周不可以放惹起振动的设施.其余：灰尘、玻璃残渣等.解决对策：严格冲洗.B.化学污染水:解决对策：用双蒸和三蒸水配液和冲洗容器（此刻用纯水仪millipore超纯水）容器:生产过程中有毒物质残留（铅、砷）;消毒剂和冲洗剂的残留;铝箔和包裹纸残留解决对策：培育用各样器皿的严格冲洗（泡酸）培育箱:co2混有有毒气体;消毒剂和冲洗剂的残留解决对策：购买高质量的CO2C.生物污染

.细菌、霉菌和酵母:易被发现,易造成隐性污染病毒:最难发现和除去,严格的宿主性,自限性支原体：污染严重,难发现,难除去原虫、昆虫：其余细胞系：解决对策：实验用品严格灭菌，无菌操作同一时间只传同一种细胞,每种细胞要有独自的液体成立细胞库，每三个月改换一次细胞冲洗与灭菌除掉各样玻璃或塑料器皿上对细胞生长有影响的各样杂质以及除去附着在其上的各样微生物及化学物质，改良玻璃表面性质，有益于细胞的粘着和生长。冲洗和消毒能否完全直接关系到体外培育的成败。（1）冲洗玻璃器皿：培育瓶、吸管、滴管、试管等浸泡在清水中，洗刷→烘干→浸酸→冲刷（15遍自来水后3遍蒸馏水→倒置烤干→包装→干热消毒胶塞（旧）：用加入适当清洗灵的水溶液煮沸30分钟，自来水冲刷→蒸馏水漂洗3次→晾干→包装→湿热灭菌→烘干备用胶塞（新）：水中浸泡→2%NaOH煮10-20min→自来水冲刷10次→1%HCl浸泡30min→自来水冲10次，蒸馏水洗3次→晾干→包装→湿热灭菌→烘干备用。金属器材：自来水洗→75%酒精擦→湿热灭菌、包装→烘干备用或许自来水冲10次，蒸馏水3次→晾干→包装→湿热灭菌→烘干备用（2）细胞及组织培育用品的包装1．局部包装：滤器，培育瓶口全包装：胶塞、瓶盖、金属器材、注射器、小的瓶皿等（3）细胞及组织培育用品的消毒与灭菌射线消毒:用钴60等发出的射线消毒灭菌。适合用于量大或不适做高压、干热或过滤办理的培育用品，如塑料制品等。紫外线消毒:DNA损害，臭氧，双氧水。合用于空气、主要用于培育室空气、操作台、塑料、培育皿和培育板等表面消毒.【注意事项】：空气消毒时灯管应距地面m之内；台面的消毒应在80cm之内；培育器皿的消毒在30cm之内。不要让紫外线照耀人的皮肤。干热灭菌:高温变性，160℃保温90－120min合用于玻璃器皿【注意事项】温度降至100℃之下才能开烤箱门。湿热灭菌:高温变性。121度，15磅30分或115度，10磅20分。合用于胶塞、瓶盖、玻璃器皿、滤器、枪头塑料物件、PBS、LB等不易产生积淀的液体过滤除菌：合用于培育基、胰酶、TdR、秋水仙素、谷氨酰胺、抗生素等对热不稳固的试剂及药物化学消毒:来苏%)、新洁尔灭（%）、乙醇（70-75%）、乳酸、过氧乙酸%)火焰消毒：仅限于无菌操作过程，在火焰近处并经过炙烤进行。用于培育瓶、滴管、试管、吸管等。注意：等用品冷却后放可接触活的组织和细胞。抗生素的抑菌作用：青霉素、链霉素各100单位/mL培育基均衡盐D–Hanks缓冲液的配制均衡盐溶液（balancedsaltsolution,BSS）主假如由无机盐、葡萄糖构成。它的作用是保持细胞浸透压均衡，保持pH稳固及供给简单的营养。主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其余试剂等。D-Hank‘s与Hank’s的一个主要差别是前者不含有Ca2+、Mg2+，所以D-Hank‘s常用于配制胰酶溶液。D–Hanks的配制配方（

1000mL）：KCl

；KH2PO4g；NaCL8g

；

g；NaHCO3g；酚红（2%，1mL）————可不加【实验仪器、资料、试剂及用品】1.细胞培育用品：玻璃器皿；滤器；塑料及橡胶制品

;滤膜；棉花；酒精灯等2.药品及试剂：

KCl;KH2PO4;NaCl;Na2HPO4;NaHCO3

酒精;新洁尔灭【实验步骤】无菌室及互动显微镜室、仪器的使用规则针头滤器的安装与灭菌：安装滤膜（μm圆滑面向上），高压灭菌。–Hanks缓冲液的配制及灭菌办理。练习冲洗培育瓶。练习包瓶子、塞子、插枪头、切盖玻片，移液管塞棉花等。%酒精配置、酒精棉球制作以及酒精灯内酒精增添。配新洁尔灭消毒水。练习培育基瓶盖的开启与盖上。9.无菌室的打扫：自来水拖地、擦桌子及超净台，而后%新洁尔灭擦。CO2培育箱灭菌：新洁尔灭擦，而后75%乙醇擦。【思虑题】干燥箱灭菌的温度是多少？灭菌结束后要注意什么？答：干热灭菌

:

高温变性，

160℃保温

90－120min

合用于玻璃器皿【注意事项】温度降至

100℃之下才能开烤箱门。湿热灭菌

:高温变性。

121度，15

磅

30分或

115度，10磅

20分。合用于胶塞、瓶盖、玻璃器皿、滤器、枪头

塑料物件、

PBS、LB等不易产生积淀的液体二氧化碳培育箱的使用注意事项是什么？培育箱:co2混有有毒气体;消毒剂和冲洗剂的残留解决对策：购买高质量的CO2哪些物件合适于高压灭菌？合用于一般培育基、生理盐水、手术器材、玻璃容器及注