蛋白质一级结构的测定及其进展

关于蛋白质一级结构的测定及其进展第1页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六蛋白质一级结构的概述:研究蛋白质结构与功能的关系是目前分子生物学的中心课题之一.1953年英国人F.Sanger首先第一个完成牛胰岛素的测定工作.同时此人还是第一个搞清ф×175phageDNA的一级结构的学者,为此两次获得诺贝尔奖.第2页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六1969年,基本与应用化学国际联合会规定以各种氨基酸按一定的顺序排列构成的蛋白质肽链骨架为蛋白质的基本结构.1.多肽链的数目;2.每一条多肽链末端氨基酸的种类;3.每一条多肽链氨基酸中氨基酸的数目、种类和排列顺序;4.链内二硫键的位置和数目

5.链间二硫键的位置和数目第3页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六蛋白质一级结构与生物功能蛋白质高级结构研究需要一级结构的知识;

蛋白质的一级结构决定蛋白质的高级结构如:牛胰核糖核酸酶的复性实验基因工程中包涵体的问题蛋白质一级结构与分子进化的关系;

细胞色素C是广泛存在于需氧生物线粒体呼吸链中的起传替作用的一种蛋白质通过它可以绘出生物进化树,一般在进化树位置相距越远,则氨基酸的顺序差别越大.一级结构与遗传病(分子病);

镰刀状细胞贫血症中的血红蛋白(HbS),他仅是β-链上第六号的Glu变为Val，从而导致生物功能上的巨大差异第4页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六多肽激素功能以及作用；酶原激活与激素原的激活；酶原与激素原均是酶和激素的前体，均无生物活性，但经过特殊处理如激酶作用，肽段切除，氨基酸的置换等则可使其具有生物活性。蛋白质工程研究发展；利用一级结构决定高级结构的知识在蛋白质工程中广泛应用第5页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六测定蛋白质一级结构的重要意义用来研究其结构与功能的关系;可用于分子克隆中寡核苷酸的制备为cDNA推导的氨基酸序列提供证据为重组DNA技术产生的蛋白质作指纹分析蛋白质的完整结构鉴定确定翻译后修饰的位点决定簇的定位二硫键的确定第6页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六蛋白质一级结构测定的进展1953年的Sanger测定胰岛素全部氨基酸序列蛋白质测序的基本思路与测定氨基酸序列的化学法与酶法1967年推出基于Edman机理的液相（旋转杯）自动蛋白质测序仪1970华裔科学家张瑞耀采用DABITC试剂（4-N，N-二甲基氨基偶氮苯-4`-异硫氰酸酯）与PITC偶联提高灵敏度1970年代推出固相序列分析仪，弥补液相序列分析仪不适合分析小肽（＜30个残基的肽）不足1980年代Hewwick推出气相序列分析仪1980年代通过测定DNA顺序推出蛋白质序列1980年代质谱技术在蛋白质序列测定中应用第7页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六目前蛋白质的一级结构通过经典测定方法已经搞清近几百种目前蛋白质的一级结构测定可上千个氨基酸,如牛皮胶元(1052)、RNApolymerase(1407)蛋白质序列数据库大多来源于DNA推导序列第8页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六蛋白质一级结构测定的战略从DNA开始推蛋白质的氨基酸顺序从蛋白质开始进行蛋白质序列分析质谱法测定蛋白质一级结构第9页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六从DNA推测蛋白质的氨基酸顺序第10页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六目的蛋白的N、C末端均已知目的蛋白的N末端已知目的蛋白的N、C末端均不知第11页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六从蛋白质开始进行氨基酸的序列分析序列分析的关键：

1蛋白样品的纯度；

2氨基酸组成与分子量关系；

3重叠(序列的重建)也有一些特例：组蛋白和一些同功酶第12页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六蛋白质序列分析的一般步骤第13页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六蛋白质一级结构测定的关键步骤二硫键的拆除与大片肽段的分离;末端分析;多肽的一次性降解;肽段氨基酸的序列测定;二硫键位置的确定;第14页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六二硫键的拆除与大片肽段的分离

1直接拆除并固定-SH(过甲酸氧化)2拆除后再固定(利用还原剂还原)

3大片段的分离第15页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六

1直接拆除并固定-SH(过甲酸氧化)

两个-SH全部能转变为磺酸基(被氧化的Cys称为磺基Ala)过甲酸是强氧化剂,MetTrp也可能被氧化低温,过甲酸的浓度,一般不超过10%反应不可逆第16页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六2拆除后再固定(利用还原剂还原)1)β-巯基乙醇还原:

还原剂处理前需用变性剂处理蛋白反应可逆

β-巯基乙醇浓度必需在第17页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六2)Cleland试剂的还原:Cleland试剂指的是二硫赤苏糖醇,二硫苏糖醇。还原能力上是较强的试剂,只要0.01M就使-S-S-还原,在许多球蛋白反应中可以不用变性剂.

第18页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六3)-SH的固定烷基试剂使-SH转变成稳定的硫醚衍生物氨乙基化乙睛化第19页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六3大片段的分离蛋白质多肽链拆开后,可以通过凝胶柱分离如果蛋白质分子的几条肽链以非共价键结合,则可用尿素盐酸胍变性剂进行拆分.第20页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六蛋白质或多肽末端分析

N端分析C端分析第21页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六N端分析:丹磺酰氯法(dansyl-cl);灵敏度高,一般氨基酸都是可以的.但对H、R、W、C不完全成功;D、N、E、Q不能分,生成强荧光磺酰胺衍生物;PITC(苯异硫氰酸酯)法;基本上是成功的,但对S、T收率偏低.首先Edman用于鉴定多肽或蛋白质的N端;Dabitc;4-二甲基氨基偶氨苯异硫氰酸酯;氨肽酶;亮氨酸氨肽酶;FDNB;2.4-二硝基氟苯(FDNB)生成DNP-氨基酸.首先Sanger用来测定多肽或蛋白质的N端氨基酸;氰酸盐第22页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六三种氨基酸末端分析方法的对比试剂反应产物备注名称结构式氟-2,4-二硝基苯肽的黄色二硝基苯的衍生物从肽链上水解新生成的N-末端产物,破坏其它肽键丹磺酰氯强荧光磺酰胺衍生物异硫氰酸苯苯硫氰甲酰基衍生物本法避免上述二法缺陷第23页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六

封闭N端的测定:如果蛋白质或多肽的N端是封闭的,则不能和上述反应,如蛋白乙酰化(兔肌红蛋白)、蛋白甲酰化(蜂毒素)、焦谷氯酰环化(兔免疫球蛋白)、丙酰氯环化以及环肽(短杆菌酪肽A)1N端甲酰化或乙酰化可以用温和酸水解或相应的脱酰基酶;2焦谷氯酰残基可通过酶解法和化学降解法来裂解;第24页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六C端分析:

目前N-端氨基酸序列测定应用Edman化学降解法已经达到高度自动化,微量化,可以分析蛋白质N端20-40或更多的氨基酸残基,但是不少蛋白质尤其是哺乳动物及高等植物中N端被修饰封闭,且封闭方式不尽相同,因此给蛋白质N端测定带来困难.因此人们希望从C端获得一些信息,C端序列研究对研究多肽加工,DNA重组产物质量监控都很重要,同时cDNA起始于C端,因此了解C端氨基酸残基序列更有助于DNA克隆并得到正确的基因结构.另外许多报道指出C端和生物活性有重要关系.第25页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六

虽然C端研究很重要，但C端研究仍处于研究和发展阶段,虽有自动分析仪，但多是由N端分析仪改装而来,其基本结构相同。两者不同之处在于:1反应所用的试剂不同;2C端序列仪中所有化学反应均应在弹筒型反应室中进行不需再转化腔中转化。第26页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六C端分析比较困难，常用的有酶法和化学法:1化学法主要是肼解法:

肽与肼在无水条件下加热，可以断裂所有的肽键，除C末端氨基酸外，其他氨基酸都转变为相应的酰肼化合物。肼解下来的C末端氨基酸可用纸层析鉴定。精氨酸会变成鸟氨酸，半胱氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺被破坏。注意:1肼解绝对避免水分子的存在;2对于羧基末端氨基酸侧链是带有酰胺的Q、N,则肼解不能产生游离的羧基末端的氨基酸;3对Cys会发生分解需先氧化或烷化第27页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六

羧肽酶法：现在通常用酶法,但是酶法需先进行酶的动力学实验以及选择合适酶的浓度及反应时间使释放出的氨基酸主要是C端氨基酸.

将蛋白质在pH8.0,30℃与羧肽酶一起保温，按一定时间间隔取样，用纸层析测定释放出来的氨基酸，根据氨基酸的量与时间的关系，就可以知道C末端氨基酸的排列顺序。羧肽酶A水解除精氨酸、赖氨酸和脯氨酸外所有肽键，羧肽酶B水解精氨酸和赖氨酸。第28页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六多肽的专一性降解（specificcleavageoftheprotein）

大于20的多肽一般需要预先进行降解，尽管目前的测序可以一次测定60-70氨基酸残基，但由于氨基酸组成、纯度、产率等因素的影响这种几率比较少。多肽的降解不外于化学法和酶法俩种。化学法（大片段）

A:Cyanogenbromide(CNBr)它选择性的切断Met残基的羧基侧肽链，将Met转化为高丝氨酸（Homoser)和高丝氨酸内酯(Homoserinelactone)。在氨基酸组成分析时高丝氨酸和高丝氨酸内酯相距甚远。高丝氨酸在丝氨酸之后，而高丝氨酸内酯在组氨酸之后。计算时可将高丝氨酸和高丝氨酸内酯相加，计算甲硫氨酸的量。第29页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六CNBr切割优点：一般蛋白质中甲硫氨酸含量较少，可得大的片段；专一性强，只作用于甲硫氨酸；产率在80%以上；作用条件温和操作方便。注意：CNBr要新鲜，易氧化产生副产物。一般变黄后就不能用；CNBr有毒；注意在氨基酸分析同片段大小不符合时一定要注意，是否有Met漏掉；CNBr/Met=500：1可克服干扰提高产率；如蛋白质中含Asp-Pro链，会出现所得肽段数目比根据Met量预计的数目多的现象；第30页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六其他裂解肽的方法：A：部分酶分解法：0.1NHCl在110度或6NHCl在37度水解，但特异性不强，因此对大片段和肽均不适用；B：羟胺法：反应机理是通过羟胺作用，先形成一个琥珀酰亚胺环状物然后导致肽键的裂解。羟胺专一性的裂解Asn-Gly的肽链，产率可达70%以上。但酸性条件下切割Asn-Pro；C：稀酸切割Asp-Pro肽键：蛋白质中Asp-Pro键对酸不稳定；D：CleavageatTrpresidesbyo-iodosobenzoineacid(亚碘酰基苯甲酸）产率：70%-100%

第31页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六酶法（小片段）：酶水解法较化学法具有较多的优越性，使用也较广泛，因其具有较高的专一性，而且水解产率较高，利用不同的酶可以获得不同的肽的片段，加以比较就可获得整个肽的顺序。胰蛋白酶（Trypsin）最专一，一般肽链切割首选胰蛋白酶，但对Lys-Pro或Arg-Pro不切或较慢。胰蛋白酶是从胰脏中提取的蛋白水解酶，常含有胰凝乳蛋白酶，因此在测序时用 TPCK-Trypsin（即含有凝乳蛋白酶抑制剂的胰蛋白酶）

TPCK=对甲苯磺酰苯丙氨酸氯甲酮如果酶解片段过大，用Sephadex.G-50,对于小的片段可直接上HPLC第32页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六1：ModificationofLys

如果Lys或Arg在蛋白质中过多，不能获得大片段可用顺丁烯二酸酐修饰Lys.一旦形成不被胰蛋白酶水解，在酸性条件下可去封闭，再被胰蛋白酶水解。2：ModificationofArg

丙烷-2.3-二酮或环己烷-1.2-二酮修饰，若有二硫键存在则环己烷-1.2-二酮则不起作用。3：ModificationofCys

通过修饰生成Lys的类似物，可被胰蛋白酶水解，从而在Cys处断裂。对于酶切后多肽片段过多过小或过大的情况处理第33页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六小肽段（20左右氨基酸）的序列测定：

肽的氨基酸测定主要是使用Edman化学降解法，此外还有酶解法、酶解-肽谱重叠法以及气谱-质谱联用法。

偶联(FITC偶联在多肽的N末端）裂解（三氟乙酸）转化（强酸）pTH氨基酸的鉴定（ATZ-噻唑啉酮胺）第34页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六目前在Edman法基础上产生一些新的方法：1。DNS-Edman序列分析法：利用DNS-Cl测定N末端残基，用Edman法去降解多肽，然后纯化少一个氨基酸残基的多肽，再用DNS-Cl测其N-末端残基；2。减数Edman法：利用Edman法降解肽链的N末端氨基酸残基，逐次从肽链中除去一个N-末端残基，并随后分析相应剩余肽链氨基酸组成，从而从每个循环中得知N端氨基酸的排列顺序；3。DABITC/PITC双偶合法；外肽二肽酶测定肽序列：（每隔2个残基切一次）第一次，酶水解得一个二肽，纯化，测定结构；第二次先从N-末端切去一个残基再用外肽酶水解得一个二肽，纯化，测定结构，然后两者比较就可得被测肽的序列。

第35页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六多肽片段的重叠重叠第36页，共44页，2022年，5月20日，4点40分，星期六二硫键位置的确定：一般用二种方法：1用酶直接水解变性的蛋白：由于二硫键只在偏酸性条件下才稳定（在碱性条件下易发生交换），因此常用胃蛋白酶水解，且此酶专一性低，位点多，