离子交换层析进阶与优化

Imagination

at

work.离子交换层析进阶与优化层析技术的分类凝胶过滤离子交换疏水层析亲和层析反相层析2离子交换和疏水层析2015/7/13离子交换层析原理如何做离子交换层析离子交换层析的应用离子交换填料的选择总结内容离子交换层析?4离子交换和疏水层析2015/7/133离子交换层析是通过生物分子所带的电荷与填料上所带的相反电荷的可逆相互作用来分离物质的一种层析方式。COOHR

NH+R

NH3+COO

-RNH2COO

-low

pH正电荷high

pH负电荷获得氢失去氢acid

isoelectric

point

alkalineexcess

positive

charge

balanced

positive

and

negative

charge

excessnegative

chargeCOOHR

NH+pH

3

3

pH

10RNH+3COO-RCOO-NH2overall

charge

on

protein-+蛋白质所带有的电荷取决于pH蛋白质的滴定曲线不同宿主中蛋白质pI的分布Archaeoglobus

fulgidus

(2420

proteins)

E.

coli

(4279

proteins)H.

Sapiens

(27

941

proteins)绝大部分的pI在5.8或9附近pI分布直方图SOURCE:

Multi-modality

of

pI

distribution

in

whole

proteome

Songfeng

et

al,

Proteomics,

2006蛋白质在生理环境下通常是带电荷的！6离子交换和疏水层析2015/7/13为什么选择离子交换?离子交换是一种可以在层析的各个阶段以及各种规模下广泛使用的层析技术良好的可操控性

Controllable高选择性

High

selectivity高载量

High

capacity可以将样品浓缩

Concentrating高回收率

High

recovery离子交换层析原理如何做离子交换层析离子交换层析的应用离子交换填料的选择总结内容怎样做离子交换层析步骤如何做①

选择合适的层析设备②

配制合适的缓冲液③

选择合适的层析填料④

样品准备⑤

洗脱方式⑥

填料的

和再生9离子交换和疏水层析2015/7/13上样洗脱平衡再生-----

-

--

-

-

---

------

-

--

--

--

-

-

--------

-

----++++

++

++++++-+

+

-+

++

-+-

+-

+

-

+-

+

--

++

-++

-

+-----

+-

+

--

-

+---阴离子交换介质怎样做离子交换-层析步骤10离子交换和疏水层析2015/7/13pH

cond

UVfraction

collection

Frac-901AW1W2B

MIXERsample11离子交换和疏水层析2015/7/13pump

P-920valve

FV-903monitor

UPC-900differentbuffersinjectionvalve

V1large

and

small

fractionscolumns

for

AIX,

CIXand

buffer

exchangemonitor

for

UV,conductivity

and

pH怎样做离子交换-①层析设备选择pH

3pH

10阴离子交换色谱阳离子交换色谱charge

on

protein-+怎样做离子交换-②选择缓冲液pH12离子交换和疏水层析2015/7/1310203040500

02040

60

80Elution

volume

(ml)100mAUM

NaCl13离子交换和疏水层析2015/7/1310.50120pH

5pH

6pH

7pH

8pH

9使用scouting功能筛选合适的pH条件分离DACOS怎样做离子交换-②选择缓冲液pHColumn:

Q

XL,

6

mlSample:

2

mg

crude

DACOSSystem:

ÄKTAexplorer™

100BufferPrep怎样做离子交换-②选择缓冲系统阴离子交换阳离子型缓冲体系,pH

略高于目标蛋白pI(0.5-1

PH)增加pH

可以提高结合的强度阳离子交换阴离子型缓冲体系,pH略低于目标蛋白pI(0.5-1

PH)降低pH可以提高结合的强度14离子交换和疏水层析2015/7/13A.Citrate

20

mM,

pH

4.9B.Citrate

20

mM,

NaCl

1

M,

pH

4.915离子交换和疏水层析2015/7/13A.Citrate

20

mM,

pH

4.9B.A

+

NaCl

1

M怎样做离子交换-②缓冲液配制方式“相同”的方式配制缓冲液？怎样做离子交换-②缓冲液中的添加剂不带电荷的中性添加剂通常是OK的！注意蛋白的溶解性和稳定性会增加静电作用添加甘油和醇类后粘度和背压增加阴离子去垢剂如

SDS 会结合在阴离子交换剂上阳离子去垢剂如

CPC 会结合在阳离子交换剂上采用去污剂后，先运行空白对照16离子交换和疏水层析2015/7/13500%

B1008time

minRNA/DNA0246RNADNAEDTA在阴离子交换层析中的累积和洗脱EDTA

absorbs

at

254

nm怎样做离子交换-②缓冲液中的添加剂去垢剂在盐梯度中达到临界胶束浓度CMC超过临界胶束浓度CMC,去垢剂形成胶束导致紫外检测出问题。怎样做离子交换-②缓冲液中的添加剂19

/GE

/怎样做离子交换-③选择填料基架OS

OO配基Sepharose基架Source基架Capto基架Sephadex基架纤维素基架阴离子交换剂DiethylaminoethylDiethylaminopropyl(DEAE)(ANX)-CH2CHOHCHH2N+H(CH2CH3)2

弱Quaternary

ammonium

(Q)

-CH2N+(CH3)3阳离子交换剂-OCH2CH2N+H(CH2CH3)2

弱强Carboxymethyl

(CM)Sulphopropyl

(SP)Methylsulphonate

(S)弱强强3-OCH2COO–-CH2CH2CH2SO

–3-CH2SO

–怎样做离子交换-③选择填料配基种类蛋白质分子的净电荷和pH有关，所以要根据蛋白质的等电点和稳定性来选择离子交换填料的类型如何选择合适的离子交换填料？从强离子交换剂开始(Q,S,SP)可以在宽pH范围开展工作如果目标蛋白的等电点低于pH7.0

或未知，用强阴离子交换剂如果强离子交换剂不满意，可以考虑弱离子交换剂20离子交换和疏水层析2015/7/13强离子交换剂:载量在很宽的pH

范围内保持恒定怎样做离子交换-③选择填料配基强弱弱离子交换剂:载量随pH

而变化原则：首选强离子交换剂，若选择性不够好时,尝试弱离子交换剂21离子交换和疏水层析2015/7/13高载量通量:–高流速粗纯

中度纯化

精纯高分辨率载量合适的流速最高的分辨率要求90

µm

40,

30,

34

µm

15

µm

10

µm粒径填料Sepharose

HPSOURCE

15MonoBeads™分辨率Rs通量Capto™Sepharose™

FFSOURCE™

30填料的选择可以登录

：

om/protein-purification怎样做离子交换-③选择填料颗粒大小22离子H交o换w和疏to水d层o析it2015/7/13怎样做离子交换-③选择填料颗粒大小平均粒径40μm23离子交换和疏水层析2015/7/13平均粒径90μmSample:0.4

mgconalbumin

pI=6.3,

0.8

mg

a-lactoglobulin

pI=5.8,1.2

mg

soyabean

trypsin

inhibitor

pI=4.5start

buffer.HiTrap™DEAE

FF

1

mlHiTrap

Q

FF

1

mlHiTrap

Q

XL

1

mlHiTrap

ANX

FF

high

sub

1

ml20

mM

Tris-HCl

pH

7.420

mM

Tris-HCl,

0.5

M

NaCl

pH

7.41

ml/min

150

cm/hdissolved

in

2mlColumns:Start

buffer:Elution

buffer:Flow

rate:Running

parameters

Equilibration:

20

ml

start

bufferSample

application:

2

mlwash:5

ml

start

buffer

elution

40

ml,

linear

gradient,0–80

%

elution

bufferÄKTAexplorer™

100

controlled

by

UNICORN™

3.0Instrumentation:怎样做离子交换-③实验筛选填料24离子交换和疏水层析HiTrap

IEX

/

HiTrap

Capto

IEX

select2i0o1n5/7K/i1t325离子交换和疏水层析2015/7/13怎样做离子交换-④样品准备在脱盐柱上进行缓冲液置换用于调整缓冲液的pH和盐浓度过滤和离心来去除不溶物，防止堵塞层析柱如果缓冲液的pH和盐浓度调整好了，大体积的样品可以直接上样样品应该溶解到起始缓冲液中，尤其是对于大体积的样品更加关键缓冲液的离子浓度应该在20-50mMAUvolumepH

valuegradientvolumeAUpH

valuegradient怎样做离子交换-④样品准备怎样做离子交换-⑤洗脱方式初次试验的标准条件:注意：不同盐具有不同的洗脱能力Sulphate

(SO4-2)Chloride

(Cl-1)Acetate

(CH3COO-1)150

mM350

mM700

mMStart

buffer

A:Elution

buffer

B:0–50

%

B51–100%

B100-0%

B20-50

mM20-50

mM

+

1

MNaClin

20

col

volin

3–5

col

volin

3–5

col

volseparationwashre-equilibrate27离子交换和疏水层析2015/7/13怎样做离子交换-⑤洗脱方式Manual

un

7

0_CondManual

un

7

0_pHManual

un

7

0_

act

onsManual

un

7

0_In

ectManual

un

7

0_UV

_280nm

Manual

un

7

0_

ogbook050000050020002500mAU

300020

030

040

050

060

070

080

0mlWas

eM

a

n

u

a

l

u

n

7

0

_

C

o

n

d

M

a

n

u

a

l

u

n

7

0

_

p

H

M

a

n

u

a

l

u

n

7

0

_

F

a

c

t

o

n

s

M

an

ua

lun

7

0

_

In

j

e

c

tM

a

n

u

a

l

u

n

7

0

_

U

_

2

8

0

n

m

M

a

n

u

a

l

u

n

7

0

_

L

o

g

b

o

o

k

50

0

00

0

50

0

2

0

0

0

2

5

0

0

m

A

U

3

0

0

0

24

0

26

0

28

0

34

0

ml

0W

a

s

t

eA

A

2

A3

A

5

W

a

s

t

eA6

A7

A8

A

9

A

0

A

A

2

B

2

B

B

0

B9

B8

B7

B6

W

a

s

t

e

B4

00 20

W

a

s

t

eHiscreen

CaptoDEAE(4.7ml)BufferA:pH8.2

50mM

Tris

0.075MNaClB

uffer

B:A+1MNaCl20min

0~100%BHiscreen

CaptoDEAE(4.7ml)BufferA:pH8.2

50mM

Tris0.075M

NaClB

uffer

B:A+1MNaCl20min

0~50%BManual

un

7

0_pHManual

un

7

0_

act

onsManual

un

7

0_In

ectManual

un

7

0_UV

_280nm

Manual

un

7

0_Cond

Manual

un

7

0_

ogbook05000005002000mAU500600620

mlC2

C3

C4

C6

C7

C8

Waste520

540C9

C

0

C C

2

D

2

D

D

0560

580Was

eHiscreen

CaptoDEAE(4.7ml)BufferA:pH8.2

50mM

Tris0.075M

NaClB

uffer

B:A+1MNaCl20min

0~30%B28离子交换和疏水层析2015/7/13洗脱梯度越长，分辨率越高线性洗脱优化后的分步洗脱怎样做离子交换-⑤洗脱方式选择29离子交换和疏水层析2015/7/13

分辨率高峰窄、浓度高

峰宽硬件要求低、工艺稳定选择性好需要预实验摸索怎样做离子交换-⑥填料的

和再生•用

1 Msalt去除结合比较紧的物质。然后用5个柱体积的缓冲液进行再平衡每次实验后都需要再生–

大多数的离子交换填料可以用

1 M

NaOH以彻底去除杂质!–

中性去污剂和酶可以用来进行

杂质脂质–

30%异丙醇保存–

使用过的离子交换填料保存在20%乙醇中30离子交换和疏水层析2015/7/13离子交换层析原理如何做离子交换层析离子交换层析的应用离子交换填料的选择总结内容技术阴离子交换亲和层析凝胶过滤阳离子交换备注快速去除蛋白酶常规亲和层析步骤用于DNA

结合蛋白缓冲液置换最后精细纯化>90%纯度Mono

S™

5/50

GLdisrupted

and

clarifiedE.

coli

expressing

TniA17.5

mlSOURCE™

15Q

4.6/100

PEHiTrap™

Heparin

HPHiPrep™

26/10

DesaltingSephadex™

G-25

Fine规模纯化碱性DNA-结合蛋白32离子交换和疏水层析2015/7/13技术阴离子交换疏水层析凝胶过滤阴离子交换备注快速捕获中度纯化缓冲液置换精细纯化>90%纯度>60%收率SOURCE™

30

Q

packedin

FineLINE™

70homogenized

E.

coliexpressing

Tyrosinephosphatase

1B

7.6

LQ

Sepharose™

XL

packedin

INdEX™

100/500Phenyl

SepharoseHigh

Performancepacked

in

BPG™

100/500Sephadex™

G-25

Finepacked

in

BPG

200/50033离子交换和疏水层析2015/7/13在中试规模纯化重组蛋白离子交换层析原理如何做离子交换层析离子交换层析的应用离子交换填料的选择总结内容选择重点:合适的基架纯度RESOURCE

Q™

1ml15

µm30

µmQ

Sepharose™

FF16

x50

mmSOURCE™

Q

XK16

x

50

mm34

µmQ

Sepharose™

HP16

x

50

mm90

µm反压Capture

•Intermediate

purificationPolishing10

µm3

µmMono

Q™

5/50

GL•Mini

Q™(4.6x50mm)通量•高Sepharose基架High

Performance

(34um)Fast

Flow

(90