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文档简介

免疫共沉淀技术汇报人：马云霞（20121902040）组成员：戴亮亮（20121902017）冯永芬（20121902019）尚亚宁（20121902015）免疫共沉淀技术定义及原理操作过程注意事项优点和不足应用及实例展望基本原理

在细胞裂解液中加入抗目的蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于sepharosebeads上的proteinA/G，与细胞中的目的蛋白结合，就形成一种复合物:目的蛋白/目的蛋白-抗目的蛋白抗体-proteinA/G，经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物被分开。最后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。

原理流程图解免疫共沉淀总实验流程：步骤和方法（1）蛋白样品准备

（如果为细胞样品，需先裂解细胞）（2）抗原抗体结合反应（3）ProteinA/G与抗原抗体复合物结合（4）免疫复合物与proteinA/G解离

（一般采用2%SDS煮沸5分钟处理样品）（5）分析鉴定

（应用SDS，western-blotting或质谱仪分析鉴定样品)实验室常用的琼脂糖基质的ProteinA/G产品可用于免疫共沉淀。实验流程如图所示CO-IP操作过程示意图关键因素1.抗原的丰度2.抗体的结合能力3.蛋白质和抗体的可接触性注意事项1.

细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用。2.最需要注意点是抗体的性质，特别是多抗的特异性是问题。抗体不同和抗原结合能力也不同，免染能结合未必能用在IP反应。3.低温下进行实验。为防止蛋白的分解，修饰，溶解抗原的缓冲液必须加蛋白酶抑制剂。4.考虑抗体/缓冲液的比例。（抗体过少就不能检出抗原，过多则就不能沉降在beads上，残存在上清。缓冲剂太少则不能溶解抗原，过多则抗原被稀释）5.

确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的。鼻咽癌细胞中p53相结合蛋白质的分离和鉴定实例

P53基因是一种人体抑癌基因，人体癌症发生约一半由于该基因突变失活。1.抗p53抗体与HNE1和HNE2总蛋白进行免疫共沉淀；2.SDS分离免疫沉淀复合物；3.切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析，得到相应的肽序列标签；4.搜索数据库分析目的蛋白相关数据。展望

生物学中的许多现象如复制、转录、翻译、剪切、分泌、细胞周期调控、信号转导等均受蛋白质间相互作用的调控。蛋白质间相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中，有些蛋白质由多个亚单位组成；有些蛋白质结合紧密；有些蛋白质只有短暂的相互作用。不论哪种情况，它们均控制着大量的细胞活动事件（细胞增殖、分化和死亡）。只有使蛋白质间相互作用顺利进行，细胞的正常生命活动才有保障。

由于蛋白质间相互作用具有重大的意义，因此其检测方法的研究也备受重视。蛋白质相互关系的研究以后会愈来愈多，我们不仅可通过免疫共沉淀技术来证实，还有更多

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