二章-酶工程原理(与“底物”有关文档共125张)

酶蛋白质结构基础一、20种天然常见氨基酸、肽链和肽单位、蛋白质空间结构的基本组件

第一节酶蛋白质结构第1页，共125页。一、20种天然常见氨基酸1.基本结构主链侧链Cα第2页，共125页。甘氨酸：侧链只有一个H原子，无L-型与D-型之分脯氨酸具有类似而不同的化学结构：

侧链主链N原子共价结合亚氨基酸主链侧链第3页，共125页。alanine 丙氨酸 Ala Aarginine 精氨酸 Arg Rasparagine 天冬酰氨 AsnAsx Nasparticacid 天冬氨酸 AspAsx Dcysteine 半胱氨酸 Cys Cglutarmine 谷氨酰胺 GlnGlx Qglutarmicacid 谷氨酸 GluGlx Eglycine 甘氨酸 Gly Ghistidine 组氨酸 His Hisoleucine 异亮氨酸 Ile Ileucine 亮氨酸 Leu Llysine 赖氨酸 Lys Kmethionine 甲硫氨酸 Met Mphenylalanine 苯丙氨酸 Phe Fproline 脯氨酸 Pro Pserine 丝氨酸 Ser Sthreonine 苏氨酸 Thr Ttryptophan 色氨酸 Trp Wtyrosine 酪氨酸 Tyr Yvaline 缬氨酸 Val V要求：能倒背不用的字母JUZBOX第4页，共125页。二十种氨基酸的化学结构第5页，共125页。2.基本性质（侧链的性质）（1）疏水氨基酸Ala,Val,Leu,Ile,Met,Pro,Phe

侧链一般无化学反应性，形成疏水内核（2）极性氨基酸Ser,Thr,Asn,Gln,Cys,His,Tyr,Trp

侧连含有极性基团，具有不同的化学反应性（3）荷电氨基酸Asp,Glu,Arg,Lys

侧链可以解离，使氨基酸残基带负电荷或正电荷，从而具有酸碱性，Asp

和

Glu是酸性残基；Arg和Lys是碱性残基。

Tyr,Trp,Phe

具有芳香性侧连，使蛋白质产生紫外线吸收和荧光特性，作为蛋白质结构变化的探针。第6页，共125页。1.单一构型和旋转异构体构型：是一个分子中原子的特定空间排布。构型改变必须有共价键的断裂和重新形成。最基本的分子构型为

L-型和D-型，这种异构体在化学上可以分离。构象：组成分子的原子或基团绕单键旋转而形成的不同空间排布。构象改变，无共价键的断裂和重新形成，化学上难于区分和分离。（1）构型与构象第7页，共125页。L-氨基酸的基本结构CHH2NCOOHRα碳原子,不对称碳原子侧链二十种氨基酸除Gly外全是L-型？残基：在肽链中每个氨基酸都脱去一个水分子，脱水后的残余部分叫残基（residue),因此蛋白质肽链中的氨基酸统统是残基形式。氨基酸的基本结构Chiralcarbon第8页，共125页。（2）天然氨基酸的单一构型除甘氨酸外，都为L-型，有机合成中，L-型和D-型以大体相同的比例出现，可分离。

（3）优势构象与旋转异构体旋转异构体：大多数氨基酸的侧链都有一种或少数几种交错构象作为优势构象最经常出现在天然蛋白质中，它们之间称为旋转异构体。

第9页，共125页。二、肽链和肽单位1.肽键与多肽肽键：一个氨基酸的羧基与下一个氨基酸的氨基经缩合反应形成的共价连接，称为肽键。第10页，共125页。二、肽链和肽单位具有局部双键的性质，不能旋转，两种构型通过肽键将多个氨基酸连接在一起构成多肽链第一个氨基酸具有自由的氨基，称氨端或N端最末一个氨基酸具有自由的羧基，称羧端或C段顺式（trans）反式(cis)第11页，共125页。2.肽单位与多肽主链肽单位：由于局部双键性质，肽键连接的基团处于同一平面，具有确定的键长和键角，是多肽链中的刚性结构，称为肽单位。有序连接的肽单位构成多肽链的主链，在所有氨基酸中都相同（不同的是侧链）

蛋白质分子的基本建筑模块即是：肽单位侧链基团第12页，共125页。3多肽链的构象第13页，共125页。扭角（二面角）BCADBCADBCDA

ABCDΦi(Ci-1’,Ni,Cia,Ci’)ψi(Ni,Cia,Ci’,Ni+1)第14页，共125页。拉氏构象图第15页，共125页。三、蛋白质空间结构的基本组件1.α螺旋（α-Helix）2.β层（β-sheet）3.环肽链（loop）4.疏水内核第16页，共125页。右手型，也称为13螺旋螺距每个氨基酸残基的羰基与后面第4个（n+4）残基的氨基形成氢键稳定因素：氢键1.α螺旋（α-Helix）（1）基本结构参数第17页，共125页。两亲性螺旋对生物活性具有重要作用，通过蛋白质工程方法增加结构上重要区域的两亲性，可以提高分子的生物活性。（2）两亲螺旋一侧亲水残基一侧疏水残基两亲性：一侧面向溶剂一侧面向疏水内核α螺旋大多沿蛋白质分子表面分布两亲性正好适应这种要求第18页，共125页。（3）倾向于形成α螺旋的氨基酸强烈倾向于形成的：Ala,Glu,Leu,Met非常不利于形成的：Pro,Gly,Tyr,SerPro无形成氢键的能力，α螺旋中凡有Pro出现的地方，必然发生弯折第19页，共125页。2.β层（β-sheet）基本单位是β链，全伸展构象，可视为每圈具有2个氨基酸残基和每个残基有平移距离的特殊螺旋。单链不稳定，原子间无相互作用；β层稳定，β链间以主链氢键相连。两种基本类型，平行β层、反平行β层；混合型β层，同一肽链的不同区域和不同肽链的β链都可以形成β层。第20页，共125页。图：在平行（A）和反平行（B）β－折叠片中氢键的排列第21页，共125页。反向β－折叠NC第22页，共125页。3.环肽链（loop）（1）β转折（β转角，回折，β-turn）

4个氨基酸残基顺序连接的一段短肽链，具有180°弯折的特殊构象。

（2）β发夹(β-hairpins)通过一段短的环链将两条相邻的β链连接在一起的结构作用：连接二级结构元素的主要结构因素常出现在生物活性位置，三维结构具有功能意义

第23页，共125页。第24页，共125页。4.疏水内核

蛋白质结构的共同特征：疏水内核，由紧密堆积的疏水侧链构成。与一系列重要的物化性质相关，它的形成是以疏水相互作用为基础的。

疏水相互作用：是指非极性基团在任何极性环境中强烈趋于彼此聚集的择优效应多肽链折叠的原始推动力稳定蛋白质三维结构的主要因素意义：第25页，共125页。酶蛋白质结构的层次体系和结构的形成一、酶蛋白质结构的层次体系、酶蛋白质结构的形成第26页，共125页。蛋白质结构丰富的层次体系：一、蛋白质结构的层次体系丹麦生物学家KaiLinderstrom，将蛋白质结构划分为一级、二级和三级结构英国化学家Bernal，使用四级结构描述复杂多肽链蛋白质分子的亚基结构二级结构与三级结构之间又发现了结构模体（超二级结构）和结构域重点是结构模体和结构域。第27页，共125页。1.一级结构（primerystructure）一级结构：蛋白质分子拥有的多肽链的数量，组成氨基酸的序列以及链间或链内共价连接的方式。包含氨基酸序列、二硫键的数量和配对方式蛋白质结构组织的基本原理：一级结构是蛋白质结构层次的基础，它决定了高级结构第28页，共125页。2.二级结构（secondarystructure）二级结构：在一段连续的肽单位中具有同一相对取向，可以用相同的构象角来表征，构成一种特征的多肽链线性组合。多肽主链局部区域的规则结构，不涉及侧链的构象和多肽链其它部分的关系主要二级结构：有α螺旋，平行β层，反平行β层，

β转折、310螺旋稳定因素：主要由其内部形成的主链氢键所稳定，因此氢键的排布方式也是二级结构的重要特征第29页，共125页。3.结构模体（motifstructure）结构模体：一级顺序上相邻的二级结构在三维折叠中也靠近，彼此按特定的几何排布形成简单的组合，可以同一结构模式出现在不同的蛋白质中，这些组合单位称为结构模体。结构模体是一类超二级结构（supersecondarystructure）是三级结构的建筑模块有的模体具有特定的功能，如与DNA结合第30页，共125页。几种在已知蛋白质结构中最常见的模体：（3）反平行β层回纹模体（Greekkeymotif）（1）螺旋-转折-螺旋模体（HTH）（2）发夹式模体（β-βunit）（4）β-α-β模体（β-α-βmotif）（5）复杂模体（complexmotif）第31页，共125页。（1）螺旋-转折-螺旋模体（HTH）具有特定功能的最简单的模体，由一个环区连接的两段螺旋组成，称为螺旋-转折-螺旋模体（简称HTH）。一种是DNA结合模体，专一性的与DNA结合一种是钙结合模体，对钙结合专一2种类型：第32页，共125页。钙调蛋白HTH

Ca第33页，共125页。（2）发夹式模体（β-βunit）两段相邻的反平行β链被一环链连接在一起构成的组合，取其形貌与发夹类似，称为发夹式β模体，也称为β-β组合单位。无特定的功能。牛胰蛋白抑制剂发夹式β模体第34页，共125页。

4段反平行β链以特定的来回往复方式组合，其形貌类似于古希腊钥匙上特有的回形装饰纹，故又称为希腊钥匙型模体。（3）反平行β层回纹模体（Greekkeymotif）第35页，共125页。葡萄球菌核酸酶312第36页，共125页。（4）β-α-β模体（β-α-βmotif）是一种连接两股平行β链的结构元素组合。反平行β链，末端靠近，短环链连接成发夹式模体；平行β链，相反端连接，形成特定的二级结构元素组合：

β链1-环链1-α螺旋-环链2-β链2功能：β链1羧端—α链氨端，功能结合部位，活性位置α链羧端—β链2氨端，无活性第37页，共125页。活性位置无生物活性第38页，共125页。（5）复杂模体（complexmotif）两个相邻的β发夹型模体通过环链相连，构成更加复杂的模体。组合方式有24种，只有8种被观察到。

第39页，共125页。EA、EB一酶—底物复合体，从理论上讲，在底物分子中呈现的任何手性特征，都可被酶所识别，但其识别特性取决于酶—底物复合物的结合方式。第81页，共125页。一种是DNA结合模体，专一性的与DNA结合tyrosine 酪氨酸 Tyr Y第77页，共125页。在体内外起降解作用，也是人类应用最广的酶类。[S]/V=Km/Vmax+[S]/Vmax两亲性正好适应这种要求第93页，共125页。在高底物浓度下竞争性抑制剂的作用被压倒，因为充分的高底物浓度可以将结合到活性部位的抑制剂分子竞争地排出。将(5)代入(4)得米氏方程式：4.结构域（domain）结构域：二级结构和结构模体以特定的方式组合连接，在蛋白质分子中形成2个或多个在空间上可以明显区分的三级折叠实体，称为结构域。蛋白质三级结构的基本单位，由一条多肽链（单结构域蛋白质中）或多肽链的一部分（多域蛋白质中）独立折叠形成稳定的三级结构。结构域同时是功能单位。

第40页，共125页。图：蛋白质分子中的结构域（a）磷酸甘油酸激酶的两个结构域：（b）木瓜蛋白酶的两个结构域第41页，共125页。5.三级结构（tertiarystructure）三级结构：结构域在三维空间中以专一的方式组合排布，或者二级结构、结构模体及其与之相关联的各种环肽链在空间中的进一步协同盘曲、折叠，形成包括主链、侧链在内的专一排布。对于无亚基并只有单结构域的蛋白质，三级结构就是它的完整的三维结构。较大的蛋白质，具有多个结构域或亚基，需要进一步组织才能形成完整分子。第42页，共125页。6.四级结构（quaternarystructure）

四级结构：指蛋白质分子的亚基结构（subunit），亚基的数目、类型、空间排布方式和亚基间相互作用的性质，构成四级结构的基本内容。亚基：许多蛋白质作为完整的活性分子，是由两条以上的多肽链组成，它们各自以独特的一级、二级、三级结构相互以非共价作用联结，共同构成完整的蛋白质分子，这些肽链单位称为亚基。其聚合整体称为寡聚体。第43页，共125页。酶蛋白质结构的形成——

多肽链的生物合成与折叠一、多肽链的生物合成、多肽链的折叠——

蛋白质三维结构的形成第44页，共125页。在遗传密码指导下，将氨基酸按特定序列在核糖体上连接起来，形成只有一级结构（氨基酸序列）的多肽链，称为多肽链的生物合成。蛋白质在体内的形成分为两个阶段：第一阶段：第45页，共125页。合成的多肽链，以现在尚不清楚的机制自动折叠成为特定的三维结构，形成具有完整结构和功能的蛋白质分子，称为新生肽链折叠（或蛋白质折叠）。第二阶段：第46页，共125页。第二节酶的分类、组成

一、酶的分类1961年国际生化联合会酶学委员会EnzymeCommission(EC)提出将酶分为6类：（1）氧化还原酶在体内参与产能、解毒和某些生理活性物质的合成。重要的有各种脱氢酶、氧化酶、过氧化酶等。（2）转移酶在体内将某些基团从一个化合物转移到另一个化合物，参与核酸、蛋白质、糖几脂肪的代谢和合成。重要的有酰基转移酶、糖苷基转移酶、含氮基转移酶、磷酸基转移酶、含硫基转移酶等。第47页，共125页。（3）水解酶在体内外起降解作用，也是人类应用最广的酶类。重要的有各种脂肪酶、糖苷酶、肽酶等。水解酶一般不需辅酶。（4）裂合酶这类酶可脱去底物上某一基团而留下双键，或可相反地在双键处加入某一基团。它们分别催化C—C、C—O、C—N、C—S、C—X(F,Cl,Br,1)和P—O键。第48页，共125页。（5）异构酶此类酶为生物代谢需要而对某些物质进行分子异构化，分别进行外消旋、差向异构、顺反异构、醛酮异构、分子内转移、分子内裂解等。（6）连接酶（合成酶）这类酶关系很多生命物质的合成，其特点是需要三磷酸腺苷等—高能磷酸酯作为结合能源，有的还需金属离子辅助因子。分别形成C—O键(与蛋白质合成有关)、C—S键(与脂肪酸合成有关)、C—C键和磷酸酯键。第49页，共125页。原则：根据酶所用的底物来命名 核糖核酸酶Ribonuclease

蛋白酶Protease根据所催化的反应来命名 脱氢酶Dehydrogenase

磷酸转移酶Phosphotransferase

上述两个原则结合上述原则再加上酶的来源 牛胰核糖核酸酶第50页，共125页。3水解酶4水解肽键21活性位点有丝氨酸4此类第四个第51页，共125页。二、酶的组成①单体酶，仅有一个活性部位的多肽链构成的酶，分子质量为13-35ku，为数不多，且都是水解酶；②寡聚酶，由若干相同或不同亚基结合而组成的酶，亚基一般无活性，必须相互结合才有活性，分子质量为35ku以上到数百万单位；酶蛋白有3种组成形式第52页，共125页。③多酶复合体，指多种酶进行连续反应的体系。前一个反应产物为后一反应的底物。仅有少部分酶是由单一蛋白质所组成，而大部分酶则为复合蛋白质，或称全酶，是由蛋白质部分(酶蛋白)和非蛋白质部分所组成，即酶蛋白本身无活性，需要在辅因子存在下才有活性。第53页，共125页。第三节酶作为催化剂的特点(1)酶催化化学反应条件温和(2)酶用量少，催化效率高,催化能力强(3)相容性好，酶催化反应具有广谱性(4)酶底物具有广泛性(5)调节性(6)酶催化反应的高度选择性，专一性(7)酶有助于环境的可持续性第54页，共125页。(1)酶催化化学反应条件温和麦芽糖+H2O2葡萄糖常温，常压，中性pH第55页，共125页。(2)催化效率高、催化能力强化学催化剂需要％-l％的量，而酶催化剂只需要10-6-l0-5。酶加快反应速度可达1017倍。如乙酰胆碱酯酶接近1013倍，丙糖磷酸异构酶为109倍，分支酸变位酶为1.9×106倍，四膜虫核酶接近1011倍。第56页，共125页。(3)相容性好，酶催化反应具有广谱性酶与酶之间的相容性好可以在同一反应体系中利用多种酶完成序列反应。酶几乎可以催化所有类型的有机化学反应，这些反应包括：酯类的水解与合成，氨基化反应，内酯化反应，内酰氨化，酐化，环氧化和氰化，烯烃、烷烃、芳烃、醇类、醛类和酮类的氧化还原，加羧基和脱羧基，异构化，酮醇化等。第57页，共125页。(4)酶底物具有广泛性除可作用于天然底物外，还可用于非天然的底物。另外，酶在水相中能起催化作用，还可用于非水相催化。第58页，共125页。(5)调节性酶活性的调节控制主要有下列7种方式：①酶浓度的调节、②激素的调节、③共价修饰调节、④限制性蛋白水解作用与酶活力调控、⑤抑制剂的调节、⑥反馈调节、⑦金属离子和其他小分子化合物的调节。第59页，共125页。(6)酶催化反应的高度选择性，专一性

大多数酶对所作用的底物和催化的反应都是高度专一的。不同的酶专一性程度不同，有些酶专一性很低（键专一性），如肽酶、磷酸（酯）酶、酯酶、可以作用很多底物，只要求化学键相同。选择性主要体现在三个方面

:①化学选择性(chemoselectivity)

②区域选择性(regioselectivity)和非对映选择性(diasteroselectivity)③光学对映选择性(enantioselectivity)，第60页，共125页。①化学选择性(chemoselectivity)，主要是指酶只能催化某一类基团或一类化学反应。与化学合成法相比，酶促反应无副反应产物，有利于清洁生产和便于产物的分离纯化。比如酯类的酶法水解过程中根本没有缩醛解离的现象。②区域选择性(regioselectivity)和非对映选择性(diasteroselectivity)，由于酶特殊而复杂的空间三维结构，使之能够有区别地催化某一功能基团区域的反应。第61页，共125页。③光学对映选择性(enantioselectivity或chiralselectivity)，由于几乎所有的酶都是由L氨基酸组成的，因此它本身就是一种带有手性的催化剂。从理论上讲，在底物分子中呈现的任何手性特征，都可被酶所识别，但其识别特性取决于酶—底物复合物的结合方式。因此，一个前手性(prochiral)的物质，有可能通过不对称的酶法转化，生成有光学活性的目标产物。而且一种消旋体可被酶以不同的比例拆分成两种光学对映体。第62页，共125页。(7)酶有助于环境的可持续性化学催化剂(如重金属等)对环境造成污染，而酶可降解、无毒、用量少、效率高、专一性好、反应条件温和、反应物生物可降解，使酶具有宽广的工业应用前景。第63页，共125页。酶与化学催化剂比较具有显著的特性，最重要的有三方面:高催化效率强专一性酶活性可以调控。第64页，共125页。与酶催化相关的几个概念(1)酶的活性中心(activecenter)酶蛋白的多肽链经过盘绕折叠，少数特异的氨基酸在空间结构上形成一个与催化活力直接相关的区域，称为活性中心。酶的活性中心通常分为底物结合部位和催化部位。其中结合部位“负责”酶与底物的结合，也称之为专一性部位。催化部位“负责”催化，直接指导和完成生化反应。第65页，共125页。(2)别构部位(allostericsite)别构部位是指酶蛋白上结合效应物的部位。效应物是指结合到酶蛋白的别构部位上，能引起酶分子中活性中心的构象发生变化，从而间接地影响酶活性的一类物质。第66页，共125页。(3)酶活性(enzymeactivity)酶的比活力是酶用量的依据，也是同类酶之间质量相互比较的依据，其通俗的定义是指能够转化一定量底物或生成一定量产物所需的酶量。比活力是每毫克蛋白质中酶单位的数量（U/mg）酶活力单位可用许多方式表示，有两种酶活力的标准单位，即：酶单位（U）和“开特”（Kat）。酶的一个活力单位是在该酶的最适条件下，在25℃，1min内催化1umol的底物转化为产物的酶量。“开特”是酶活力的国际单位（SI），它规定在特定体系下，反应速度为每秒转化1mol底物所需的酶量。在两种不同的酶活力单位之间可用换算。酶活力（或总活力）涉及在样品中酶的总单位，第67页，共125页。(4)辅因子(cofactor)在酶工程制药中，有相当数量的药物的药效基团是手性羟基，因此需要能提供电子或氢等辅因子的参与。第68页，共125页。蛋白质部分：酶蛋白(apoenzyme)辅助因子(cofactor)

金属离子小分子有机化合物全酶(holoenzyme)酶蛋白决定反应的特异性辅助因子决定反应的种类与性质*各部分在催化反应中的作用第69页，共125页。金属离子的作用稳定酶的构象；参与催化反应，传递电子；在酶与底物间起桥梁作用；中和阴离子，降低反应中的静电斥力等。小分子有机化合物的作用在反应中起运载体的作用，传递电子、质子或其它基团。第70页，共125页。小分子有机化合物在催化中的作用

第71页，共125页。辅助因子分类（按其与酶蛋白结合的紧密程度）

辅酶

(coenzyme):与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。

辅基

(prostheticgroup):与酶蛋白结合紧密，不能用透析或超滤的方法除去。第72页，共125页。第四节酶的作用机制酶一般是通过其活性中心，通常是其氨基酸侧链基团优先与底物形成一个中间复合物，随后在分解成产物，并放出酶。酶的活性部位（activesite）是它结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个酶分子相当小的一部分，它是由在线性多肽链中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。活性部位通常是在酶的表面空隙或裂缝处，形成促进底物结合的优越的非极性环境。一、酶与底物形成一个中间复合物第73页，共125页。第74页，共125页。反应总能量改变非催化反应活化能酶促反应活化能一般催化剂催化反应的活化能能量反应过程底物产物酶促反应活化能的改变

活化能：底物分子从初态转变到活化态所需的能量。第75页，共125页。底物浓度对反应速度的影响1单底物、单产物反应2酶促反应速度一般在规定的反应条件下，用单位时间内底物的消耗量和产物的生成量来表示3反应速度取其初速度，即底物的消耗量很小（一般在5﹪以内）时的反应速度4底物浓度远远大于酶浓度研究前提在其他因素不变的情况下，底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线关系。第76页，共125页。当底物浓度较低时反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。[S]VVmax目录第77页，共125页。随着底物浓度的增高反应速度不再成正比例加速；反应为混合级反应。[S]VVmax目录第78页，共125页。当底物浓度高达一定程度反应速度不再增加，达最大速度；反应为零级反应[S]VVmax目录第79页，共125页。在单底物条件下，Brown和Henri于1902年提出了著名的中间复合物学说，即酶和底物首先形成复合物，然后复合物分离，形成产物和酶，下式是这一过程的直观表示

第80页，共125页。1913年Michaelis和Menten提出反应速度与底物浓度关系的数学方程式，即米－曼氏方程式，简称米氏方程式(Michaelisequation)。[S]：底物浓度V：不同[S]时的反应速度Vmax：最大反应速度(maximumvelocity)

Ｋm：米氏常数(Michaelisconstant)

第81页，共125页。米－曼氏方程式推导基于两个假设：E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即

V＝k3[ES]。(1)S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变即[S]＝[S0]。第82页，共125页。（一）推导过程稳态：是指ES的生成速度与分解速度相等，即[ES]恒定。K1([E0]－[ES])[S]＝K2[ES]+K3[ES]K2+K3＝Km

（米氏常数）

K1令：则(2)变为:([E0]－[ES])[S]＝Km[ES](2)＝([E0]－[ES])[S]K2+K3[ES]K1整理得：第83页，共125页。当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即[E0]＝[ES]，反应达最大速度Vmax＝K3[ES]＝K3[E0](5)[ES]＝───[E0][S]Km+[S](3)

整理得:将(5)代入(4)得米氏方程式：Vmax[S]Km+[S]V＝────将(3)代入(1)得K3[E0][S]Km+[S](4)

V＝────第84页，共125页。当反应速度为最大反应速度一半时

Km值的推导Km＝[S]∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。2＝Km+[S]

Vmax

Vmax[S]VmaxV[S]KmVmax/2第85页，共125页。（二）Km与Vmax的意义

Km值①Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。②意义：a)

Km是酶的特征性常数之一；b)

Km可近似表示酶对底物的亲和力；c)

同一酶对于不同底物有不同的Km值。第86页，共125页。

Vmax定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。意义：Vmax=K3[E]如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算酶的转换数(turnovernumber)，即动力学常数K3。第87页，共125页。（三）Ｋm值与Ｖmax值的测定1.双倒数作图法(doublereciprocalplot)，又称为林-贝氏(Lineweaver-Burk)作图法-1/Km

1/Vmax1/[S]1/V

Vmax[S]Km+[S]V=（林－贝氏方程）+1/V=KmVmax1/Vmax1/[S]两边同取倒数第88页，共125页。第25页，共125页。结合部位与底物之间存在互补的特点，就像锁和钥匙的关系，因而造成酶催化反应的很强的专一性。第87页，共125页。酶的活性中心常为酶分子的凹穴，此处常为非极性或疏水性的氨基酸残基。第91页，共125页。(3)酶活性(enzymeactivity)酶的比活力是酶用量的依据，也是同类酶之间质量相互比较的依据，其通俗的定义是指能够转化一定量底物或生成一定量产物所需的酶量。脯氨酸具有类似而不同的化学结构：酶几乎可以催化所有类型的有机化学反应，这些反应包括：酯类的水解与合成，氨基化反应，内酯化反应，内酰氨化，酐化，环氧化和氰化，烯烃、烷烃、芳烃、醇类、醛类和酮类的氧化还原，加羧基和脱羧基，异构化，酮醇化等。1961年国际生化联合会酶学委员会EnzymeCommission(EC)提出将酶分为6类：与酶催化相关的几个概念第30页，共125页。第三节酶作为催化剂的特点典型的竞争性抑制剂与酶的正常底物有近似的结构，因此它与底物分子竞争地结合到活性部位。在高底物浓度下竞争性抑制剂的作用被压倒，因为充分的高底物浓度可以将结合到活性部位的抑制剂分子竞争地排出。酶的活性中心通常分为底物结合部位和催化部位。2.Hanes作图法[S][S]/V-Km

Km/Vm在林－贝氏方程基础上，两边同乘[S][S]/V=Km/Vmax+[S]/Vmax第89页，共125页。二、酶的活性部位模型假说1.锁钥模型假说(EmilFischer,1894)酶作为生物催化剂有一个重要特点，即实现酶催化功能的必要条件之一是底物必须在酶上结合。锁钥模型假说提出了结合部位概念。结合部位与底物之间存在互补的特点，就像锁和钥匙的关系，因而造成酶催化反应的很强的专一性。结合部位是酶的活性中心的组成部分。第90页，共125页。2.诱导契合模型假说(DEKoshlandJr)后来的研究发现自由酶的活性部位和底物间并不精确地像锁钥匙一般配合，从而提出了诱导契合模型假说。该假说认为，酶与底物结合时，结合力促使酶和底物分别发生一些构象的变化，更有利于催化反应的发生。酶的构象变化可使结合更紧密，并使催化基团处于更有利于催化的位置上。底物形变造成的应力状态则可能使发生反应的键变弱，降低反应的活化自由能使反应速度增加。形变所需的能量则是由结合能提供的。

第91页，共125页。酶的抑制作用任何分子直接作用于酶使它的催化速率降低即称为抑制剂（inhibitor）。某些酶的抑制剂是正常的细胞代谢物，有些抑制剂可以是外源物质。酶抑制作用有两种主要类型；不可逆的或可逆的。可逆的抑制作用本身又可在分为竞争性的和非竞争性的抑制作用。（一）、不可逆抑制作用抑制剂不可逆的与酶结合，它通常是与或靠近活性部位的氨基酸残基形成共价键，永久地使酶失活。第92页，共125页。（二）可逆的竞争性抑制典型的竞争性抑制剂与酶的正常底物有近似的结构，因此它与底物分子竞争地结合到活性部位。酶既可以结合底物分子也可以结合抑制剂分子，但不能两者同时结合。竞争性抑制剂可逆地结合到活性部位。在高底物浓度下竞争性抑制剂的作用被压倒，因为充分的高底物浓度可以将结合到活性部位的抑制剂分子竞争地排出。因此，酶的Vmax没有变化，但在竞争性抑制剂存在下，酶对其底物的表观亲和力降低，因此Km增加。第93页，共125页。竞争性抑制剂竞争性抑制剂:

结合酶活性位点和底物竞争，或间接的诱导酶结合底物的位点改变E+S<===>ES===>P+E

+IEIk2k2+k3k1Km=k1k3第94页，共125页。第95页，共125页。（三）可逆的非竞争性抑制非竞争性抑制剂可逆地结合到除酶活性部位外的其他位点上，它使酶总的三维形状改变，导致催化活性降低。因为抑制剂结合到与底物不同的酶结合部位，所以，酶既可以结合抑制剂，又可以结合底物，也可以将抑制剂和底物二者一起结合。非竞争性抑制剂的效应不能由增高底物浓度而克服，所以，Vmax降低。在非竞争性抑制作用中，酶对底物的亲和力不变，因此，Km保持一致。非竞争性抑制作用的实例是胃蛋白酶抑制剂对肾素的作用。第96页，共125页。非竞争性抑制竞争性抑制剂:

结合酶的非活性位点，改变酶的三维形状，底物虽然可与酶结合但是不能生成产物。E+S<===>ES===>P+E

+ +I IKI KI

EI+S<===>EISk2k1k3

第97页，共125页。第98页，共125页。三酶的催化作用

广义的酸碱催化、共价催化、邻近效应及定向效应、变形或张力以及活性中心为疏水区域5个方面。1．广义的酸碱催化在酶反应中起到催化作用的酸与碱，在化学上应与非酶反应中酸与碱的催化作用相同。酸与碱，在狭义上常指能离解H+与OH-的化合物。狭义的酸碱催化剂即是H+

与OH-。广义的酸碱是指能供给质子（H+）与接受质子的物质。第99页，共125页。2．共价催化所谓共价催化就是底物与酶以共价方式形成中间物。

第100页，共125页。酶催化机理实例—胰凝乳蛋白酶A.酶与底物结合，形成米氏复合物（ES）B.形成四联体过度态中间物第101页，共125页。第102页，共125页。E.形成包括水分子的四联体过度中间物F.羧基产物形成，酶游离第103页，共125页。3．邻近效应及定向效应所谓邻近效率，就是底物的反应基团与酶的催化基团越靠近，同时与底物定向，其反应速度越快。第104页，共125页。4．变形或张力酶使底物分子中的敏感键发生变形或张力，从而使底物的敏感键更易于破裂，有利于底物与酶的结合。5．酶的活性中心为疏水区域酶的活性中心常为酶分子的凹穴，此处常为非极性或疏水性的氨基酸残基。

第105页，共125页。图4：变形或张力示意第106页，共125页。四酶的立体专一性区别：非酶促反应中底物分子之间是通过均一地接触与碰撞完成化学反应，而酶促反应是在一个非对称的特殊蛋白的表面上发生，也正因为如此，酶才能完成对底物的非对称反应。第107页，共125页。酶催化反应三点结合学说1948年，A.G.Agston在《自然》杂志上提出了著名的三点结合学说(three-pointattachmentrule)，用于解释酶促反应高度的对映体选择性。这一学说的核心就是在酶催化反应中，底物与酶之间至少有3个活性结合位点，即底物中同手性碳