生物药物成分的提取纯化技术

第七章生物药物成分的提取纯化技术学习要点掌握几种基本的细胞破碎操作技术掌握超滤分离的操作技术掌握几种常用的沉淀分离操作技术掌握离子交换色谱的操作技术第一部分必备知识生物制药过程中，产物的分离纯化有如下特点：1、生物药物的有效成分在生物材料中浓度很低，有的只达到万分之一，甚至百万分之一，因此，分离操作步骤多，不易获得高收率。2、杂质的含量相对比较高，杂质的种类繁多，各种杂质的形状、大小、分子量和理化性质都各不相同，没有固定的去除方法;3、生产中得到的大多数目的药物都是具有生物活性的物质，对热、酸、碱、重金属及pH变化和各种理化因素都比较敏感，容易变性、钝化或破坏，分离过程中必须十分小心地保护这些化合物的生理活性；4、生物制药的分离钝化的过程中，加工条件（温度、pH、离子强度）对产品质量影响较大。产物的初级分离阶段和纯化精制阶段分离纯化初期，由于粗品中的成分复杂，目的物浓度较低，与目的物理化性质相似的杂质多，所以不宜选择分辨能力较高的纯化技术，采用萃取、沉淀、吸附等一些分辨力低的方法较为有利。精制阶段，可采用高选择性的分离技术，如各种色谱技术、超滤技术等，将目的物与杂质分开，使产物纯度达到要求。第二部分操作技术

第一节细胞破碎技术实践中选择破碎方法的原则是：最佳破碎方法与最佳破碎条件相结合，以达到高的产物释放率；与后面的分离纯化相结合考虑，便于产物的提取；低能耗，降低成本。细胞的破碎方法很多，有物理方法、化学方法、生物方法等。一物理方法反复冻融法：置-15~-20℃冰箱内冻结，再置于室温下，如此反复冻融几次。动物性材料急热骤冷法：投入沸水浴中，在90℃左右几分钟，立即置于冰浴中迅速冷却。细菌及病菌材料超声波破碎法：为防止有效成分的变性，常在冰水或有外部冷却条件的容器中进行。微生物材料碾磨法：为提高碾磨效率，常加入细砂、石英粉或氧化铝等。适宜实验室使用组织捣碎法：为了防止发热和升温过高引起有效成分的变性，通常转10~20s，停10~20s。一般用于动物组织、植物肉质种子、柔嫩的叶芽等高压匀浆破碎法：利用高压迫使细胞悬液高速通过针形阀，通过突然减压和高速冲击特制撞击环，达到细胞破碎的目的。细菌和部分酵母菌细胞高速搅拌珠磨法：将玻璃小珠与细胞悬液一起高速搅拌，带动玻璃小球撞击细胞，使细胞破碎的方法。酵母菌和胶束状微生物菌体二、化学方法酸碱法：用酸或碱处理微生物细胞可以溶解细胞壁使胞内产物溶出。大规模破碎中可与考虑用碱来溶解细胞。表面活性剂处理法：利用表面活性剂处理细胞，可增大细胞壁通透性，使细胞内产物容易释放出来。三、生物学方法自溶法：注意水解酶不仅可以使细胞壁和细胞膜破坏，同时也可能会把某些需要提取的有效成分分解。酶解法：利用酶先将细胞壁分解，再释放内含物。第二节沉淀分离技术应用的分离技术时考虑以下几个因素采用的沉淀技术对目的物的分离有高的选择性；采用的分离条件不会破坏目的物的结构或活性；加入溶液中的沉淀剂容易获得，在后续的加工中容易去除；残留的沉淀剂对人体无害；沉淀剂对环境的污染小，易回收。一、盐析沉淀技术1.盐析操作最常用的是硫酸铵：价格便宜；溶解度大、尤其是在低温时仍有相当高的溶解度；分离效果好；不易引起变性，有稳定蛋白质和酶的作用；废液不污染环境。2.脱盐操作透析时，注意防止透析袋外的液体进入透析袋，引起膨胀。为加快透析速度，应不断的更换透析液，因透析所需时间较长，为防止酶或蛋白质变性，所以最好在低温中进行。透析常用于脱除盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓缩样品等。二、等电点沉淀技术蛋白质、酶、氨基酸、核酸等都是两性电解质，当溶液在某一pH值时，这些生物大分子的所带的正负电荷相等而呈电中性，此时溶液的pH值称为等电点。等电点技术是利用这些生物大分子在其等电点的溶液中，溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分离的方法。三、有机溶剂沉淀技术有机溶剂沉淀技术时在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。四、有机高聚合物沉淀技术有机高聚物沉淀技术是用有机高聚物作沉淀剂。五、结晶技术溶质以固体形式从溶液中分出，析出物为无定形固体时称为沉淀技术，析出物为晶体时则称为结晶技术；它们共同的特征都是溶质从液相中析出，形成固相。第三节萃取分离技术萃取技术是利用目标药物在互不相溶的溶剂之间分配系数不同而得以纯化或浓缩的技术。一、溶剂萃取技术：是利用目的物在两种互不相溶的溶液中的溶解度不同，使其从一种溶液转移到另一种溶液中去，以达到浓缩和提纯的目的。二、双水相萃取技术：将两种不同水溶性的高聚物溶液混合，当高聚物的浓度达到一定值时，体系会自然地分成不相溶的两相，这就是双水相体系。三、超临界萃取技术它以超临界流体作为萃取剂，在超临界状态下，从物料中萃取待分离的组分，然后借助压力、温度的改变使超临界流体变成普通气体，被萃取物质则完全或基本析出，从而达到分离提纯的目的，所以在超临界流体萃取过程是由萃取和分离组合而成的。最为常用的是CO2：临界温度为接近常温，适于分离对热敏感物质；临界压力容易达到；可以渗入原料，提取完全；选择性好；无毒，不易残存在提取物中；化学稳定性高；价格低廉，可以重复使用。超临界为超临界流体，是介于气液之间的一种既非气态又非液态的物态，这种物质只能在其温度和压力超过临界点时才能存在。超临界流体的密度较大，与液体相仿，而它的粘度又较接近于气体。因此超临界流体是一种十分理想的萃取剂。物质是以气、液和固3种形式存在，在不同的压力和温度下可以相的转换。在温度高于某一数值时，任何大的压力均不能使该纯物质由气相转化为液相，此时的温度即被称之为临界温度Tc；而在临界温度下，气体能被液化的最低压力称为临界压力Pc。当物质所处的温度高于临界温度，压力大于临界压力时，该物质处于超临界状态。在压温图中，高于临界温度和临界压力的区域就称为超临界区，如果流体被加热或被压缩至其临界温度（Tc）和临界压力（Pc）以上状态时，向该状态气体加压，气体不会液化，只是密度增大，具有类似液体性质，同时还保留有气体性能，这种状态的流体称为超临界流体。超临界萃取的技术原理超临界CO2流体萃取（SFE）分离过程的原理是利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。在超临界状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。当然，对应各压力范围所得到的萃取物不可能是单一的，但可以控制条件得到最佳比例的混合成分，然后借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体，被萃取物质则完全或基本析出，从而达到分离提纯的目的，所以超临界CO2流体萃取过程是由萃取和分离过程组合而成的。第四节过滤与超过滤技术超滤技术是一种膜分离技术。膜分离技术是在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到部分纯化的技术。超滤技术分为：微孔过滤、超滤和反渗透三种。一、过滤技术过滤技术是指在外力的作用下，悬浮液中的液体通过多孔介质的孔道而固体颗粒被截留下来，从而实现固、液分离的技术。过滤操作所处理的悬浮液称为滤浆，所用的多孔物质称为过滤介质，通过介质孔道的液体称为滤液，被截留的物质称为滤饼或滤渣。二、超滤技术超滤是一种加压膜分离技术，是流体在一定的压力下，经过特制的一定孔径的薄膜时，溶剂、无机盐和小分子溶质可以通过，而大分子物质则被截留，使其在原液中的浓度逐渐提高，从而实现了大小分子间分离、浓缩和纯化的目的。超滤技术具有以下优点：操作简单；速度快，一次处理可完成浓缩和精制工作；操作条件温和；回收率高；对被处理物理的影响小等。第五节

泡沫分离技术泡沫分离技术是根据表面吸附的原理，借助鼓泡使溶液中的目的物聚集在气-液界面，随气泡上浮至溶液主体上方，形成泡沫层，将泡沫和液相主体分开，从而浓缩目的成分的分离技术。泡沫分离技术特别适合于低含量的产品，具有分辨率高、富集率高、运行成本低、操作简便等特点。第六节干燥技术干燥是将潮湿的固体、半固体或浓缩液中的水分蒸发除去的过程，通常是生物活性药物成品化前的最后的加工过程，因此操作的好坏直接影响到产品的质量。一、喷雾干燥技术是将一定浓度的液态物料喷射成极细的雾状液滴，并与一定流速的干燥介质充分接触，在很短时间内雾滴中水分挥发，得到粉状或颗粒制品。其特点是：干燥时间极短，避免产品活性的破坏，适用于热敏性物料的干燥；产品质量好，易溶解；操作控制方便，适于连续化、自动化、大型化生产；在密闭系统中进行干燥，不受污染，产品卫生状况好。二、真空冷冻干燥真空冷冻干燥技术简称冻干技术，此技术是将待干燥物料在低温下冷冻，使其所含的水分结冰，然后在真空环境下加热，让水分由固态升华为气态并移走，使物料得以干燥。（1）预冻过程：速率必须适当。（2）升华过程：物品在真空条件下吸热，冰晶就会升华成水蒸气而从表面逸出。（3）干燥过程：干燥可减少制品冻干后回潮。第七节色谱分离技术文献综述目标物研究进展生物药物制备方案设计线路简介研究目的材料选择细胞破碎建立分析方法预备实验固液分离浓缩色谱分离脱盐冻干产品分析沉降离心过滤机械法、物理法化学法、生物法沉淀、吸附、超滤离心浓缩吸附色谱离子交换色谱凝胶色谱亲和色谱疏水色谱逆流色谱提取溶剂萃取水相萃取溶解性能溶液稳定性固体稳定性物理性质化学性质生物活性、酶活力、比活组成和纯度分析分子量、pI其它理化性质分析透析、凝胶过滤冷冻干燥

一、原材料选择的原则：

原料有效成分含量高、来源丰富、产地较近、杂质含量少、成本低。

生物药物提取、分离、纯化技术基础

生物材料的选择：

1．生物活性物质存在部位：胞内、胞外、胞浆、质膜、器膜、周质

2．生物材料的采集与质控（1）品种鉴定；（2）防止污染与感染；（3）选择富集目的物材料；（4）冷冻保存

二、生物药物常用的提取方法与优化

（一）几种常用提取方法

1．酸、碱、盐水溶液提取方法

2．表面活性剂提取方法与反胶束提取方法

3．有机溶剂提取

4.双水相萃取法

5．超临界萃取法

（二）提取方法与优化

1.溶剂选择

2.选择添加剂①保护剂；②酶抑制剂

3.提取条件①温度；②pH；③盐；④表面活性剂三．浓缩与干燥1.浓缩方法：①盐析；②有机溶剂沉淀；③高分子脱水④超滤；⑤真空浓缩或薄膜浓缩；

2.干燥：①低温真空干燥；②喷雾干燥；③冷冻干燥

四、分离纯化1.生化制药工艺中分离纯化特点:

(1)生物材料组成复杂

(2)目的物含量低

(3)易变性、失活

(4)分离方法有很大经验成分

(5)步骤多，逐级分离

(6)产品验证与化学上纯度概念不完全相同2.分离纯化原理

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(1)根据分子形状与分子大小

(2)根据电荷差异

(3)根据分子极性与溶解度大小

(4)根据吸附特性

(5)根据生物配基特性3.选择原则（1）粗品分离：大处理量,相对低分辨率盐析，分级沉淀，萃取，超滤（2）精制：高分辨率多种色谱层析法,亲和层析，HPLC，FPLC，电泳或等电聚焦五、生物制药下游技术的特点1、培养液（或发酵液）中所含欲分离的生物药物浓度很低，杂质含量高，需进行多步分离操作。2、稳定性较差，加热、pH、有机溶剂等可引起失活或分解。3、生物变异性大4、注意生物安全问题生物药物的分离纯化原则在分离纯化的设计中需要考虑的因素：1、抑制宿主细胞或分泌产物中相应的酶活性，防止其消化降解待提纯产物。2、使目标产物成分有较高的纯度，降低对人体有害的非目标成分的含量。3、保证生物药物的安全、有效。注意每个生产环节的时效性，对每一步骤的质量进行监控。4、尽可能优化分离纯化工艺，减少分离步骤，降低生产成本。生物药物的分离纯化1、溶剂与试剂2、pH3、添加物4、分离纯化前准备分离纯化的基本工艺流程预处理→细胞破碎与碎片处理→可溶性杂质的去除→分离纯化分离纯化单元操作的特点1、各种技术相互交叉，新型的分离纯化方法不断涌现2、注重新材料的研制3、分离纯化设备推陈出新，发展迅速分离纯化方法的选择1、初步分离纯化方法的选择2、多种分离纯化方法交替使用第四部分知识与能力测试1、组织捣碎法如何防止因发热和升温过高引起的有效成分的变性？答：为了防止发热和升温过高引起有效成分的变性，通常转10~20s，停10~20s。2、选择细胞破碎方法的原则是什么？答：最佳破碎方法与最佳破碎条件相结合，以达到高的产物释放率；与后面的分离纯化相结合考虑，便于产物的提取；低能耗，降低成本。细胞的破碎方法很多，有物理方法、化学方法、生物方法等。3、板框过滤的操作由哪几部分组成？答：板框过滤机的操作是间歇的，每个操作循环由装合、过滤、洗涤、卸渣、整理五个阶段组成。4、为什么进行超滤前料液要进行预处理？超滤膜如何清洗？答：超滤法中待处理的溶液如果含有较多的固体杂质、胶体等，这些物质极易黏附和沉淀在膜的表面