霍乱弧菌实验室检测课件

霍乱弧菌的实验室检测

目的:提高检出率,减少漏检以及误判的发生手段:检测人员是否有足够的责任心?检测试剂准备是否齐全且符合要求?是否严格按照检测流程进行操作?

什么是霍乱?

霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌（V．cholerae）引起的急性肠道传染病，发病急、传播速度快、波及范围广、危害严重的甲类传染病。霍乱概述古典生物型小川型Ogawa(AB)O1群稻叶型Inaba(AC)埃尔托生物型彦岛型Hikojim(ABC)霍乱弧菌霍乱病原菌O139群（Bengal）非O1群O2-O200群腹泻病原菌

霍乱的实验室检测

样品的采集和运输不同样品的病原分离流程及技术要点

粪便

水体

水产品，食品等平板分离及可疑菌落挑取菌落鉴定常用快速检测方法

胶体金检测条

荧光PCR检测检测工作中应关注的事项

样品的采集和运输采集：

病例：粪便、肛拭子、呕吐物未使用抗生素之前“健康”人：粪便、肛拭子其他传播环节的标本：食物、水、环境类样品……

监测：水样，水产品等运输：一般要求在3小时内室温（20-25℃）条件下送达实验室检测

C-B运输培养基（pH8.4）;（或文腊二氏保存液）

碱性蛋白胨水（pH8.4-9.2）

：不是最佳的，尤其6小时内还不能进行培养时，尽量采用C-B运输培养基。粪便的采集与保存运送

以采集病人自然排除的新鲜粪便为主，水样便采取1～3mL，成形便采取指甲大小的粪量，亦可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3～5cm处采取，采集后的样品应尽快挑取接种于碱性蛋白胨水（ＰＨ8.６-9.2），同时划线分离选择性培养基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板），如不能在６小时内送达实验室检测的样品，应插入Cary-Blair二氏半固体保存培养基（或文腊二氏保存液）中送检。标本与保存液比例约为1∶5。分离培养要点（两管三板法）：

挑取粪便，直接接种于碱性蛋白胨水（第一管）中，同时划线分离选择性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第一板）。

第一管碱性蛋白胨水在３７℃增菌６－８小时，沾取菌膜下表层液体，划线分离选择性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第二板），同时吸取0.1～0.2ml表层培养物，接种碱性蛋白胨水（第二管）。

第二管碱性蛋白胨水增菌１８小时后划线分离选择性平板（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板，第三板）。

粪便分离流程及技术要点水体的采集与保存运送

水体的采集一般用无菌的500ml水样瓶采集相对静止的表层水(深度为30cm以内)500ml，密封加盖后于室温（20-25℃）3小时内送达实验室检测。分离培养要点（十倍浓缩碱胨水增菌培养法）：

取450ml水样，用1M氢氧化钠调整至pH8.4-9.2。然后加10倍浓缩碱性胨水50ml。再加入1%亚碲酸钾0.25～0.5ml和1000单位/ml青霉素1ml。37℃培养过夜，取菌膜下表层培养物接种选择性培养基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）分离培养，同时吸0.1～0.2ml表层培养物转种于碱性胨水管中作二次增菌，37℃培养6～8h再划线接种于选择性培养基（庆大／四号／ＴＣＢＳ平板）。

水体分离流程及技术要点O1群和O139群抗原构造与血清分型型别群特异性抗原型特异性抗原AO139BC小川+++少量稻叶+—+彦岛+++O139—+——国内商品化的霍乱检测血清国外血清：日本生研，泰国S&A血清等进一步实验氧化酶试验1％盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液粘丝试验0.5％去氧胆酸钠水溶液

生化鉴定

生化鉴定管：发酵葡萄糖、甘露醇、蔗糖、产酸不产气能分解色氨酸赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶（+）精氨酸双水解酶（-）

霍乱弧菌生化鉴定管（11种生化,套装，环凯）；

生化鉴定条：梅里埃API20E鉴定条等全自动生化检测仪检测：梅里埃VITEK2COMP全自动生化鉴定卡等进一步分型鉴定(省CDC进行)

噬菌体分型

PFGE脉冲场分型

进一步实验针对原始样品（如病人粪便）以及初始增菌后的菌液进行快速检测胶体金快速检测卡

O1群霍乱胶体金标记快诊卡

O139群霍乱胶体金标记快诊卡荧光PCR快速检测试剂盒

O1群、O139群双色荧光检测试剂盒

霍乱CTX毒力基因荧光检测试剂盒注：快速检测并不能替代常规检测的进行，只是作为辅助检测的一种手段霍乱快速检测技术的应用

荧光PCR检测霍乱弧菌病例标本检测环境和食品调查的初筛方法O1群、O139群双色荧光检测试剂盒深圳生科源生物技术有限公司O1群和O139群霍乱弧菌的检验程序鉴定分型确诊报告