生化工程实验课件

生化工程实验主讲——陈守文实验一亚硫酸盐法测定容积氧传递系数一、实验目的1、掌握利用亚硫酸盐法测定容积氧传递系数的方法2、了解氧传递在好氧发酵中的重要作用。二、实验原理在正常条件下，亚硫酸根离子的氧化反应非常快，远远大于氧的溶解速度。所以氧一旦溶解于亚硫酸盐溶液中就发生反应，因此液相中溶解氧的浓度为零。此时的氧溶解速度最大。以铜离子为催化剂，亚硫酸钠的氧化反应式为：Na2SO3+1/2O2→Na2SO4反应中剩余的亚硫酸钠与过量的碘作用Na2SO3+I2+H2O→Na2SO4+2HI然后用标准Na2S2O3溶液滴定剩余的碘2Na2S2O3+I2→Na2S4O6+2NaI每消耗1molNa2S2O3必有1/4mol溶氧。三、主要仪器及试材（1）试剂：0.1mol/L硫代硫酸钠溶液淀粉溶液：取1g淀粉放入装有100ml水的烧杯中，煮沸2min，冷却后过滤，水浴锅上加热灭菌。0.05mol/L的碘溶液：取13g碘和25gKI于200ml烧杯中加少许蒸馏水，搅拌至碘全部溶解以后，转入棕色瓶中，加水稀释至1L。塞紧，摇匀后放至过夜，蔽光保存。0.1mol/LCuSO4溶液：作为亚硫酸钠参与反应的催化剂，每升亚硫酸钠溶液中加入1ml0.1mol/LCuSO4。（2）实验仪器：无菌吸管，小型试验设备（发酵罐）2.通过调整发酵罐的装液量（装液量为2.5L、4.5L、6.5L，搅拌转速为300r/min）和不同搅拌转速（搅拌转速为200、300、400r/min，装液量为4.5L），考察不同装液量和搅拌转速对kLa的影响。五、实验注意事项1、实验中滴定所用试剂，0.1mol/lNa2S2O3溶液浓度实验前需标定。2、装料前，必须检查发酵罐的气密性是否良好。3、发酵罐开阀通气，进气和出气阀打开，保持一定通气流量。4、取样时，先将底阀打开，排除取样管里的残留溶液，再取样。六、实验结果处理亚硫酸钠溶液中溶解氧实际的浓度为零

与未通气的自来水空白对照相比，每消耗1mol溶氧可氧化2molNa2SO3，就剩余2molI2，也就额外多消耗4molNa2S2O3。因此，每额外多滴定消耗1molNa2S2O3，就必定通入1/4mol溶氧。耗氧速率的计算OTR=ΔV×M/(4×1000×m×t)(mol.ml-1.min-1)或OTR=ΔV×M×60/(4×m×t)(mol.L-1.h-1)其中：ΔV：通气样与空白样各加等量碘液后滴定Na2S2O3的体积之差（ml）M：Na2S2O3的摩尔浓度（M）m：样液的体积（ml）t：通气时间（min）

OTR=kLaC*=ΔV×M×60/(4×m×t)例设：0.1MPa，25℃条件下，纯水中氧的饱和溶解度为C*=0.21mmol/L。则kLa=60/4/0.21×1000×ΔV×M/(m×t)

=7.14×104×ΔV×M/(m×t)(h-1)序号反应液体积（L）搅拌转速(r/min)反应温度(℃)滴定体积差（Na2S2O3溶液）KLa(h-1)123456七、思考题

1、测定容积氧传递系数除亚硫酸盐法外还有哪些方法？2、在亚硫酸盐法测定过程中，应注意哪些操作步骤？3、思考亚硫酸盐法测定的优缺点？实验二地衣芽胞杆菌热致死动力学一、实验目的1.了解比热死速率常数的测定原理2.掌握灭菌时间评估的基本原理二、实验原理

绝大多数的发酵过程需要在无菌条件下进行，因此要对培养基灭菌，从培养基中杀灭有生活能力的细菌营养体及其孢子。微生物营养细胞的均相热死亡动力学符合化学反应的一级动力学，即积分得式中，N——任一时刻的活细菌浓度（个/L）t——时间（min）——比热死速率常数（min-1）由Arrhenius方程得即ln与1/T呈线性关系培养基灭菌既要杀死杂菌的孢子，又要保持其中的有效成分。由于细菌孢子的死灭反应的△E很高，而某些有效成分热破坏的△E很低，因而将T提高到一定程度会加速细菌孢子的死灭速度，缩短在升高温度下的灭菌时间，升高的温度会加速某些有效成分热破坏速度，但时间的缩短反而降低有效成分的破坏量。所以，高温短时间灭菌，既能快速灭菌，又能有效保存培养基中的有效成分。三、主要仪器及试材

1、实验材料：地衣芽胞杆菌发酵液（E培养基）2、实验试剂：无菌生理盐水，3、实验仪器：250ml摇瓶，吸管，无菌平板，刮铲，水浴锅。四、实验方法与步骤

样品（对数期发酵液）稀释液的准备：将装有4.5ml无菌水的定量管放入水浴锅中预热，待温度稳定后用移液枪快速将混匀的发酵液取0.5ml打入定量管中，并开始计时。将样品稀释液分别在80，90，100℃水浴处理5，10，15，20min，共有样品15个。计时结束后，立即将热处理后的样品（定量管）放入冷水中使其能迅速冷却，摇匀后后做倍比稀释。将上处理过的每个样品继续稀释至10－5和10－6，在10－4至10－6范围内涂平板（菌液200ul），37℃培养1天计数；空白（不做任何温度处理的样品稀释液）对照稀释至10－6

至10－8梯度涂平板，37℃培养1天计数。五、实验注意事项1、在稀释过程中，注意振荡混匀。2、不同灭菌温度处理时小心灼伤，烫伤。六、实验结果处理（1）以受热时间t为x轴，ln(N/N0)为y轴,分别作灭活曲线，直线斜率即为值（受温度影响）。计算。（2）以1/T为x轴，以ln为y轴作－1/T得关系图（T=273+t，单位为K）。作图计算活化能ΔE。温度时间80℃90℃100℃05101520七、思考题1、比较不同温度处理对地衣芽胞杆菌营养体和芽胞的灭活效果？2、分别计算不同温度处理，达到杀死99.9999％的地衣芽胞杆菌营养体和芽胞所需的时间。实验三微生物发酵动力学一、实验目的（1）了解比生长速率测定原理（2）掌握比生长速率测定的操作技能二、实验原理1、微生物分批发酵又称间歇操作，是指培养基灭菌、冷却后，接入微生物菌种维持一定的条件进行发酵。发酵过程中不再加入发酵基质，也不输出产物，待发酵过程完成后才将全部发酵液放出。因为微生物以细胞自我复制的方式繁殖，所以微生物生长速率dx/dt与细胞量或菌浓度x成正比。由速率dx/dt＝μx,推导出比生长速率μ=1/xdx/dt，变型积分得μ（μ为单位菌体量在单位时间内的增加量，h-1）微生物的生长分为延迟期，对数生长期，稳定期，衰亡期。2、浊度法：采用光学方法进行菌体量测定，当白色光通过光孔照射到菌体悬浮液时，会产生光散射和光透射现象，当利用浊度计测定菌体悬浮液的浓度时，通过测定样品的透射光率和散射光率，可确定菌体悬浮液的相对浓度。当光通过菌体悬浮液时，入射光的强度为I，透射光通过厚度为h的悬浮液介质层后的强度为I0，根据Lambert-Bear定律得：式中，τ——浊度（turbidity）ρ——悬浮液中菌体的浓度K——与散射光相关的系数式中，log（I0/I）为吸光度（absorbance），在普通的光电计上将这个值换算成吸光度刻度标出，在微生物培养中称为OD（opticaldensity）值。三、主要仪器及试材

(1)菌种：地衣芽胞杆菌(Bacillus

licheniformis)(2)培养基：斜面和平板培养基LB（Ｗ／Ｖ）：酵母抽提物0.5%,蛋白胨1%,NaCl1%,琼脂2.5%灭菌前调节pH7.2-7.4。E培养基（Ｗ／Ｖ）：葡萄糖20，L-谷氨酸钠25，柠檬酸钠15，NH4Cl7g,KH2PO40.5g,MgSO47H2O0.5g,CaCl22H2O0.15g,MnSO42H2O0.104g,灭菌前调节pH值7.2-7.5（葡萄糖分开灭菌）。（3）实验器材:500mL三角瓶，培养箱，722分光光度计等。四、实验方法与步骤

（1）活化菌种：在斜面保藏培养基上接种后，37℃培养2d以上，然后放置在4℃冰箱，保存备用。（2）摇瓶培养配制E培养基，在500ml三角瓶中分装50ml适量的培养液，共配制9瓶，用八层纱布包扎瓶口，115℃，20min(葡萄糖分开灭菌）灭菌，待降至室温后，从斜面上挑一环菌直接接种，置于摇床，37℃，200r/min培养，培养4h开始取样,每隔1h取样一次，每次取样10ml，测定样品的OD值，重复操作，直至前后两次OD值相同时，停止实验。（3）样品OD值测定（比浊法）：取发酵液离心（8000rpm，5min），弃上清，蒸馏水洗涤菌体，离心，再次弃上清，注意用蒸馏水恢复原体积。稀释菌体悬液，利用分光光度计比色。比色方法：把比色计的波长调整至600nm，开机预热10～15min，在比色杯中用蒸馏水进行零点校正。测定菌体悬液的吸光值，所测定吸光度刻度为OD值（通过调整稀释倍数，一般控制OD值在0.2～0.7之间），作吸收曲线，记录结果。五、实验注意事项

1、分光光度计需要开机预热10～15min，每次测定前必须调整在比色杯中用蒸馏水进行零点校正。2、测定OD值与标准曲线的制作时，应注意如菌体、培养条件、测定条件（分光光度计，波长等）的一致，为保证K值一定，还应注意采用同一稀释液稀释。3、测定微生物的OD值一般控制在0.2～0