中鉴相思子中滨蓟成分提取工艺及其

构的或而使用过的材料。我承诺，（设计）中的所有内容均真实。（设计）作者（签名 I-II前 仪器与试 仪 试剂与材 样品测定和计算方法及方法学溶液的测定方 计算方 方法学相思子中滨蓟黄苷提取工 单因素响应面 相思子中不同部位滨蓟黄苷含量及其动态变 溶液的样品含量测定及其结 相思子滨蓟黄苷含量动态变 6和结 参考文 综 致 附 ：目的（叶（分含量动态变化的分析，为相思子用药部位及质量评价提供基础和依据。方法含量，分析相思子不同部位以及不同时期的叶的滨蓟黄苷成分动态变化。结果50%40:130min2结论：相思子；滨蓟黄苷；动态变化；高效液相色谱StudyontheExtractionProcessandtheContentDynamicChangesofCirsimarininAbrusprecatoriusL.:ObjectiveInordertoestablishtheoptimumprocessingconditionsofcirsimarinextractionfromAbrusprecatoriusL.andyzethedynamicchangesofcirsimarinindifferentparts(roots,stems,andleaves)ofAbrusprecatoriusL.,thisexperimentemployedHPLCtodeterminethecirsimarincontentindifferentpartsofAbrusprecatoriusL.,andinitsleaves(youngleaves,tinyleaves,bigleaves,yellowleaves)atdifferenttimes,providingthebasisandfoundationsformedicationsiteandqualityevaluationofAbrusprecatoriusL..MethodsTherefluxmethodwasusedtoextractdifferentpartsofAbrusprecatoriusL.anditsleavesatdifferenttimes.Singlefactormethodwasappliedtodeterminetheeffectoffourvariables:Ethanolconcentration,solid-liquidratio,extractiontime,andextractiontimesoncirsimarinextraction.Responsesurfacemethodology(RSM)wasemployedtooptimizetheextractionparameters.HPLCwasusedtodeterminethecirsimarincontentinAbrusprecatoriusL.andyzethedynamicchangesofcirsimarincontentindifferentpartsofAbrusprecatoriusL.anditsleavesatdifferenttimes.ResultsTheresultsrevealedthattheoptimumprocessingconditionsofcirsimarinextractionfromAbrusprecatoriusL.wereasfollows:ethanolconcentration50%,solid-liquidratio1:40,extractiontime30min,andextractiontimes2.ThedynamicchangesofthecirsimarinindifferentpartsofAbrusprecatoriusL.wereasfollows:bigleaves>tinyleaves>yellowleaves>youngleaves>roots>stems,inwhichthedifferencebetweenrootsandstemswassmallandnotsignificant,whilethecirsimarininleaveswasfarmorethanthatinrootsandstems.ConclusionTheextractionmethodissimpleandquick.Theresultisaccurate,reliableandreproducible,anditcanbeusedtoextractthecirsimarinfromAbrusprecatoriusL..ThecontentofcirsimarinintheleavesofAbrusprecatoriusL.ismuchhigherthanthatofrootsandstems.Therefore,whenthecontentofcirsimarinisprimarystudied,itissuggestedtopickorchoosetheleavesofAbrusprecatoriusL.asexperimentalanddrugsites.Keywords:AbrusprecatoriusL.;cirsimarin;dynamicchanges;（（相思子用药部位及质量评价提供基础和依据，为相思子中滨蓟黄苷成分的研究提供参考。，—，—恒科学仪器司）、滨蓟黄苷对照品（，HPLC测定，含量以峰面积百分比计算为99%）、超纯（怡宝饮料中国）材料：相思子根、茎、叶（ 学药圃采摘）942mg/L2.0g50%60mL50mL0.22μm分别精密吸取提取液各10μL，置高效液相色谱仪进定。由文献[8]可知，色谱HypersilBDSC18色谱柱（4.6mm×150mm，5μm），流动相：甲醇（A）1.0mL·min-1。计算含量。由文献[8]可知，滨蓟黄苷的回归方：Y=1933.4X+57.897（r=为峰面积，X为进样量/μg）3.110μL3.2项下色800003-1。3-1滨蓟黄苷对照品(A)和相思子叶供试品(B)的精密度10μL3.26次，测得滨蓟黄苷峰面积RSD0.28%3-1。3-11 平均 峰面 稳定性精密吸取供试品溶液进样10μL，分别于0，2，4，6，8，12，24h3.2项下色谱3-2。3-2024681224重复性18.75mg/g，测得滨蓟黄苷峰面积RSD2.61%3-3。3-3123456加样回收率试取同一批已知含量(18.75mg/g)0.25g6加入3.1.1项下滨蓟黄苷对照品溶液适量，按3.1.2项下方法分别供试品溶液，精密10μL99.53%和RSD0.90%，证明该方法可行。3-4。3-4取样量样品含量对照品加入量测得量回收率平均回收率乙醇浓52.0g30:10%30%50%、70%、95%30min250mL3.23.3的方4-1乙醇浓度0含量4-14-14-1可以看出随着乙醇浓度的提高，滨蓟黄苷含量逐渐增加，在乙醇30%30%左右时，10%～50%。50:1、60:150%30min2次。提取液经棉花50mL3.23.3的方4-2含量4-24-24-2可以看出随着液料比的增加，滨蓟黄苷含量略微增加，但是整体20:1～40:1。提取时52.0g30:150%乙30min、45min、60min、75min、90min2次。50mL3.2的方法测定，3.34-3提取时间含量4-3由表4-34-3可以看出随着提取时间的延滨蓟黄苷含量逐渐增加45min45min30～60min。提取次取同一批次相思子叶5份，各2.0g，精密称定，分别加入液料比为30:150%乙30min1、2、3、4次。提取液经棉花过滤后，50mL3.23.3的方法计算滨4-4 含量 4-44-44-4121～3次。4-5。4-5X1乙醇浓度X2X3提取时间X4提取次数/-10213响应面试根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理，以滨蓟黄苷含量(Y)432924个为析因试验，52910μL3.2的方法测定，并3.34-6。4-6乙醇浓度提取时间1-0-021010310-0401-050-0-6-10071-008001-90000-010-00-1100100000-10110000110-01--0000000000-00101010--00000-0100000100-0110采用响应面对表4-2-2中29个滨蓟黄苷含量数据进行线性回归拟合得到滨蓟黄苷含量（Y）对上述4 个因素的二次多项回归方：004X1X3+0.064125X1X4-3.50000E-003X2X3-0.050750X2X4-0.023500X3X4-2.77042E-2+1.08083E-003X22-8.41852E-004X32-2.28067X42。对该回归模型进行方差分析，结果4-度FP111111111111114-4-7（P＜0.0说明各因素与响应值之间的关系（P＞0.05模型的校正复相关系数R20.5382信噪比5.533＞4说明回方程拟合度和度均较高所以本响面试验所得的二次回归方程能较好地对响应值进行。响应曲面的分4-5。滨蓟黄苷提取量滨蓟黄苷提取量滨蓟黄苷提取量滨蓟黄苷提取量

液料

乙醇浓度

提取时间

乙醇浓度 提取次数(次乙醇浓度滨蓟黄苷提取量滨蓟黄苷提取量滨蓟黄苷提取量滨蓟黄苷提取量

提取时间

液料 提取次数(次液料滨蓟黄苷提取量滨蓟黄苷提取量滨蓟黄苷提取量滨蓟黄苷提取量

提取次数(次

提取时间E.液料比和提取次 F.提取时间和提取次4-5C中两因素交互作用DEBF中两因素交互作用不算显著。由响应面design-expert8.0.6进行分析，模拟得到相思子中滨蓟黄苷成分的最佳提取工艺为：乙醇浓度48.47%，液料比40:1，提取时间30min，提取次数2.53次。最佳方案中的滨蓟黄苷含量为22.13mg/g。结合实际情况，将最佳提取工艺确定为：50%40:130min2次。4-8平均含量123结果表明，实际中的滨蓟黄苷含量（平均值：19.34mg/g）取滨蓟黄苷对照品适量，精密称定，加乙醇溶解，制成942mg/L62.0g，精密称定，4.2.5中的滨蓟黄苷最佳提取工艺方案（50%40:1，提取时间30min2次）进行提取，提取液经棉花过滤后，置旋转蒸发仪浓缩至适量，50mL5-1。高效液相色谱图见附录。5-1样品名 嫩 小 大 黄 5.25-15-2。5-15-25-2可以较为直观地看出，随着相思子植物的生长（根-茎-叶），其中的滨蓟苷成分含量会逐渐增加；而随着相思子叶子的衰叶-黄叶），其中的滨蓟黄苷成6和结本课题实验首先通过单因素实验不同乙醇浓（0%30%50%70%95%）90min）、提取次数（1、2、3、4次）对提取效果的影响，为后续的响应面试验提供科10%～50%、最佳液料比范围确定为20:1～40:130～60min1～3次。通过单因素，为后续的实验提供较为科学且合理的范围，既明确了实验方向，根据前期的单因素实验的结果，由响应面Design-Expert8.0.6进行分析，模拟得到相思子中滨蓟黄苷成分的最佳提取工艺参数为：乙醇浓度48.47%，液料比40:1，提取时间30min，提取次数2.53次。最佳方案中的滨蓟黄苷含量为22.13mg/g。结50%40:1302次。响应面设计方法利用合理的试验设计方法，并通过试验得到一定数据，来，可以让凭借对响应曲面3D图的直接观察来选择实验设计中的最优化条件。而且在分析工具地选择上，使用响应面Design-Expert进行实验分析，它简单、直接、易操作，功能非常明确，为设计试验（design）、回归分析（ysis）、优化的滨蓟黄苷成分的最佳提取工艺参数。最佳提取工艺方案为：乙醇浓度50%，液料比[M]李春阳，张平，．HPLC测定相思子叶中滨蓟黄苷含量[J]．中国实验方剂学DaMJ,JungHA,ChoiJS.ComparativeantioxidantactivityandHPLCprofilesofsomeselectedKoreanthistles[J].ArchivesofPharmacalResearch,2008,31(1):28.HasratJA,BruyneTD,BackerJPD,etal.CirsimarinandCirsimaritin,FlavonoidsofMicroteadebilis(Phytolaccaceae)withAdenosineAntagonisticPropertiesinRats:LeadsforNewTherapeuticsinAcuteRenalFailure[J].JournalofPharmacy&Pharmacology,1997,相思子研究概豆科（Leguminosae）相思子属（AbrusAdans.）12种，中国有其中4种，即广州相思子（AbruscantoniensisHance）、思子（AbrusmollisHance）、美丽相思子（AbruspulcusWall）、相思子（AbrusprecatoriusL.）[1]。而本综述将对近年来相思子（AbrusprecatoriusL.）的相关研究和报导进行整理和综述，主要针对其、、相思子生长于丘陵地或山间、路旁灌丛中，常栽培于村边。分布福建、5～73.5～4.52/3处为朱红色，另一端为黑色，种脐凹陷，椭圆形类白色，位于黑色处的侧面。质坚硬，浸泡后除去种皮可见黄2枚，肥厚。具青草气，味微苦涩[4]。、、11厘米;8～20对，具乔短柄；小叶片长圆5～203～8毫米，先端钝圆，具细尖，基部圆形或阔绿色，钟形，长约3毫米，先端有4个短齿，外侧被毛;花冠蝶形，旗瓣阔卵形，基部有三角形的爪；9，成1束；子房上位，阔线形，被毛，花柱短，柱头具细。荚2～4.5厘米，先端有弯曲的喙，表面密被菌、抗炎、抗肿瘤等方面具有良好的生物活性，在、和食品方面均有应用，一直备受国内外关注[5]2,8-二羟基-3,4,9,10-四甲氧基紫檀素。N-9-甲基-β-咔啉(1)、异喹啉酮(2)、吲哚-3-羧酸(3)、2,3-二甲李春阳等[8]对相思子(AbrusprecatoriusL.)叶进行成分分离和鉴别。方法利用溶剂提取法、萃取法和柱层析法对相思子叶化学成分进行分离,经理化性质和NMR、HRMS、HPLC-DAD等方法测定，分析并鉴定其结构。结果从相思子叶中分离并鉴别出5个化合物分别为β-谷甾醇(Ⅰ)滨蓟黄苷(Ⅱ)滨蓟(Ⅲ)相思子碱(Ⅳ)下箴刺桐碱(Ⅴ)。Ragasa等[9]从相思子中分离出豆甾醇(stigmasterol)、β-谷甾醇(β-sitosterol)的混黄[10]利用全自动氨基酸分析仪和高效液相色谱仪分析比较相思子属三种药材172冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸和赖氨酸的含量相对较高。罗胜军等[11]采用硫酸铵沉淀法、辛酸-硫酸铵法和硫酸铵-A亲和层析法三种方PAGE化后单抗的回收率以硫酸铵沉淀法及辛酸-硫酸铵法较高，硫酸铵-A亲和层析法较低；产物纯度以硫酸铵-A亲和层析法和辛酸-硫酸铵法较高，硫酸铵沉淀法较差；了研究。首先相思子凝集素粗提物，后通过酸化Sepharose4B柱层析，半乳糖梯DEAE-SepharoseFF柱层析获得纯度较高的相Sepharose4BSepharose4B亲和层析中采DEAE-SepharoseFF离子交换介质获得纯度较高的凝集素，凝集素粗提物的0.97﹪，经过酸化Sepharose4BDEAE-SepharoseFF层析，获得的凝0.38﹪，50﹪。惠等[13]建立相思子毒素（abrin）的酶联免疫检测方法，为abrin临床、中毒治疗、法医学鉴定等应用领域提供技术基础和参考依据。采抗体夹心ELISA法来检测微量abrin。该法检测abrin线性范围为0.25～125μg/L，线性回归方Y=0.51015X+0.4153（r0.9880n10，P＜0.0001），0.25μg/L。不同浓度蓖麻毒素（ricin）、葡萄球菌肠毒素B（SEB）对检测结果基本无干扰。该法能用于abrin毒素污染水样、土样、食品、血液等模拟样品的分析，相对标准差为3.52%～4.86%，来，提高检测的灵敏度和特异性，可适用于各种微量abrin样品的分析。张[14]建立了相思子叶中滨蓟含量的HPLC测定方法。方法色谱条件为：采HypersilBDSC18（4.6mm×150mm,5μm），流动相为甲醇（A）-0.2%甲酸水溶液（B），330nm1.0Y=241.91X+19.264，r=0.999399.37%（RSD=1.37%）。李春阳等[15]HPLC测定方法。方法色谱条件为：采用高效液相色谱法，HypersilBDSC18色谱柱（4.6mm×150mm，5μm），流动相甲nm1.0mL·min-10.327～3.27μg与其峰面积呈良好的线性关系线性回归方Y=1933.4X＋57.897，r=0.9995，平均加样回收率为99.46%（RSD=1.78%）黄[10]利用全自动氨基酸分析仪和高效液相色谱仪分析比较相思子中氨基酸成分及含量。肝炎，慢性支气管炎，痈疮，感冒发烧，疥癣，湿疹，，[2]。冯娴婧等[16]提低CCl4和异硫酸萘酯所致肝损伤小鼠中转氨酶活性及胆红素含量。陈红霞等[18]分别以CCl4、AP和D-GalN诱导小鼠急性肝损伤为模型，检测其丙转氨酶肽(GSH)和谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)XSTF对急性化学性肝损伤的影响。XSTFCCl4、AP及D-GalNAST、ALT活性，并呈现明显的量效关系；XSTFSOD、GSHGSH-PX含量，并显著降低MDA含量(P＜0.05)。得出了结论：相思藤总黄酮对小鼠急性化学性肝损伤具有Georgewill等［19］Anam［20］认为相思子叶部分提取物对巴豆油致大鼠耳部炎症具候选毒一。Anbu等［22］认为相思子石油醚提取物对艾氏腹水癌(EAC)肿瘤模型小白鼠肿瘤细胞具有抑制作用。秦等[23]通过MTT法观察相思子蛋白P2对B16细B16细胞周期和细胞凋亡的影响，JC-1染色法10B16移植性肿瘤生长的抑制作用。提出相思子蛋白P2于体内外均可显著抑制B16细胞的生长，此作用与肿瘤细胞增殖周期，降低线粒体膜电位,诱导细胞凋亡有关。秦等[24]通过体外实验：MTT法检测相思子P2HepG2HepG2细胞周期和TRAP-SYBR-Green染色法检测相思子蛋白P2P25075100μg·kg-110d2[25]rin可通过多种途径抑制肿瘤细胞增殖或诱导其凋亡而且还可以激活淋细胞自然细胞等多种免疫细胞过增加机体免疫功能，发挥杀灭肿瘤细胞的作用。orgl等[26]研究相思子叶提取物对四氧嘧啶所致大鼠的血糖水平的影响，发现口服给药14天后，大鼠血糖水有所下降。相思子主要毒性成分为相思子毒蛋白，其LD100为0.55μg·kg-1，比粗毒蛋白(LD100=10μg·kg-1)毒性高18倍以上[30]。Adedapo等[31]给予雄性大鼠不同剂量的相思子中国植物志编辑．中国植物志第40卷[M]．：科学[M]ofIntegrativePlantBiology，1998，40(8)：734-739．RAGASACY,LORENAGS,MandiaEH,etal.ChemicalconstituentsofAbrusprecatorius[J].AmJEssentOilsNatProd,2013,1(2):7-10.[J]2010，，，张瑞华，等．相思子凝集素的分离提取及抗癌活性研究[C]中医惠，童朝阳，郝兰群，等．双抗体夹心ELISA法检测相思子毒素[J]．细胞与，，[J]201330(6)：GeorgewillOA,GeorgewillUO.Evaluationoftheanti-inflammatoryactivityofextractofAbrusprecatorius[J].EasternJournalofMedicine,2009,14(1):23-25.AnamEM.Anti-inflammatoryactivityofcompoundsisolatedfromtheaerialpartsAbrusprecatorius(Fabaceae).[J].Phytomedicine,2001,8(8):24-AnbuJ,RavichandiranV,SumithraM,etal.Anticanceractivityofpetroleumether