土壤水解酶测定方法

土壤酶测定方法——荧光微型板酶检测技术（microplatefluorimetricassay）（一）所测酶类：（纤维素、淀粉、半纤维素：①α-Glucosidase a-葡萄苷酶②β-Glucosidase b-葡萄苷酶（E.C.1）③β-Cellobiosidase β-纤维二糖苷酶④β-Xylosidase β-木糖苷酶（E.C.7）⑤-cty-gucosmdse （几丁质酶（..3.2..52）有机氮分解酶类（蛋白质、尿素：⑥Aminopeptidases leucine-aminopeptidase（蛋白酶之一）（E.C.3.4.11.X）⑦尿酶有机磷分解酶类：⑧Phosphatase 磷酸酶（E.C.and）有机硫分解酶类：⑨Sulfatase E.C.氧化还原酶类：⑩Peroxidase （加双氧水）⑪phenol oxidase 酚氧化酶（二）500ml个移液器3.排枪（10-100ul,30-300υL）磁力搅拌器96孔微型板（黒、白板）ｖ型槽7.酶标仪标准底物：4-methylumbelliferone(MUB)7-amino-4-methylcoumarin(AMC)荧光底物:4-MUB-phosphate4-MUB-sulfatepotassiumsalt4-MUB-β-D-glucoside4-MUB-β-D-cellobioside4-MUB-N-acetyl-β-D-glucosaminide4-MUB-β-D-xyloside-D-glucosideL-Leucine-7-amino-4-methylcoumarin非荧光底物：L-dopa（三）试剂准备2L8.003g无水醋酸钠溶液加水1L，用醋酸调pH到土壤pH，再定容到2L。2mM（10×）mg14-MUB-phosphate2.56水24-MUB-sulfatepotassiumsalt2.9434-MUB-β-D-glucoside3.38水44-MUB-β-D-cellobioside5.00水54-MUB-N-acetyl-β-D-glucosaminide3.791mlDMF二甲基甲酰胺+水64-MUB-β-D-xyloside3.08水74-MUB-α-D-glucoside3.381ml吡啶+水8L-Leucine-7-amido-4-methylcoumarin3.251ml乙醇+水水使用时取1.6mL稀释10倍形成200uM底物溶液16mL。（备注：除水以外的溶解剂在最后体系中浓度不超过3%）5mLmg4-methylumbelliferone(MUB)1.761ml乙醇+水7-amino-4-methylcoumarin(AMC)1.751ml丙酮+水使用时，各取80uL稀释到16mL３.5mL浓度为250mM的L-DOPA溶液（10×）0.24649gL-DOPA溶入5ｍＬ水。使用时3ml稀释10陪形成25mM的Ｌ－ＤＯＰＡ溶液３０ｍＬ。４.6mL0.3%双氧水（现配）60uL30%的双氧水+5940uL的水。５.浓度为4M(10×)尿素底物5mL1.2012g尿素溶入5mL水使用时取1.2mL稀释10陪形成200ｍＭ的尿素溶液１２ｍＬ步骤１.板编号。２.缓冲液准备好。３.先将缓冲液加入微型版中。４.6个烧杯一组，1g鲜土加100mL缓冲液。５.按顺序加入待测液。６.标准溶液配好，加入标准溶液。７.底物溶液配好，迅速加入底物溶液。８.黑板在25度培养4h后上机测定，excitationwavelength:365,emissionwavelength:460９.氧化还原酶白板在25度培养20个小时，上机测定，absorbancewavelength:450（三）上机操作仪器：ThermoioskanFlash１.提前开机预热30min２.程序—ok—newsession—sessionname:_--next—next—finish—wizard—no.ofunknows:,设定总孔数—addandclose—protocol wavelength:365,emissionwavelength:460—save—connect—run—ok３.数据保存，dataprocessing—report/export—全选—add—fluorometricl—format—list—全选—ok—report—save.4-MUB-phosphate

4-MUB-sulfate

4-MUB-β-D-glucoside

4-MUB-β-D-cellobioside第一排1 2 3 4 5 6 7 8

9 10

11 12

4-MUB-N-acetyl-β-D-glucosaminide

4-MUB-β-D-xyloside

4-MUB-α-D-glucoside

第二排13第三 待加排25第四 待加排31第五 缓加缓加排 缓加缓 34

14 15MUB26 2732 33

16 17 18AMC28 29 30

19 20

21 22

23 24第一步 200ul缓 缓加（34号板1-8列缓加标号板9-10列缓加（37号板11列）第二步 50ul缓 缓加缓（37号板第11列），待加缓（第四行全部）第三步 200ul待36个样 待加底，待加标，待加缓（一二三四行，每三块板36个样）第四步 50ul标 缓加标（MUB，AMC，34号板9-10列），待加标（MUB,AMC第三行全部）第五步 50ul底 8个底物

缓加底（34号板1-8列），待加底（第一，二行每种酶三块板）L-DOPA

L-DOPA+0.双氧K 尿奔待加底

1 2 3

基 5

。

恃加底

p1逞

15 _. 1G 待加缓7线爰戎］陌爰纶爰戌］日厅臣

8: 9

:10

,, 11

12.

特 加标12

1了J> 18

1||13||持加峡

0. 21

2'2但一步 I

2oou:1缓 厂| 缓加缓 (13号

第1列），缓加底(13号板第2, 3列）

2.3第一步 200ul缓f|缓加底

24 25(13号板第·4—列-）I第二步 50ul绥 绥加绥(13号板第1列），待加线（第二行全部）笫三步 200ul待 待加底，特 加级（每种醇加两列）

第二步 50ul绥 待加绥（第四行全部）笫三步 200ul待 待加底，待加标1．待加标2·待加缓（尿酶加4列）第四步第五步

50ul底10ulb.3%H202

待加底（第一行全部）16-21号板全部13号板第3列t

第四步第五步18

Iu1l21待3（4部标2备注 绥：50诅的醋酸钠缓冲液

|待加底：assay

第六步 sal.y勹二 尿亲全部，13号板第哼le4.0u1_|待：lg土l.水土垣悬浊液

1待力日绥：soilcon-t:rol

怎 底25L

1绥加底：

negat1ve control

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134lt-： blankt-

备注三|t