双缩脲法测定蛋白质含量

仅供个人参考实验二十蛋白质含测定——双缩脲法测定蛋白质含量一、实验目的学习和掌握用双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法。二、实验原理在碱性溶液中，双缩脲(H2N-CO-NH-CO-NH2)与二价铜离子作用形成紫红色的络合物，这一反应称双缩脲反应。凡分子中含二个或二个以上酰胺基

(—CO-NH2)或与此相似的基团[如—CH2-NH2—CS-NH2—C(NH)NH2]的任何化合物无论这类基团直接相连还是通过一个碳或氮原子间接相连均可发生上述反应。蛋白质分子含有众多肽键(—CO-NH—)，可发生双缩脲反应，且呈色强度在一定浓度范围内与肽键数量即与蛋白质含量成正比用比色法测定蛋白含量。测定范围为1～蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速同的蛋白质产生颜色的深浅相近及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差因此双缩脲法常用于快速但并不需要十分精确的蛋白质测定。三、实验试剂和器材[剂]1．双缩脲剂：取·和酒石酸钾钠(c.P.)6.0g以少量蒸馏水溶解，再加LNaOH溶液，KI1.0g然后加水至。棕色瓶中避光保存。长期放置后若有暗红色沉淀出现，即不能使用。2．标准蛋质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA或标准酪蛋白，配制成标准蛋白溶液，可浓1g/L的为0.66校正其纯度如有需要标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用或配制，酪蛋白用0.05mol/LNaOH配制。[材]1．试管：15×试管只；2．5ml液管；不得用于商业用途

仅供个人参考3．坐标纸4．721分光光度计。四、实验操作取试管7，编号，按下表操作：试剂(ml)\空白管1

3

4

5

测定管管号准-

0.3

0.4

0.5

–10g/L）生理盐水待测样品---双缩脲试

0.2-3.0

0.1-3.0

--3.0

0.40.13.0剂相当蛋白01020

30

40

50

-质（g/L）混匀，37水浴分钟，冷却至室温，在分光光度计波540nm处，用空白管调零，读取各管吸光度值。1～5为标准曲线管，测得吸光度后，以吸光度为纵坐标蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线以测定管的吸光度在标准曲线上求得蛋白质浓度。[意事项]1．双缩脲剂中，加入酒石酸钾钠，Cu2+形成稳定的络合铜离子，以防止不稳定形成Cu(OH)2沉。酒石酸钾钠与5H20之比不低于∶1，加KI作为抗氧化试剂。2．双缩脲剂要封闭贮存，防止吸收空气中的二氧化碳。3．本法各蛋白质的显色程度基本相同，重复性好，几乎不受温度影响，唯一缺点是灵敏度较低。4．黄疸血、严重溶血对本法有明显干扰。[考题]1缩脲法测定蛋白质的原理是什么?其它还有什么方法测定蛋白质的含量?2．请用双脲法，设计一个测定蛋白质含量的定量方法除标准曲线法外)。不得用于商业用途

仅供个人参考仅供个用学习、究不得用商业用。Forpersonaluseonlyinstudyandresearch;notforcommercialuse.NurfürdenpersönlichenfürStudien,Forschung,zukommerziellenZweckenverwendetwerden.Pourl'étudeetrechercheuniquementàdesfinspersonnelles;pasàdesfinscommerciales.толькдлялюдей,которыеиспользуются