重组人干扰素α1b制造及检定规程幻灯片

重组人干扰素α1b制造及检定规程RequirementsforRecombinantHumanInterferonα1b

1定义、组成及用途

本品系将带有人干扰素α1b基因重组质粒，转化大肠杆菌，使其高效表达人干扰素α1b，经高度纯化后加入适量人白蛋白稳定剂冻干制成。用于治疗慢性乙型肝炎、丙型肝炎和毛细胞白血病等疾病。2制造

2.1基本要求2.1.1设施与生产质量管理按中国《药品生产质量管理规范》要求实施。2.1.2原料及辅料应符合现行《中国药典》或《中国生物制品主要原辅材料质控标准》的要求。未纳入上述标准的化学试剂，应不低于化学纯。2.1.3生产用水生产用水源水应符合国家饮用水标准；纯化水及注射用水应符合现行《中国药典》标准。2.1.4生产用器具直接用于生产的金属或玻璃等器具，应经过严格清洗及去热原质处理或灭菌处理。2.2工程菌菌种2.2.1工程菌菌种名称及来源重组人干扰素α1b工程菌株系由人干扰素α1b基因的重组质粒转化的大肠杆菌菌株。生产用工程菌株需经国家药品管理当局批准。2.2.2种子批建立、传代及保存从原始种子批传代、扩增后用适当方法保存，作为主种子批；从主种子批传代、扩增后用适当方法保存作为工作种子批。2.2.3菌种检定主种子批和工作种子批的菌种应进行以下各项全面检定。2.2.3.1划种LB琼脂平板应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长。2.2.3.2涂片革兰氏染色在光学显微镜下观察，应为典型的革兰氏阴性杆菌。2.2.3.3对抗生素的抗性应与原始菌种相符。 2.2.3.4电镜检查应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染。2.2.3.5生化反应应符合大肠杆菌生物学性状。2.2.3.6干扰素表达量在摇床中培养，应不低于原始菌种的表达量。2.2.3.7表达的干扰素型别应用抗α型干扰素参考血清作中和试验，证明型别无误。2.2.3.8质粒检查该质粒的酶切图谱应与原始重组质粒相符。2.4原液检定按3.1项进行。2.5半成品配制与分批2.5.1配制与除菌2.5.1.1稀释液配制按国家药品管理当局批准的配方配制稀释液。配制后应立即用于稀释。2.5.1.2稀释与除菌将检定合格的加白蛋白干扰素原液用2.5.1.1项稀释液稀释至所需浓度，用0.22µm滤膜过滤除菌，即为半成品，保存于2～8ºC。2.5.2分批按本版规程通则《生物制品分批规程》进行。2.6半成品检定按3.2项进行。2.7分装及冻干按本版规程通则《生物制品分装规程》进行。2.8规格应为国家药品管理当局批准的规格。2.9包装按本版规程通则《生物制品包装规程》进行。3检定

3.1.1效价测定方法见附录。用国家标准品校准确定效价(IU)。3.1.2蛋白质含量用Lowry法测定。3.1.3比活性应不低于1.0×107IU/mg蛋白。3.1.4纯度3.1.4.1电泳法用非还原型SDS法。加样量应不低于5µg(银染法)或10µg(考马氏亮蓝R-250染色法)。经扫描仪扫描，纯度应不低于95.0%。3.1.4.2高效液相色谱法用波长280nm检测，应呈一个吸收峰，或主峰应不低于总面积的95.0%。3.1.5分子量用还原型SDS法。加样量应不低于1µg，制品的分子量应为19.4KD±10%。3.1.6外源性DNA残留量用固相斑点杂交法，以地高辛标记的核酸探针法或经国家药品检定机构认可的其他敏感方法测定。其含量应不高于10ng/剂量。3.1.7IgG残留量如采用单克隆抗体亲和层析法纯化，应进行本项检定。采用双抗体夹心酶联免疫法测定。IgG含量应不高于100ng/剂量。3.1.8宿主菌蛋白残留量用酶联免疫法测定。宿主菌蛋白残留量应不高于总蛋白质的0.1%。3.1.9残余抗生素活性不应有残余氨苄青霉素活性。3.1.10细菌内毒素含量按本版规程通则《生物制品细菌内毒素试验规程》测定。细菌内毒素含量应不高于10EU/30万IU。3.1.11等电点为4.0~6.5，批与批之间等电点应一致。3.1.12紫外光谱扫描最大吸收峰波长应为278nm士3nm，批与批之间应一致。3.1.13肽图(至少每半年测定1次)应符合干扰素α1b的图形，或与对照品图形一致。3.1.14N-末端氨基酸序列(至少每年测定1次)用氨基酸序列分析仪测定。其N-末端序列应为:Cys-Asp-Leu-Pro-Glu-Thr-His-Ser-Leu-Asp-Asn-Arg-Arg-Thr-Leu。3.2半成品检定3.2.1细菌内毒素含量按3.1.10项进行。3.2.2无菌试验按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行。3.3成品检定3.3.1鉴别试验用中和试验法，其抗病毒活性能被抗α1b型干扰素血清中和。或用免疫印染法，应为阳性。3.3.2外观应为白色薄壳状疏松体。加入1ml蒸馏水后应迅速溶解为澄明液体，不得含有肉眼可见的不溶物。3.3.3化学检定按本版规程附录《生物制品化学及其他检定方法》进行。3.3.3.1pH值为6.5～7.5。3.3.3.2水分应不高于3.0%。3.3.4效价测定方法见附录，用国家标准品校准确定效价(IU)。效价应为标示量的80%～150%。3.3.5无菌试验按本版规程通则《生物制品无菌试验规程》A项进行。3.3.6异常毒性试验按本版规程通则《生物制品异常毒性试验规程》小鼠试验项进行。3.3.7热原质试验按本版规程通则《生物制品热原质试验规程》进行。家兔每lkg体重注射剂量为2万IU；如单支剂量超过30万IU，则注射剂量按每支制品标示量的3倍除以60计算。4保存、运输及有效期于2～8ºC避光保存和运输。自冻干完成之日起有效期为2年6个月。5使用说明按本版规程通则《生物制品包装规程》中有关规定编写。6附录干扰素效价测定(细胞病变抑制法)附录干扰素效价测定(细胞病变抑制法)

1试验材料所用试剂均需分析纯或与指定产品相当。1.1MEM培养液按说明书配制，经除菌过滤，置于玻璃或塑料瓶中，4ºC保存。使用期限不得超过产品标示有效期。1.2牛血清应符合《中国生物制品主要原辅材料质控标准》中牛血清的有关要求。1.3完全培养液MEM培养液添加10%牛血清。1.4测定培养液MEM培养液添加7%牛血清。1.5攻毒培养液MEM培养液添加3%牛血清。1.6消化液取0.2g乙二胶四乙酸二钠、8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.152g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾，用蒸馏水配成1000ml的溶液，经121ºC、15分钟高压灭菌。1.7染色液取50mg结晶紫加入20ml乙醇溶解，用蒸馏水定容至100ml。1.8脱色液50%乙醇，50%蒸馏水，0.1%乙酸(ml/m)。1.9标准品干扰素效价测定用国家标准品。1.10PBS取8g氯化钠、0.2g氯化钾、1.44g磷酸氢二钠、O.24g磷酸二氢钾用蒸馏水配成1000ml的溶液，经121ºC、15分钟高压灭菌。1.11WISH细胞(人羊膜细胞)WISH细胞在培养基中呈单层，贴壁生长，每周2次，1:4消化传代，于完全培养基中生长。1.12VSV(水泡性口炎病毒)-70ºC保存2试验步骤2.1～2.7项各步骤应于无菌条件下进行。2.1铺板弃去WISH细胞培养瓶中的培养液，用PBS洗2次后消化和收集细胞，用完全培养液配成2.5×105～3.5×105个细胞/ml的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板中，每孔100µl。3ºC，5%CO2条件下培养4～6小时。2.2制备标准溶液取1支标准品按说明书溶解后，用测定培养液稀释至103IU/ml。2.3制备样品溶液将待检样品按说明书溶解后，用测定培养液稀释至103IU/ml。2.4于96孔细胞培养板中每孔加入150µl测定培养液。在A6、A7各孔中每孔加入50µl标准溶液，在A2、A3；A4、A5；A8、A9；A10、A11各孔中每孔加入50µl各待检样品溶液，每个待检样品做2个复孔。自A行取50µl至H行作4倍稀释，每孔留150µl余液。2.5加样取2.1项制备的细胞培养板。将2.4项制备的溶液移入该细胞培养板，每孔100µl。37ºC，5%CO2条件下培养18～24小时。2.6制备病毒液攻毒剂量为100TCID50，取保存的VSV用攻毒培养液稀释至工作浓度。2.7攻毒取2.5项制备的细胞培养板，弃去上清。加入病毒液，每孔100µl。37ºC，5%CO2培养24小时(镜检标准溶液的50%病变点在D或E行)。2.8染色弃去上清，每孔加入50µl染色液，室温放置30分钟。2.