结构生物学介绍和进展市公开课金奖市赛课一等奖课件

结构生物学董宇辉BSRF，IHEP，CAS第1页结构生物学定义顾名思义，结构生物学就是研究各种生物大分子（蛋白质、核酸、糖类等）结构，结构与功效关系，以及怎样在生物体内发挥作用学科。第2页结构主要性生物大分子功效主要取决于其结构。结构异常会引发功效改变，也是所谓“构像病”原因。第3页疯牛病等构像病罪魁祸首—Prion正常Prion致病Prion因为结构改变，造成了疯牛病、克雅氏病（Creutzfeldt-JacobDisease；CJD）等传染性脑海绵状病变（TSE）。第4页分子生物学：

当代生物学主流方向分子生物学是当代生物学中最主要学科，几乎每年诺贝尔化学奖，生理学或医学奖都授予这方面研究。研究各种生物大分子功效以及在生物体中生物化学过程，是分子生物学最主要任务。第5页结构在当代生物学里中心地位在分子生物学中，结构是非常主要内容。只有在取得对应分子结构后才能深入地研究其功效和生化过程。第6页举例酶蛋白：只有在了解了酶活性中心结构以及怎样与底物结合后，才能真正了解这种酶作用机理；对肌肉中肌动蛋白和肌球蛋白结构有了详细了解，才能说明肌肉收缩和非肌肉细胞运动机理。第7页NobelinStructure一共有11项诺贝尔奖授予生物分子结构方面研究。有结构解析方法研究，也有主要生物分子结构和功效研究工作。第8页TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1962FrancisHarryComptonCrickJamesDeweyWatsonMauriceHughFrederickWilkins"fortheirdiscoveriesconcerningthemolecularstructureofnucleicacidsanditssignificanceforinformationtransferinlivingmaterial"From第9页TheNobelPrizeinChemistry1962MaxFerdinandPerutzJohnCowderyKendrew"fortheirstudiesofthestructuresofglobularproteins"From第10页TheNobelPrizeinChemistry1964DorothyCrowfootHodgkin"forherdeterminationsbyX-raytechniquesofthestructuresofimportantbiochemicalsubstances"From第11页TheNobelPrizeinChemistry1982AaronKlug"forhisdevelopmentofcrystallographicelectronmicroscopyandhisstructuralelucidationofbiologicallyimportantnucleicacid-proteincomplexes"From第12页TheNobelPrizeinChemistry1985HerbertA.HauptmanJeromeKarle"fortheiroutstandingachievementsinthedevelopmentofdirectmethodsforthedeterminationofcrystalstructures"From第13页TheNobelPrizeinChemistry1988"forthedeterminationofthethree-dimensionalstructureofaphotosyntheticreactioncentre"JohannDeisenhoferRobertHuberHartmutMichelFrom第14页TheNobelPrizeinChemistry1997PaulD.BoyerJohnE.WalkerJensC.Skou"fortheirelucidationoftheenzymaticmechanismunderlyingthesynthesisofadenosinetriphosphate(ATP)""forthefirstdiscoveryofanion-transportingenzyme,Na+,K+-ATPase"From第15页TheNobelPrizeinChemistryJohnB.FennKoichiTanakaKurtWüthrich"forthedevelopmentofmethodsforidentificationandstructureanalysesofbiologicalmacromolecules""fortheirdevelopmentofsoftdesorptionionisationmethodsformassspectrometricanalysesofbiologicalmacromolecules""forhisdevelopmentofnuclearmagneticresonancespectroscopyfordeterminingthethree-dimensionalstructureofbiologicalmacromoleculesinsolution"From第16页TheNobelPrizeinChemistryPeterAgreRoderickMacKinnon"fordiscoveriesconcerningchannelsincellmembranes""forthediscoveryofwaterchannels""forstructuralandmechanisticstudiesofionchannels"From第17页TheNobelPrizeinChemistry"forhisstudiesofthemolecularbasisofeukaryotictranscription"From第18页TheNobelPrizeinChemistry"forstudiesofthestructureandfunctionoftheribosome"VenkatramanRamakrishnanThomasA.SteitzAdaE.YonathFrom第19页内螺旋外螺旋选择筛钾离子通道三维结构图诺贝尔化学奖钾离子透过细胞膜输运行为，对体内或是大脑中神经信号传导至关主要。然而离子通道选择性透过行为却困扰了生物学家许多年。第20页钾离子通道离子导通机理经过钾离子通道三维结构，解释了它对离子选择性透过机理。（1）“多离子透过”过程：原先通道里有三个钾离子被束缚在里面，只有体积适当钾离子才能经过撞击，将另一个钾离子从相反方向弹出，而体积较小纳离子不行。（2）通道内氨基酸残基结构，模拟了钾离子在溶液中水合状态。只有水合钾离子能够在通道内如同在水溶液内一样自由地运动。第21页钾离子通道RodMacKinnon,RockefellerUniversityPotassiumion(centerredball)intheK+Channelat3.2Åresolution.PreferentialflowofK+ionsconstitutestheelectricalcurrentinnervecells.Science

280,69-77(1998)Cell

95,649-655(1998)Science

289,123-127()Nature

414,37-42()Nature

414,43-48()Nature

415,287-294()Cell111,967-965()Nature423,33–41()第22页结构生物学进展：

Roadtostructureswithoutcrystals董宇辉BSRF，IHEP，CAS第23页Outline同时辐射（SynchrotronRadiation）小角散射（SmallAngleX-rayScattering）自由电子激光（FreeElectronLaser）第24页同时辐射

SynchrotronRadiationLettherebelight:andtherewaslight.--Genesis第25页X射线晶体学和NMR是蛋白质结构测定主要技术，10月2日99.2%测定方法蛋白质结构X射线晶体学74768NMR9616EM综合方法45851Other165总数85058第26页各种生物基因组和功效基因组数据基因克隆蛋白制备结构测定结构测定样品制备蛋白结构蛋白质结构测定流程靶标克隆表示可溶纯化结构15272148666408147484380.6.16第27页取得生物大分子结构主要技术核磁共振方法：分辨率与灵敏度不够，不能确定分子量很大结构，要求样品浓度极高，测定效率低下（几个星期甚至几个月数据搜集时间）。晶体学方法：对样品要求过高，高质量晶体取得困难。试验耗时单晶难以取得相位解析需要特殊单晶分辨率低灵敏度低第28页Howtoobtainstructuresbyproteincrystallography?Expression/purificationcrystallizationX-raydiffractionphasingModelbuildingRefinedstructure第29页蛋白质晶体衍射能力很弱：大部分原子为C、N、O、S；晶体质量差，晶胞大；相位问题处理困难。理想光源必须含有以下特点：高亮度：衍射能力很弱也能够得到好数据；准直性好：质量差、晶胞大晶体也能够进 行试验；能量可调：多波长反常散射处理相位问题。同时辐射恰好提供了适合光源。第30页什么是同时辐射？靠近光速运动电子或正电子在改变运动方向时放出电磁辐射，因为是在同时加速器上发觉，所以称为同时辐射。这种辐射强度高、覆盖频谱范围广，能够任意选择所需要波长且连续可调，所以成为一个科学研究新光源。第31页同时辐射装置示意图Booster储存环部分图片来自SSRL第32页三种发光元件弯转磁铁扭摆器(Wiggler)波荡器(undulator)图片来自SSRL第33页发光元件光束线试验站第34页同时辐射亮度（单位时间，单位面积，单位立体角，一定光子能量范围内光子数）和转靶X光机比较。图片来自MAXIV设计汇报第35页Divergence2p立体角：180°1毫弧度：0.06°三代光源甚至到达10微弧度第36页实际蛋白质单晶真实单晶体内部不是完美，能够看成有一系列小晶体镶嵌而成，每个小晶体能够认为是完美晶体。这些小晶体取向无序程度以“镶嵌度”表征。第37页分子置换法（Molecular

Replacement，MR）同晶置换法（Isomorphous

Replacement，IR，SIR/MIR）反常散射法（Anomalous

Dispersion，AD，SAD/MAD）直接法（Direct

method）Phasing

methods第38页Energyrange同时辐射覆盖了一个很宽频谱范围，从远红外到硬X光。而X光机只能提供几个分立光子能量。第39页MIR（多对同晶置换）设法在蛋白质晶体中加入一些重金属离子，同时晶体结构不发生大改变（同晶置换），置换前后结构因子关系。第40页一个同晶置换能够得到两个可能解。第41页两个同晶置换就能够得到唯一解。第42页“同时辐射+硒代+样品冷冻”已经成为解析全新结构标准方法。第43页多波长反常衍射（MAD）MIR能够解析全新结构，假如能够得到足够同晶置换晶体话。假如蛋白质里有金属离子存在，就能够使用MAD方法。硒代。第44页原子散射因子第45页MAD选择吸收边附近几个波长，相当于几个不一样完全同晶置换。分子生物学提供了硒代伎俩，对于解析全新结构非常有利。关键是衍射试验使用X射线（能量）波长必须可变！第46页同时辐射作用同时辐射加入，大大提升了结构测定速度。第47页PDB(ProteinDataBank)图片来自http:///蛋白质结构增加第48页同时辐射促进了蛋白质结构解析1980-1990年，取得解析蛋白质数量大幅度增加；1980左右，同时辐射开始应用到蛋白质结构解析中，1990年各种技术趋于成熟，同时辐射大规模应用于生物大分子结构解析。第49页生物学家评论生物大分子结构测定影响了生物学几乎全部领域。几乎每个星期都有激感人心结构发表在如Science和Nature这么杂志上。生物大分子晶体学已经比其它任何学科更多地得益于同时辐射应用。

------StevenE.Ealick，CornellUniv.第50页MAD试验波长选择f1f2f3f4第51页四个可选择波长f1：peak，f"最大；f2：inflection，f'最大；f3：highenergyremote；f4：lowenergyremote。流行做法：一边搜集数据，一边解析结构。普通完成f1数据搜集，进行f2数据搜集时就完成相位解析了。第52页几个波长？理论上2个波长就足够破解双解了，不过有直接法帮助，1个波长也就足够了。当然波长越多会越好，不过试验时间延长往往会带来不可预知原因：辐射损伤，仪器设备不稳定等。第53页反常衍射分类单波长反常衍射：SAD；多波长反常衍射：MAD。第54页Peak波长得到相角三个波长得到相角烯醇酶-磷酸酶E1

第55页人源“Coactosin-like”蛋白peak与h-remote组合三个波长第56页同时辐射蛋白质晶体学发展更小晶体：生长晶体是蛋白质晶体学瓶颈，假如能够解析小晶体结构将使得许多困难结组成为可能。更自动化试验流程：不论是解析结构还是在药品研究中应用，大量尝试需要自动化流程。第57页当前，10微米左右质量良好晶体已经能够解析出生物大分子结构。（ESRF，发表于J.Mol.Biol.,367,310-318.）SSRF：可能到达5微米。不过有相当多生物大分子只能够取得1微米左右微晶，如左图所表示与老年性痴呆相关蛋白质极难形成大单晶。当前同时辐射装置希望能提供1微米聚焦光斑解析这些m大小晶体结构。将大大降低生物大分子结晶门槛，极大地推进结构生物学研究和药品研发进展。1m量级蛋白质晶体结构解析第58页Summary同时辐射提供了解析蛋白质结构最适合光源。同时辐射广泛应用，分子生物学技术发展以及蛋白质晶体学理论、软件完善，使得解析蛋白质结组成为相对比较常规技术。第59页小角散射

SmallAngleX-rayScatteringSimplestisthebest.第60页取得生物大分子结构困难核磁共振方法：分辨率与灵敏度不够，不能确定分子量很大结构，要求样品浓度极高，测定效率低下（几个星期甚至几个月数据搜集时间）。晶体学方法：对样品要求过高，晶体不是想得到就能得到。试验耗时单晶难以取得相位解析需要特殊单晶分辨率低灵敏度低第61页NMR技术能够研究溶液状态蛋白，不过受到很多限制测定一系列二维、三维核磁共振谱，经过谱峰位置计算原子之间键长、键角、二面角等立体化学参数，从而得到整个分子三维结构。存在限制：灵敏度不够：需要很浓溶液分辨率不高：存在分子量上限（<39kD）采集速度慢：样品稳定性问题缺乏弱相互作用和中间体捕捉技术膜蛋白结构测定方法不完善第62页蛋白质晶体学问题主要在于样品得到晶体探测衍射点强度确定衍射相位得到电子密度分布进而取得原子位置主要问题：单晶难于制备，尤其是复合物解析相位需要特殊晶体第63页小角散射（SAXS）不需要晶体，在溶液中就可进行试验。不受分子量限制。不受浓度限制。试验时间短，对样品稳定性要求低。仪器设备简单，能够开展原位试验。图片来自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa第64页小角散射所需样品~50微升溶液；蛋白浓度在0.1-10mg/ml；分子量在几千至几亿Da；单分散（mono-disperse）。图片来自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa第65页小角散射优点对样品要求很低：溶液样品既可，分子量、浓度不拘，稳定性不用很高。有些时候结晶会引发一些结构上改变（因为结晶时候packingforce造成），小角散射试验在溶液中进行，更加好地反应生物大分子真实状态。试验相对简单快速，提供了原位研究动态过程可能性。第66页小角散射（1D）vs衍射（3D）1条谱线 上万个衍射点结构信息（3D）第67页图片来自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa第68页小角散射缺点小角散射得到信息量极少，要得到三维结构信息是很困难。只能得到一些比较粗略、低分辨信息，如生物大分子大小、形状等。衍射能够取得非常多衍射点强度，能够解析出三维结构来。相对于晶体学衍射，小角散射理论还不够成熟。第69页经典应用生物大分子（散射体）大小、分布；大致形状（球形、柱形、椭球形等）。分子越大，试验越轻易：和晶体学恰好相反。第70页最近发展能够拟合出生物大分子形状：Shapedetermination利用一系列球谐函数表征分子外形，这个外形（包络）之外密度为零，之内是均匀密度。或者用一系列虚拟原子（dummyatoms）或者虚拟残基来描述生物大分子，调整这些虚拟原子或者虚拟残基位置来确定分子形状。第71页M.B.Kozin,V.V.VolkovandD.I.SvergunJ.Appl.Cryst.(1997).30,811–815用球谐函数展开来表示生物大分子形状。拟合展开系数，使得计算谱线与试验最靠近。需要正则化方法来进行拟合。程序：gnomD.I.Svergun，J.Appl.Cryst.(1992).25,495–503第72页用虚拟原子来表示生物大分子形状。模拟退火这些虚拟原子位置，使得计算谱线与试验最靠近。程序：damin和gasborD.I.Svergun，BiophysicalJournal(1999).76,2879–2886第73页重建晶体结构中丢失部分晶体衍射中看不到部分普通都是一些柔性loop区域。利用小角散射能够拟合出这些loop区域来。程序：credoPetoukhov,Eady,Brown,andSvergun，BiophysicalJournal().

83,

3112–3125第74页生物大分子复合物已知各亚基分子结构，而复合物结构未知；改变亚基相对位置及取向来拟合试验谱线。程序：masshaKonarev,PetoukhovandSvergun，J.Appl.Cryst.().34,527–532第75页研究实例（一）

从基因到功效：dCMP脱氨酶第76页Smu206：AnunknownproteinfromS.mutanscatalyzesthedeaminationofdCMPtodeoxyuridine-5’-monophosphate(dUMP);containsaZn2+whichisimportantforthecatalysis;catalyticactivitydependsonthefeedbackregulationbasedontheratioofdCTPtodTTP,whichareboththeendproductsofthepyrimidinesalvagepathway.Fromthegenesequence,smu206fromStreptococcusmutansUA159shouldbedeoxycytidylatedeaminase.第77页oroticacidUMPCMPRNAdUMPdCMPdCDPdCTPdTMPdTDPdTTPDNAdCDisanenzymeinvolvinginpyrimidinesalvagepathway.ItcatalysesthedeaminationofdCMPtodUMP,whichisthesubstrateofthymidylatesynthaseforproducingTMP.dCDreducestheefficiencyofanticancerandantiviraldrugsviadeaminationatthenucleotidelevel,thisindicatesthatdCDinhibitorshavepotentialapplicationsinchemotherapy.第78页+H2OdCMPdeaminasedCMPdUMPdCTPdTTPMg2+activatorinhibitorMg2+ThedeanimationofdCMPtodUMP.dCTPasactivatorwhiledTTPasinhibitor.AMg2+isnecessaryforthefunctionofdCTPordTTP.第79页RegulationofC&TamountsAGTCdCMPExcessiveCmeansinsufficientT,reactionstarts:dCTPactivating;ExcessiveT,reactionsuppresses:dTTPinhibiting.dTTPinhibitingdCTPactivating第80页KineticassayofSm206:yes,itisSm-dCDTheactivityofdCMP;TheregulationofdCTP/dTTPratio.第81页StructuredeterminationofSm-dCDExpressedinE.coli.Purification,Crystallation.Znfound.StructuresolvedviaZn-MAD.Resolutionof2.8Å.Complexofenzyme,substrateanalogPdR(pyrimidine-2-onedeoxyribotide)andactivatordCTPisalsocrtstallized.Structuresolvedto1.65Å.第82页ThecrystalsSample:8mg/mlSm-dCDReservoir:0.1MTris-HCl,1.5M(NH4)2SO4,15%(v/v)glycerol.Growthunder20°C,3days.Dehydrationwasusedtoimprovethediffraction.Sample:10mg/mlSm-dCD,1mMPdR,5mMdCTPand5mMMgCl2.Reservoir:0.1MMES,1.6M(NH4)2SO4,12%(v/v)dioxane.Growthunder20°C,5days.第83页StructuredeterminationofSm-dCD第84页ThestructureofSm-dCDThesubstrateanalogPdRisfoundasitshydratederivativeDHOMP(3,4-dihydrouridine-5’-monophosphate)第85页ThehexamerofSm-dCDTheallostericregulatordCTPisfoundbetweentwomonomers.第86页第87页TwodifferentZnions第88页TherolesofZnindCDfunctionOneZnionisimportantforthecatalysis.ItbindstoHis71,Cys99,Cys102andDHOMP.Theseresiduesarehighlyconservedinallspecies.AnotherZniondoesnotcomeindirectcontactwiththesubstrateanalogandtheallostericregulator.Itplaysaroleintheloopstability,whichshapesthesitethatbindsthephosphategroupofthesubstrateanalog.TheresiduesaroundthisZnionarenotconserved.MammaliandCDsdonotcontainthisZnion.第89页ConformationmodificationduetoDHOMPanddCTPbindingApoenzyme:openconformation(blue);Complex:closeconformation(red).第90页ModificationofquaternarystructureAdimerisolatedfromthehexamer.ThebindingofDHOMPanddCTPresultinadenserhexamerandfavorablefortheproteinfunction.Apoenzyme:blue;Complex:red.第91页Catalyticmechanism第92页研究实例（二）：CooA起源于光合细菌RhodospirillumrubrumCO-oxidationactivatorprotein(CooA)。CooA结合CO后造成构型改变，以结合特定DNA。这个蛋白属于catabolitegeneactivatorprotein(CAP)家族，与fumarateandnitratereductase(FNR)andthecAMP-receptorprotein(CRP)类似。FromShujiAkiyamaetal.,J.Mol.Biol.()341,651–668.第93页图片来自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa第94页图片来自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa第95页图片来自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa第96页CooA在结合CO后改变并不支持晶体学研究结果。Guinierplotof：CO-freeCO-boundedCO结合对CooA大小改变很小。增强了蛋白之间相互作用，表面电荷分布改变了。图片来自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa第97页SAXS结果仔细分析否定了CooAlinear-bent机制。Rg以及P(r)改变远比linear-bent机制造成小。图片来自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa第98页造成晶体学结构出问题原因：

结晶时产生Packingforce经过晶体学得到结构计算出来SAXS曲线和试验显著不一样，说明在结晶过程中packingforce改变了蛋白结构。晶体学结构中两个DNA结合区域显著不对称（而CO结合区域却是对称），这种结构并不常见。图片来自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa第99页图片来自RIKENSPring-8CenterDr.TetsuroFujisawa第100页研究实例（三）：GltS起源于Azospirillumbrasilense（巴西固氮螺菌）glutamatesynthase(谷氨酸合成酶，GltS)。细菌NADPH-dependentGltS(NADPH-GltS)包含两个亚基：a亚基，162kDa；b亚基，52.3kDa。a亚基结构已知：1ea0。b亚基有个类似物：residues50–520ofpigliverDPD(1h7w)。（N-terminalregionofporcinedihydropyrimidinedehydrogenase）M.V.Petoukhov,D.I.Svergun,P.V.Konarev,S.Ravasio,R.H.H.vandenHeuvel,B.Curti&M.A.Vanoni().J.Biol.Chem.,278,29933第101页2×L-glutamateNADP(+)L-glutamine2-oxoglutarateNADPH+++From第102页谷氨酸合成酶GltS是一个含有Fe-S中心黄素蛋白，催化L-谷酰胺酰胺基还原转移到2-酮戊二酸（2-OG）C-2位上。依据不一样酶种类，这个过程需要NADH或者NADPH，还需要FAD或者FMN，Fe-S中心是必须。细菌GltS需要NADPH，真核生物需要NADP。这个酶和谷酰胺合成酶（glutaminesynthetase）是微生物和植物中氮素同化（ammoniaassimilation）主要路径，在动物中作用还不清楚。细菌包含NADPH-dependentGltS（NADPH-GltS）由a、b两个部分组成，包含1个FAD，1个FMN和3个不一样Fe-Sclusters。第103页NADPH-GltS催化机理示意图第104页活性Glts是a和b亚基组成holoenzyme。小角散射结果表明a亚基在溶液中是4聚体；b亚基是单体和二聚体混合。两个亚基组成holoenzyme在溶液中是4聚体。第105页SAXS试验结果：1：a亚基；2：Glts；3：b亚基。黑点：试验数据；红线：abinitio模型（外形）；绿色点划线：a2（曲线1）和a4b（曲线2）晶体学模型；绿色三角（曲线3）：单体b；绿色圆（曲线3）：二体b；蓝线：刚体拟合后a4（曲线1）和(ab)4；蓝色圆（曲线3）：拟合后b单体与二体混合模型。第106页a4Gltsb2a4重合在Glts上外形第107页a4Gltsb2第108页a4ab(ab)4最终确定结构：4聚a亚基外围包围着4个b亚基。第109页Summary小角散射提供了硕士物大分子溶液状态一个方便伎俩。试验数据能够提供信息量不多，不过在有部分晶体结构情况下，小角散射能够发挥相当主要作用。小角散射硕士物大分子溶液结构仍是一个正在发展技术，有很大提升余地。第110页自由电子激光

FreeElectronLaser发展才是硬道理。--邓小平第111页各种生物基因组和功效基因组数据基因克隆蛋白制备结构测定结构测定样品制备蛋白结构晶体，晶体，晶体！靶标克隆表示可溶纯化结构15272148666408147484380.6.16第112页处理方法：分子不排队，让光子排队探测器分子相干光源利用一束相干性很好、强度很高X光来照射分子，统计下相干散射强度，也能得到分子中原子结构。第113页晶体衍射：即使每一个光子抵达晶体时间（位相，phase）是无规，不过晶体内原子空间排列有序性限定了出射光子只能沿着有限方向，所以出射X射线强度还是很高，能够很轻易就探测得到。第114页分子散射：在原子空间排列无序条件下，出射光子方向不受限制，所以出射X射线强度变得非常微弱。入射X射线光子假如没有确定位相关系（相干），那么即使当前最强光源，这些无序抵达光子产生信号还是弱得无法探测。（强度相加，N个光子N倍信号）第115页除非入射X射线光子“排着整齐队伍”，含有确定位相关系（相干），散射光子产生信号就有确定相位关系，能够进行振幅叠加，N个光子产生N2倍信号（类似共振）。第116页关键：光源当前光源（包含第三代同时辐射）还不能提供足够强度和相干性；能够满足条件光源是：X射线自由电子激光（XFEL）。理由：原子分辨率需要X光；强度和相干性需要激光。第117页什么是自由电子激光？让产生同时辐射电子同时发光（光子相位相同），这么就得到激光。这个过程和常规激光（可见光、红外、紫外激光）是类似。第118页第119页溶菌酶第120页Thesmall30S-subunitoftheThermusThermophilusribosome第121页可能问题分子损伤：极高强度会使分子完全离解，不过XFEL能够在分子离解之前就得到足够信号，计算机模拟证实了这一点。相位问题：过采样技术（oversampling）能够处理这个问题。探测技术：需要发展。试验技术：怎样取得单分子散射信号，需要研究。第122页XFEL作用下溶菌酶分子离解2fs脉冲能够得到可靠结构，5fs以上会有误差，10fs以上基本不可用。第123页试验技术问题强度很高XFEL，怎么固定样品？既然能够把样品在瞬间挥发，也会在瞬间挥发固定样品样品架！第124页试验技术（1）：

Sprayingtechniques第125页试验技术（2）：

Samplesembeddedinvitreousice把蛋白质固定在非晶态冰里面。类似冷冻电镜技术。第126页使用一束脉冲足够短激光，就能够得到可