病毒的分离鉴定

病毒的分离与鉴定要证明某种疾病是由某一感染性病毒所引起，则必须满足以下原则：①从患病者体内分离出病毒；②在实验动物或寄主细胞中可以培养；③证明这种培养物具有滤过性；④在原始宿主或相关种属内能产生同样的病症；⑤能重新分离出病毒。病毒的分离标本的处理标本的收集5g50mlPBS20-25颗玻璃小100ml6min。2-3ml3000×g组织标本：用无菌乳钵或匀浆器研磨组织标本，同时加入足量的PBS制备成20%的悬液，3000×g4℃离心30min。除菌处理10000/4℃过夜。2000/4℃4小时。4℃过夜除菌。病毒的分离培养病毒的不同选用敏感动物（动物接种、鸡胚（鸡胚接种）或离体细胞进行分离培养（细胞培养。鸡胚接种10,38--39℃40—708日后，鸡卵应每天1—2次，以帮助鸡胚发育匀称和防止鸡胚膜粘连。检卵：鸡卵孵育4～5天后，即可用检卵器检查鸡胚发育情况（二天一次4天后，在检卵器上就可见到清晰的血管，鸡卵内有一小黑点（鸡胚，有明显的自然转动。③死胎：如果发现鸡卵血管模糊、扩张、胚胎活动呆滞或不能自主地转动，则可判断胚胎频死或已经死亡，应将其挑捡出来。鸡胚孵育完毕后，用铅笔划出气室边缘和胚胎的位置待用。接种：图1.鸡胚卵黄囊接种：用5～8天鸡胚，以细长针头由鸡卵气室端刺入卵黄囊。孵育后取获卵黄囊膜检查。常用于某些嗜神经病毒的分离。图2.鸡胚羊膜腔接种：用12～14天鸡胚，将检材注入羊膜腔，孵育后取羊水检查。常用于流感病毒的初次分离。图3.尿囊腔接种用9～12天鸡胚，将标本接种于尿囊腔,孵育后取尿囊液检查,常用于培养流感病毒和腮腺炎病毒等。图图1.鸡胚卵黄囊接种：用5～8天鸡胚，以细长针头由鸡卵气室端刺入卵黄囊。孵育后取获卵黄囊膜检查。常用于某些嗜神经病毒的分离。图2.鸡胚羊膜腔接种：用12～14天鸡胚，将检材注入羊膜腔，孵育后取羊水检查。常用于流感病毒的初次分离。图3.尿囊腔接种用9～12天鸡胚，将标本接种于尿囊腔,孵育后取尿囊液检查,常用于培养流感病毒和腮腺炎病毒等。图4.绒毛尿囊膜接种：用10～l2—小窗，然后将材料滴在绒毛尿点病变。常用于培养单纯疱疹病毒、天花病毒和痘病毒。剖检及收获4℃碘酒将气室部卵壳消毒，将气室处卵壳剥去（不要将碎片落入壳膜。然后用无菌手术刀柄从胚胎背部轻轻下压（切勿压破卵黄囊）再用吸管吸取尿囊液，置青霉素小瓶内，于低温保存。优缺点优点：技术简单、来源充沛、价格低廉、数量可大、不需特殊设备。缺点：很多病毒不能适应，主要是哺乳动物的病毒。细胞培养细胞培养(cellculture)是指利用机械、酶或化学方法使动物组织2～4的类型和培养细胞代数的不同，可将其分为两种：原代细胞培养；传代细胞培养。液或培养液与细胞培养物混和物，细胞培养物中的病毒可采用冻每个细胞生理特性基本一致，对病毒易感性相等；无个体差异，准确性和重复性好；可严格执行无菌操作；细胞培养本身就能显示病毒的生长特征；应用空斑技术可进行病毒的克隆化。病毒的鉴定形态学鉴定细胞病变效应c，：病毒在细胞内增殖CPE出现的时间是鉴定病毒的标志之一。等的圆形或不规则形的团块状结构，病毒学上称为包涵体。血吸附和血凝作用细胞的能力；血凝作用指感染细胞的培养液中有许多游离病毒存在，具有凝集红细胞的作用。血吸附实验具有血凝能力的病毒能使感染的细胞吸附红细胞，这种现象被称作吸附作用。大多数粘液病毒能引起吸附。具体检验步骤如下：PBS10%0.5%的浓度（10%1ml19mlPBS混匀。观察。0.2ml30min4PBS3次。0（性）~4（完全吸附）级。3760min来。血凝实验1~1250μl生理盐水。150μl50μl2孔，如此倍1050μl；最后两孔、12）细胞对照。1%1~1250μl。手工震荡，3730min（40min）后观察结果。电子显微镜检查子显微镜检查，直接观察病毒粒子。正染法：超薄切片法取材→固定（戊二醛/四氧化锇）→清洗与脱水→浸透、包埋与聚合→切片→染色（铀染/铅染）优点：可观察病毒形态和形态发生过程。缺点：操作复杂，费时，但标本可长时间保存。负染技术负染是指通过重金属盐在样品四周的堆积而加强样品外周的电子密度，使样品显示负的反差，衬托出样品的形态和大小。具体步骤（漂浮法）为：现将需负染的样品滴几滴在干净的载玻片上，再将有支持膜的载网漂浮在样品液滴上以沾取样品，用滤纸吸干样品余液使样品在载网上仅有一薄层液膜，在样品未干时即加一滴复染液的铜网上，用滤纸吸干多余的染液即可。优点：快速简易10-20mi构。107状态。血清学试验可采用ELISA、琼脂扩散、中和试验、标记抗体技术等免疫血清学方法检查病畜的抗体消长情况和发病组织中的病毒抗原。中和反应利用病毒与特异性中和抗体结合的特性鉴定病毒的种类，观察特异