实验二、马铃薯脱毒种薯的生产程序

PAGE

本科学生综合性实验报告

学号姓名

学院生命科学学院专业、班级

实验课程名称植物组培实验

教师及职称龙维彪

开课学期2013至2014学年第二学期

填报时间2014年5月24日

云南师范大学教务处编印

一．实验设计方案

实验序号

实验二

实验名称

马铃薯脱毒种薯的生产程序

实验时间

2014-5-12至5-23

实验室睿智3栋325室

实验目的

2-1通过本次实验，使学生掌握配制培养基的步骤，能熟练准确配制培养基，并能根据实验目的设计适合的培养基配方。

2-2通过本次实验，掌握马铃薯脱毒试管苗快速繁殖的基本技术；了解马铃薯脱毒种薯生产的过程，为马铃薯脱毒种薯的生产提供必要的基础苗。

2-3

实验原理、实验流程或装置示意图

实验原理

2-1将事先配制好的培养基母液按一定比例稀释至浓度为培养基中规定的使用浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调节物质等，制备成符合要求的培养基。

2-2利用适宜的培养基，诱导带有腋芽的马铃薯单节茎段进行芽生长和根再生形成单苗，从而达到快速繁殖的目的。

2-3

实验流程

2-1培养基的配置

按照配方MS基本培养基＋0.7％琼脂＋3％蔗糖配置培养基

分装灭菌备用

无菌操作技术

马铃薯脱毒种薯的生产程序

①脱毒苗的培育

植物材料的选取；b.材料的处理；c.茎尖剥离；d.培养；e.病毒检测；f.无病毒苗的扩繁

②原原种的生产

③原种生产

④一级种薯生产

⑤二级种薯生产

2-3

实验设备及材料

实验设备

2-1冰箱、普通天平、果酱瓶、移液管、量筒、烧杯、玻璃棒、医用口杯、精密pH试纸（pH5.4~7.0）、药勺、称量纸、封口膜、橡皮筋/棉线、电炉/电磁炉、高压蒸汽灭菌锅等。

2-2酒精棉球、小块纱布、枪状镊子、手术剪、已灭菌培养皿、酒精灯、超净工作台等。

2-3

药品和试剂

2-1MS培养基母液、琼脂、蔗糖、蒸馏水、1mol·L-1HCl、1mol·L-1NaOH

2-2马铃薯快速繁殖培养基、75%消毒酒精

实验材料

2-2马铃薯脱毒试管苗

2-3扩增后的马铃薯试管苗

实验方法步骤及注意事项

2-1马铃薯试管苗快速繁殖培养基的配方设计及配制体积

A培养基配方及配置体积

配方：MS基本培养基＋0.7％琼脂＋3％蔗糖

大量元素:25ml;微量元素：2.5ml;有机物成分：各2.5ml;铁盐：2.5ml;蔗糖:15g;琼脂：3.5g。

配制体积：每小组配制0.5L，用果酱瓶分装成10瓶，每人2瓶。

B培养基配置

（１）根据需要配制的培养基的量称好所需的琼脂（3.5g），放入医用口杯中，加入适量的蒸馏水（估计加入母液后不超过配制总量）置于电磁炉上加热溶解，边加热边用玻棒搅动。

（２）MS基本培养基配置：（配置前先检查各母液情况，如发现有霉菌和沉淀结晶产生，就不能再使用）。大量元素母液：25ml；微量元素母液：2.5ml；铁盐母液：2.5ml；有机物母液：各2.5ml。混匀。

（３）待琼脂完全溶解后，加入规定用量的蔗糖（15g），继续加温并不断搅拌，待琼脂煮透后端离火源，再加入所需用量的母液（可事先取好放于一烧杯中），最后加蒸馏水至所需体积，即500ml。

（4）调节培养基的酸碱性至pH5.8：

由于培养基的pH值直接影响到培养物对离子的吸收，因而过酸或过碱都对植物材料的生长有很大影响。此外，琼脂培养基的pH值还影响到凝固情况。所以，当培养基配制好后应立即进行pH值的调整。最好用酸度计测试，既快又准，如无条件也可用精密pH试纸。培养基若偏酸时用lmol·L-1NaOH来调节，偏碱则可用lmol·L-1HCl来调节。一般来说，当pH值高于6.0时，培养基将会变硬；pH值低于5.0时，琼脂不能很好地凝固。

（5）培养基的分装：

配制好的培养基要趁热分装，分装时容器口小者可采用漏斗分注，口大者直接加注。试管、三角瓶等培养容器加注量占其容积的1/4～1/3为宜，果酱瓶每瓶20～30ml，太多既浪费培养基，又减少了培养材料的生长空间；太少又会因营养不良影响生长。培养基分装完后，用封口膜封严瓶口，并用棉线扎紧。本次实验中500ml分装到10个果酱瓶，每人两瓶，剩余两瓶备用。

（6）培养基的灭菌：

培养基分装后应立即置于高压蒸气灭菌锅内进行灭菌。消毒灭菌时，压力表读数约为1.06kgf·cm-2或0.105MPa（可在0.105～0.12MPa间，但不得超过0.14MPa），温度121℃时保持15～30min左右即可。为了保证灭菌彻底，在蒸气灭菌锅增压前应先将灭菌锅内的冷空气放尽。排净冷空气的办法有两种：

A、可以事前打开灭菌锅放气阀，煮沸，待大量热蒸气排出后再关闭；

B、也可采用先关闭放气阀，待压力升到约0.04MPa，温度超过108℃时打开放气阀排出空气，待压力表指针回到0时再关闭放气阀。

2-2、马铃薯脱毒试管苗的快速繁殖：

A、准备工作：

①接种室的清洁和消毒

②超净工作台的开机和消毒

③剪刀、镊子、已灭菌培养皿、酒精棉球、酒精灯、待用培养基等的准备

④实验材料的准备。

B、马铃薯试管苗单节茎段繁殖无菌操作：

①实验操作前，操作人员洗手及手和小臂消毒。

②使用的镊子、解剖刀等用95％酒精浸泡，之后放在酒精灯上灼烧灭菌，再放在灭菌后的培养皿中冷却后使用。

③培养瓶外壁用酒精拭擦消毒

④将马铃薯试管苗剪为单节茎段后接种到培养基中，在植入材料的前后，培养瓶的瓶口须在酒精灯火焰上烧烤灭菌。

⑤封口、标记、将培养瓶置于培养架上，在温度20-25℃，光照强度2000-3000lx，光照时间12-14小时/天的条件下培养。

2-3

注意事项

（1）玻璃器皿的洗涤。

（2）天平的使用。

（3）培养基的灭菌过程

（2）无菌操作技术

实验数据处理方法

采用记录原数据以及课本资料提供数据进行配制及使用

参考文献

植物组织培养教程（第3版）李俊明朱登云中国农业大学出版社2005.9

二、实验报告

实验现象与结果

2-2马铃薯脱毒试管苗的快速繁殖

如图所示第一瓶长的比较差，第二瓶要相对好一点，长的比较好的是第三瓶。

2-3

成活率高，长势良好，苗健壮，叶大，茎粗。

对实验现象、实验结果的分析及其结论

第一瓶长的最差，苗矮，根长的少，有部分死亡。造成这样的原因是接种时选取的叶芽被损伤，甚至没有叶芽。

第二瓶长的一般，苗很健壮，根发育的很好。

第三瓶长的最好，苗比较高，枝芽分化明显，根十分发达。

3瓶都没有污染情况，说明无菌操作很成功，但是有些苗死了和不长，原因在于叶芽有损伤，且有部分接种苗插反了，导致生长不好和死亡。

种在地里后，成活率高，长势良好，苗健壮，叶大，茎粗。

实验总结

、本次实验用了大概3个星期，时间跨度大，需要每做一步记录一步，也需要很大的耐心。

、实验成功的关键还是无菌操作，因此在进行操作时一定要注意消毒灭菌，在无菌操作台上操作，一定要灼烧镊子等实验用具，且在酒精灯前操作。

、接种的马铃薯苗，在选取时一定要选取有叶芽的，且插入培养鸡时要使叶芽向上，且与培养基垂直。操作时要保证镊子冷却。

经过这