生防芽孢杆菌与化学杀菌剂混配对香蕉枯萎病菌的

生防芽孢杆菌与化学杀菌剂混配对香蕉枯萎病菌的室内毒力测定 刘磊梁昌聪杨腊英薛玉潇郭立佳王国芬黄俊生*(中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室/海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室，海南海口571101)基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项“由尖孢镰刀菌引起的作物土传病害研究”(200903049)资助。作者简介：刘磊，男，1981年生，研究实习员，研究方向为植物病理学。E-mail：liu2003.1-al@163.com。*通讯作者：黄俊生，男，广东潮阳人，研究员，博士，研究方向为分子植物病理学。摘要香蕉枯萎病是毁灭性土传病害，引入生物防治技术可有效降低目前化学杀菌剂的用量，保护生态环境和人类健康。通过平板抑菌试验，研究了2株香蕉枯萎病生防芽孢杆菌C10-1和A5-6对尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxyporumf.sp.cubense)的平板抑制效果以及对化学杀菌剂的适应性，在此基础上，将生防芽胞杆菌与杀菌剂复配，进一步研究其对枯萎病菌的室内抑制效果。结果表明，C10-1菌株对病原菌的抑制效果和对杀菌剂的适应性均优于A5-6菌株，与0.1mg/L咪鲜胺复配后，其抑菌效果显著增强，可达94.96%。关键词生防芽孢杆菌杀菌剂混配香蕉枯萎病菌毒力香蕉枯萎病最早于十九世纪末期在巴拿马发生，是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxyporumf.sp.cubense)引起的毁灭性病害，到20世纪50年代，除了南太平洋、地中海、马来西亚等一些岛屿以外，世界其他地方均有该种病害发生，在我国广东、广西、台湾、福建、海南等地也已有该病害发生[1-3]。香蕉枯萎病为系统性病害，病原菌主要通过根系侵入，并向植株输导组织扩展，危害维管束，蔓延速度快，防治难度大[4]。国内外学者一直致力于防治香蕉枯萎病化学药剂的筛选，目前抗病品种和化学药剂均未取得理想效果，同时化学农药的长期不合理使用反而造成了农药残毒、抗药性和环境污染等诸多问题[5-10]。近年来随着分子生物学技术、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程、发酵工程等新技术的飞速发展，生物农药产生了巨大的社会效益和经济效益，表现出良好的应用前景，生物防治逐渐成为各国研究香蕉枯萎病防治的热点[11]。本课题在已分离到香蕉枯萎病生防芽孢杆菌的基础上，研究了2株香蕉枯萎病生防芽孢杆菌C10-1和A5-6对尖孢镰刀菌的平板抑制效果以及对化学杀菌剂的适应性，在此基础上，进一步研究两者复配对枯萎病菌的室内抑制效果，以期为生物防治与化学防治相结合防控香蕉枯萎病提供技术支持[12]。1材料与方法1.1材料供试菌株：生防枯草芽孢杆菌菌株C10-1和A5-6，尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种B2菌株，均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所微生物农药资源课题组筛选或分离保存。供试药剂：咪鲜胺原药（95%，广州易合通农化供应链有限公司），多菌灵原药（95%，南京艾森精细化工有限公司）。供试培养基：酵母浸膏液体培养基（NB），马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。1.2方法1.2.1生防芽孢杆菌对病原菌的抑制作用根据联合国粮农组织（FAO）推荐的菌落直径法来测定生防芽孢杆菌对香蕉枯萎病菌的抑制率。将芽孢杆菌C10-1和A5-6活化，转摇瓶（NB）28℃下120r/min振荡培养48h，根据预试验结果，分别配制含C10-1和A5-6稀释菌液的PDA平板，菌液浓度分别为104cfu/mL、105cfu/mL、106cfu/mL、107cfu/mL、108cfu/mL。用直径为0.6cm的打孔器在培养7天的B2菌株平板（PDA)菌落边缘打取菌饼，置于含菌液的PDA平板中央，在28℃下培养7天，待对照菌落将要长满平板时，用十字交叉法测量菌落直径，得到平均值，计算不同浓度药剂对菌落生长的抑制率，计算公式如式(1)。运用Finney几率值分析法对浓度-抑制率进行分析，以浓度的自然对数值为自变量（x），抑菌率的几率值为因变量（y）建立回归方程，得到有效抑制中浓度EC50值。每个处理均设3个重复，以普通PDA平板的菌落作为对照。对照菌落直径平均数(cm)-处理菌落直径平均数(cm)抑制率（%）=×100%（1）对照菌落直径平均数(cm)-菌饼直径(cm)1.2.2化学杀菌剂毒力测定根据预试验结果，分别配制含咪鲜胺、多菌灵的NA平板，有效成分终浓度分别为0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L。按照1.2.1中的方法计算不同浓度药剂对菌落生长的抑制率，建立回归方程，得出各供试药剂的有效抑制中浓度EC50值。每个处理均设3个重复，以普通PDA平板的菌落作为对照。1.2.3化学杀菌剂对生防芽孢杆菌的分别配制含咪鲜胺、多菌灵的PDA平板，有效成分终浓度分别为0.01mg/L、0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L。将2种生防芽孢杆菌发酵液（活化后转摇瓶28℃下120r/min振荡培养48h）稀释至107cfu/mL并接种于上述培养基，采用平板计数法检测芽孢杆菌含量。每个处理均设3个重复，将生防芽孢杆菌发酵液涂布于普通PDA平板1.2.4生防细菌和化学药剂混配对病原菌生长的抑制作用配制含咪鲜胺（0.1mg/L）和C10-1发酵液（107cfu/mL）的PDA平板。按照1.2.1中的方法比较不同药剂对菌落生长的抑制率，每个处理均设3个重复，以普通PDA平板的菌落作为对照。1.3数据分析采用Excel进行数据整理和绘图。运用SAS9.0软件计算均值和方差，采用Duncan氏新复极差法进行多重比较。2结果与分析2.1生防芽孢杆菌对病原菌菌丝生长的抑制作用表1生防芽孢杆菌对香蕉枯萎病菌的抑菌效果菌株名称浓度（cfu/mL）抑制率（%）回归方程相关系数EC50（105cfu/mL）C10-110437.13cy=2.3812+0.6537x0.92712.511910559.73b10668.59b10786.17a10890.16aA5-610425.93cy=1.7266+0.6834x0.936721.794310539.75bc10662.38b10775.63ab10882.92a注：相同处理数据后不同字母表示经Duncan氏新复极差法检验差异显著(P<0.05)，下同。两种不同浓度的生防芽孢杆菌对尖孢镰刀菌均有一定的抑制效果，其中C10-1菌株的EC50值较小，说明枯萎病菌对其菌液的敏感性较高，其抑菌率也显著高于A5-6菌株，最高为90.16%（表1）。在107cfu/mL和108cfu/mL时，两菌株的抑制率差异均不显著，因此，选择107cfu/mL的菌液浓度继续进行混配抑菌研究。2.2杀菌剂平板抑菌作用表2不同药剂对香蕉枯萎病菌的抑菌效果药剂名称浓度（mg/L）抑制率（%）回归方程相关系数EC50（mg/L）咪鲜胺0.0134.27cy=3.6381+0.9913x0.955811.46240.157.39b168.53b1081.18ab10089.69a多菌灵0.0121.35cy=0.1556+0.1244x0.963725.14310.127.69bc146.25b1059.86ab10072.03a两种杀菌剂浓度较低时，抑制率也相对较低，浓度增加，抑制率相应有所提高。咪鲜胺的EC50值较低，其抑制作用显著优于多菌灵，选择咪鲜胺继续进行混配抑菌研究（表2）。2.3杀菌剂对生防芽孢杆菌的影响表3咪鲜胺对生防芽孢杆菌的影响浓度（mg/L）C10-1菌落数（106cfu/mL）A5-6菌落数（106cfu/mL）021.19c19.53c0.0120.24c13.25b0.118.78bc11.17b116.73b8.37ab1015.27b5.99ab10011.53a2.86a咪鲜胺浓度较低时抑制率也相对较低，随着浓度增加，抑制率呈正相关增加趋势。当咪鲜胺为0.01mg/L和0.1mg/L时，对C10-1菌株的抑制效果不显著，对A5-6菌株的抑制效果显著（表3）。因此，A5-6菌株受咪鲜胺影响较大，而C10-1菌株相对适应性较好，选择C10-1菌株继续进行混配抑菌研究，同时，咪鲜胺浓度取0.1mg/L。2.4生防细菌和杀菌剂混配对病原菌生长的抑制作用注：不同字母表示经Duncan氏新复极差法检验差异显著(P<0.05)。图1生防细菌C10-1和咪鲜胺混配对病原菌的抑制效果由图1可得，生防细菌C10-1和咪鲜胺混配后对尖孢镰刀菌生长抑菌效果显著增强，抑制率可达94.96%，显著优于单独加入混配浓度菌液或咪鲜胺的效果。3讨论枯草芽胞杆菌是根据菌落形态以及形成芽孢的特点而命名的，是内生芽孢的革兰氏阳性细菌，在芽孢形成初期可分泌各种抗菌物质，对病原真菌有特异性的防治作用，且易定殖在植物表面和土壤，能有效防治多种植物病害[13-14]。因为可产生内生芽胞，因此抗逆性较强，制成粉剂、可湿性粉剂等剂型使用后可同时与化学农药混用而不易失活[15]。同时其在促进植株生长，提高作物产量等方面也显示出了广阔的应用前景。随着人们环保意识及食品安全意识的日益提高，各国政府和植物保护专家的日益重视，利用生防菌防治植物病害日益成为病害防治研究的热点。但枯草芽孢杆菌防治土传真菌病害目前尚缺少完备的基础理论研究，一方面是因为土壤微环境的复杂性，另一方面是田间应用时枯草芽孢杆菌易受到土壤温度、湿度、pH值、作物生长状况以及土壤中原有微生物等因素的影响，这使得枯草芽孢杆菌在田间防效不稳定、见效慢，这也是生防菌普遍存在的问题，严重制约其大规模推广应用。而在田间应用时将生防菌与化学农药交替使用或直接混配，是解决这一问题的重要手段之一。在交替使用或混配时，化学农药成分能有效抑制包括病原菌在内的其他原有微生物的生长，从而提高后续或同时进入该微生态环境的生防菌的竞争力，有利于其定殖并发挥作用，从而提高生防菌的防治效果[16-17]。但是高浓度的化学药剂对生防菌生长一般都有抑制作用，因此一是要适当减少化学药剂的用量，二是要在交替使用或混配前对生防菌的化学药剂适应性进行检测，得到抗性较强的菌株后再进行相关交替使用或混配研究[16,18-19]，适应性不佳的菌株需与化学药剂间隔施用。生防菌与杀菌剂的田间复配防病效果及相关作用机制还有待进一步研究。参考文献[1]魏岳荣,黄秉智,杨护,许林兵,邱继水.香蕉镰刀菌枯萎病研究进展[J].果树学报,2005,22(2):154-159.[2]王振中.香蕉枯萎病及其防治研究进展[J].植物检疫，2006，20（3）：198-200.[3]FourieG,SteenkampET,GordonTR,etal.EvolutionaryRelationshipsamongtheFusariumoxysporumf.sp.cubenseVegetativeCompatibilityGroups[J].ApplEnvironMicrobiol.，2009，75（14）：4770-4781.[4]LiC,ChenS,ZuoC,etal.TheuseofGFP-transformedisolatestostudyinfectionofbananawithFusariumoxysporumf.sp.cubenserace4[J].EuropeanJournalofPlantPathology,2011,131（2）：327-340.[5]Nel 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