原始不加密温州医学院临床免疫学检验

一、外周血单个核细胞的分离概述外周血单个核细胞（PBMC）指淋巴细胞和

单核细胞，是免疫学实验中最常用的细胞群。细胞分离的主要原理之一是根据各类血细胞的大小、密度、沉降率、黏附力等方面的差异，利用特定的技术加以区分。目前临床和科研实验中常用的细胞分离方法是密度梯度离心法。PBMC的密度与血液中的其他细胞不同，红细胞密度较大，约为1.093，多形核粒细胞约为1.092，血小板约为

1.032，PMBC密度介于1.075~1.090之间。利用一种密度为1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺混合液（淋巴细胞分离液）进行密度梯度离心，离心后不同类别的血细胞因密度不同而呈梯度分布。实验原理血浆单个核细胞分离液粒细胞红细胞试剂：淋巴细胞分离液（密度1.0770.001）肝素溶液（500U/ml）Hanks液、含20％灭活小牛

的Hanks液4．2g/L台盼蓝染液器材：试管、滴管、吸管、无菌干燥注射器、无菌棉球、橡皮止血带、水平式离心机、显微镜、血细胞计数板等。实验材料抗凝全血缓冲液实验步骤1．抽取静脉血1.5ml，加入含肝素抗凝管中混匀，再加等量Hanks液，混匀稀释。2．将稀释的全血沿管壁缓缓地加到分层液上方，使稀释血液

于淋巴细胞分离液上，且分离液与稀释血液体积比例为1:2。分离液3．将离心管置于水平式离心机内，以2000r/min

，离心20min。实验步骤用吸管插到血浆与分离液的界面处，沿管壁周缘吸出单个核细胞。置入另一试管中，加入5倍体积的Hanks液混匀，1000rpm，离心5min，弃上

涤细胞）按上述方法将细胞重复洗涤2次（末次用含20％灭活小牛

的Hanks液洗），末次洗涤后，弃上清，留在管底的即为PBMC，用含20％灭活小牛

的Hanks液0.5ml重悬细胞充池、计数，将细胞调节成1～2×106/ml取50l细胞悬液和50l台盼兰染液混匀，取15l滴于玻片上，加盖玻片，高倍镜下计数100个细胞，计算细胞实验步骤4个蓝域为白细胞计数池实验结果PBMC计数结果记录和计算单个核细胞计数结果记录和计算注：活细胞可排斥

不被

，折光性强；死细胞着蓝色，体积略膨大；正常情况下，活细胞比例大于95%。分离不同种类动物外周血单个核细胞时，对分离液的密度要求不同。人的细胞密度为1.0770.001。大鼠为1.0880.001。小鼠为1.0920.001。兔为1.0960.001

等。将血液稀释后分离可降低血液粘稠度和红细胞

，提高单个核细胞的回收率。注意事项向分离液管加稀释血液时，应沿管壁缓缓加入，使血液与分离液形成明显界面。注意轻拿轻放，避免冲散界面。为保持淋巴细胞活性，采血后应在2h内分离细胞，尽快完成操作全程。离心时，离心机转速的增加或减少要注重均匀、平稳，以免影响分离效果。淋巴细胞分离液需平衡到室温后使用，否则会影响分离液的密度，使得率降低临床应用本方法操作简便、稳定，细胞回收率达80％～90％，单个核细胞纯度可达95％，细胞

可达95％以上。该方法是目前最理想、最常用的分离淋巴细胞

段，其的细胞（主要是淋巴细胞，约占90%～95%

）悬液已能满足许多细胞免疫实验要求，也可用于进一步

T细胞、B细胞及单核细胞，故在免疫学实验中有广泛应用，是细胞免疫检测中最基本的方法之一。二、E花环形成试验实验原理人T细胞表面具有能与绵羊红细胞（SRBC）表面糖肽结合的受体，称为E受体（CD2）。已证实E受体是人类T细胞所特有的表面标志。当T细胞与SRBC混合后，SRBC便粘附于T细胞表面，呈现花环状，根据花环形成的多少，可测知T细胞的数目。实验材料试剂：0.5％SRBC悬液、0.8％戊二醛、瑞氏染液器材：

滴管、玻璃管、载玻片、盖玻片、加样枪、加样头、离心机、4℃冰箱、显微镜实验步骤1.

取上述

的1～2×106/ml的PBMC悬液0.2ml和0.5％SRBC

0.2ml，混匀，37℃水浴5min。500rpm×5min，放4℃冰箱2h。轻轻吸去上清0.2ml，沿管壁轻轻加入0.8％戊二醛0.2ml，放4℃冰箱20min。4.

轻轻吹吸均匀沉淀细胞。湿片法：取1d细胞悬液滴加于玻片上，直接高倍镜下观察。干片法：取细胞悬液涂片，自然干燥，瑞氏染色〔I液（蓝色）10s，II液（无色）2min〕，流水轻轻冲洗，干燥后，油镜下观察。实验结果淋巴细胞呈蓝紫色，SRBC淡蓝色，凡结合3个或3个以上SRBC的细胞则为E花环形成细胞，计数100个淋巴细胞，求出E花环形成率。正常值：Et花环形成率为60％～80％注意事项SRBC与淋巴细胞混合后离心速度不能过高，置4℃应至少1h以上或过夜。SRBC以保存1周以内最好，超过2

与淋巴细胞结合力下降，超过5～6

不能再用。SRBC与淋巴细胞混合比例以100:1～200:1为宜；淋巴细胞离体后

过6h，否则会影响花环形成率。温度对实验结果影响较大，故实验温度条件应该保持一致，从4℃取出后应立即计数。计数前将沉淀重悬时，使细胞团块松散即可，不可强力吹打，以免SRBC从淋巴细胞上脱落。临床应用该试验可用于性细胞免疫缺陷病的检测；肿瘤