凝胶层析(分子筛层析)

【目的】掌握凝胶层析的基本原理学习利用凝胶层析法分离纯化物质的实验技能凝胶层析（分子筛层析）1

层析也称之色谱，基本原理是分析样品作为流动相流过固定相时，由于样品中的各个成分与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通过固定相的速率产生了差别，从而达到分离样品中各个成分的目的。层析因固相介质不同又分为离子交换层析、分子筛层析和吸附层析等各种层析。5.2层析原理

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层析也称之色谱，基本原理是分析样品作为流动相流过固定相时，由于样品中的各个成分与固相相互作用不同使得样品中的各个成分通过固定相的速率产生了差别，从而达到分离样品中各个成分的目的。层析因固相介质不同又分为离子交换层析、分子筛层析和吸附层析等各种层析。5.2层析原理

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【原理】

凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离的技术。经常使用的凝胶有交联葡聚糖（Sephadex）、聚丙稀酰胺凝胶和琼脂糖（Sepharose）。5

单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝胶的筛孔的大小不同。凝胶过滤层析凝胶珠6带网孔的凝胶珠小分子不同程度自由进入凝胶珠内大分子不能进入珠内，经珠之间缝隙流出凝胶过滤层析过程示意图7总结：直径大于凝胶网孔的分子(相对分子量大）被完全排阻流程较短，阻力小，速度快；首先流出。直径小于凝胶网孔的分子（相对分子质量小）可完全渗透进入网孔，流程较长，阻力大，移动速率慢；最后流出。中等大小的分子，凝胶颗粒内外部分渗透，渗透程度取决于它们分子的大小，流出介于二者之间。各组分按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。凝胶的网孔大小决定了凝胶的分级分离范围（fractionationrange)。

8几个有关凝胶体积的术语：Vt：凝胶柱床的总体积（totalvolume),常称为柱床体积。Vo:孔隙体积（voidvolume)或外体积。Vi:内体积（innervolume),凝胶珠内部的水相体积。Vm:凝胶基质体积(matrixvolume)

9Ve:某一溶质组分的洗脱体积（elutionvolume),是自加样品开始到该组分洗脱峰（峰顶）出现时的流出体积。

Ve=Vo+Kd×ViKd:

与凝胶孔隙、溶质分子大小相关的函数，0≤Kd≤110凝胶层析的应用范围：

凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。凝胶层析的优点：

凝胶层析具有设备简单、操作方便、分离迅速、效果好、重复性高、不影响分子的生物学活性等。11【试剂与器材】1.待分离样品：0.5%蓝色葡聚糖(BlueDeXtran2000，蓝色，分子量为2×l06)和0.5%铬酸钾(黄色，分子量为194.2)混合物。2.葡聚糖凝胶G-25(Sephadex-G-25)3.洗脱液：蒸馏水；4.层析柱、铁架台:两人一组；5.细玻棒及滴管(细长)。6.试管及试管架、烧杯。

12【操作方法】胶干粉经蒸馏水室温充分溶胀48h，抽真空脱去颗粒空隙中的空气；将胶悬液搅匀，每组倒取50mL。凝胶的预处理装柱柱垂直放好，关闭出水口;关闭出口，加入洗脱液约3cm高：自顶部缓缓加入稀薄的搅匀胶悬液，待底部凝胶沉积1-2cm，再打开出水口(10滴/min)，继续加入上述悬液;至凝胶层沉积达15cm即可，关闭出水口。

平整连续、均匀无气泡无“纹路”13用2～3倍柱床体积的洗脱液平衡，流速为0.5mL/min。（略）静置2min后打开出水口，使溶液缓缓流下，至液面刚好或即将进入凝胶柱表面，关闭出水口；取葡聚糖（14滴）和重铬酸钾（7滴）混合；旋转、沿壁，缓缓加入：开启出水口，使样品流入柱内；

关闭出水口。小心加入蒸馏水20滴，开启出水口，使缓缓流入柱内（7滴/min)。平衡加样不要搅动凝胶面，应保持平整：液面不能低于凝胶面14用蒸馏水洗脱；蒸馏水分批加入；同时用试管分部收集（7滴/管），至有色溶液全部流出；流速：7滴/min。用蒸馏水（15－30mL)洗涤；流速：10－20滴/min；倒出柱料。洗脱收集清洗凝胶面必须有液体，不可流干；控制恒定流速，不能太快。15凝胶过滤层析过程示意图小分子大分子凝胶基质凝胶珠16注意事项装柱前先检查层析柱是否漏水。胶悬液（柱料）不能进行剧烈搅拌，禁止使用电磁搅拌器，这样会使凝胶颗粒破裂而产生碎片。装柱：柱料应连续均匀分布，表面平整，防止产生气泡与分层。加样：不要搅动凝胶面，上样量不能太大。洗脱：保持恒定流速，不能太快。始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则凝胶变干，混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏。17实验结果观察并记录上样和洗脱全过程，柱料颜色的变化；以洗脱管号为横坐标，以光密度为纵坐标作图即得洗脱曲线。分析曲线图并讨论实验结果。（实验中肉眼观察，用符号数表示颜色深浅。蓝色：＋，黄色：Δ；列表记录后作图）

管号123……蓝黄18附录19凝胶过滤层析经常遇见的问题

1．流速慢

（1）有气泡、出水管阻塞

（2）没打开夹子（3）柱压太紧（操作压过大、长期使用、接头漏气

2．柱内产生气泡

（1）上水口不流或皮管破裂，洗脱液外流

（2）接口漏气，如上水口螺丝拧的不紧

3．条带扭曲20

（1）胶面不平

（2）样品或洗脱液中有颗粒

（3）装