(完整版)发酵原理及工艺

2019发酵原理与工艺红霉素发酵题纲发酵基础知识

发酵的影响因素及其控制红霉素发酵工艺

第一部分发酵基础知识PART01发酵基础知识发酵是通过对微生物（或动植物细胞）进行大规模的生长培养，使之发生化学变化和生理变化，从而产生和积累大量人们所需要的发酵代谢产物过程。工业发酵：工业生产中把一切依靠微生物的生命活动而实现的工业生产均称为“发酵”。现代发酵工程：除了使用微生物外，还可以用动植物细胞和酶，也可以用人工构建的“工程菌”来进行发酵；反应设备也不只是常规的发酵罐，而是各种各样的生物反应器，自动化连续化程度高，使发酵水平在原有基础上有所提高和创新。一、发酵的概念二、发酵生产基本流程培养基投料溶解移入发酵罐定容调节灭菌前pH值高压蒸汽灭菌降温至培养温度种子液移入调节空气流量、搅拌速度、罐顶压至规定值，开始发酵三、发酵的几个基本要素消毒与灭菌微生物培养基无菌操作（一）微生物1.微生物分类非细胞型（病毒）细胞型原核微生物（细菌、蓝细菌、放线菌、衣原体、支原体、立克次体等）真核微生物（真菌、原生动物、藻类）细胞型原核微生物（细菌、蓝细菌、放线菌、衣原体、支原体、立克次体等）微生物：是一类肉眼看不见，有一定形态结构，能在适

宜环境中生长繁殖的细小生物的总称。2.菌落：由一个细菌局限于一处生长繁殖后形成的具有一定形

态特征的子细菌群落细菌菌落在固定培养基的培养特征一般从以下方面描述（1）大小（2）边缘形状（3）隆起度（4）表面状态（5）表面光泽（6）表面质地（7）表面形状每一种细菌在一定条件下形成固定的菌落特征。不同种或同种在不同的培养条件下，菌落特征是不同的。这些特征对菌种识别、鉴定有一定意义。几种细菌菌落几种放线菌菌落A

诺尔斯氏链霉菌B

皮疽诺卡氏菌C

酒红指孢囊菌D

游动放线菌E

小单孢菌F

皱双孢马杜拉放线菌CBAFED原生动物藻类酵母菌曲霉属真核微生物包括真菌（霉菌、酵母菌）、藻类和原生动物D大肠杆菌噬菌体H柑橘速衰病毒A烟草花叶病毒B马铃薯卷叶病毒C.SARS病毒F甲流病毒G狂犬病病毒细菌的特殊形态—芽孢某些细菌生长到一定时期，由细胞脱水缩合形成的一个圆形或椭圆形、厚壁、含水量极低、抗逆性极强的休眠体，称为芽孢（偶译“内生孢子”）。芽孢是生物界抗逆性最强的生命体，是否能消灭芽孢是衡量各种消毒灭菌手段的最重要指标。芽孢是细菌的休眠体，在适宜的条件下可重新转变成营养态细胞；产芽孢细菌的保藏多用其芽孢。产芽孢的细菌多为杆菌，也有一些球菌。芽孢的有无、形态、大小和着生位置是细菌分类和鉴定中的重要指标。芽孢与营养细胞相比化学组成存在较大差异，容易在光学显微镜下观察。（相差显微镜直接观察；芽孢染色）细菌的一般培养条件一般细菌可在有氧条件下，37℃、最适pH6.5～7.5，放18～24小时生长。厌氧菌则需在无氧环境中放2～3天后生长。个别细菌如结核菌要培养1个月之久。放线菌的一般培养条件放线菌中除致病类型外，一般为需氧菌，生长的最适温度为28-30℃，最适PH为7.5-8.0，培养时间一般2-3天或更长。真菌的一般培养条件真菌培养的最适温度为28-30℃，最适PH为7.２-7.4，培养时间一般３-４天或更长。4.微生物的大小细菌的大小测量单位是um，需用光学显微镜放大才能看到1米=103毫米=106微米=109纳米5.微生物的分布在人类及其它高等生物难以存活的环境中有些微生物仍可存活，土壤中最多18肠粘膜上分布的细菌皮肤、毛发中的细菌微生物既是人类的敌人，更是人类的朋友！时时刻刻与微生物“共舞”

6.是祸？是

福？鼠疫艾滋病少数微生物是人类的敌人，可以导致病害、霉变等埃博拉病毒防止或消除有害微生物微生物是自然界物质循环的关键环节：固氮、分解；体内的正常菌群是人及动物健康的基本保证帮助消化、提供必需的营养物质、组成生理屏障微生物可以为我们提供很多有用的物质

有机酸、酶、各种药物、疫苗、奶酪、啤酒、酱油等。另外，在医药领域，各种抗生素的制备广泛利用微生物的提取物作为生产原料基因工程为代表的现代生物技术充分利用有益的微生物资源微生物是人类的朋友利用预防接种方法（疫苗）防病。

狂犬病疫苗、卡介苗1901年诺贝尔奖，冯·贝林（德国）——血清疗法防治白喉，破伤风。

1951年诺贝尔奖，M.蒂勒（南非）——黄热病疫苗。抗生素应用：1928年弗莱明发现青霉素(或音译盘尼西林)，1940年开始应用真菌等生物产生的抗生素来治疗疾病。

1952年，瓦克斯曼（美国）——链霉素，第一种有效的结核病菌抗生素（1952年诺贝尔奖）（1945年诺贝尔奖）25（二）培养基1.培养基概念：是人工配制的，适合微生物生长繁殖或产生代谢产物的营养基质。

无论是以微生物为材料的研究，还是利用微生物生产生物制品，都必须进行培养基的配制，它是微生物学研究和微生物发酵生产的基础。

水

是微生物生长所必不可少的。

碳源

在微生物生长过程中能为微生物提供碳素来源的物质称为碳源。

氮源

能被用来构成菌体物质中或代谢产物中氮素来源的营养物质称为氮源。

能源

能为微生物的生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能。

无机盐

矿质元素也是微生物生长所不可缺少的营养物质。

根据微生物对矿质元素需要量大小可以把它分成大量元素和微量元素。

大量元素：Na、K、Mg、Ca、S、P等。

微量元素：锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼等。

生长因子

通常指那些微生物生长所必需而且需要量很小，但微生物自身不能

合成的或合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物。2.微生物需要的营养物质（培养基通用成份）按成分不同划分（1）天然培养基——牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、麦芽汁、玉米粉、牛奶等（2）合成培养基——葡萄糖铵盐培养基、高氏一号培养基、蔡氏培养基（3）复合培养基——PDA、PSA等根据物理状态划分（1）固体培养基——凝固剂：琼脂、明胶、硅胶（2）半固体培养——加少量琼脂（3）液体培养基——绝大多数发酵培养基都采用液体培养基按用途划分（1）基础培养基——牛肉膏、蛋白胨培养基是最基础的培养基（2）加富培养基——特殊营养物质：血液、血清、酵母浸膏、动植物提取液（3）鉴别培养基——用于鉴别不同类型微生物的培养基（4）选择培养基——根据微生物特殊营养要求而设计的培养基3.培养基的类型及应用（1）选择适宜的营养物质（2）营养物质浓度及配比合适（3）物理化学条件适宜（4）经济节约（5）灭菌处理培养基的选定——培养基各成分的称取——取定量蒸馏水加热20—30min溶解——调整pH值——引流装瓶及试管——包扎灭菌——保存4.培养基的配制原则及流程（三）消毒与灭菌微生物控制杀灭抑制彻底杀灭--灭菌部分杀灭--消毒抑制寄主体内病原菌--化疗溶菌杀菌抑制微生物生长--防腐灭菌——应用物理或化学技术杀死或除去物品上或环境中的所有微生物的方法。（杀死繁殖体和芽孢）消毒——应用物理或化学技术杀死物体上或环境中绝大多数微生物(特别是病原微生物)。防腐——利用某种物理、化学因素完全抑制微生物生长与繁殖的方法除菌——利用过滤等技术除去液体或空气中存在的微生物的方法无菌——没有具有生命力的微生物存在，描述物品的状态溶菌——微生物死亡并溶解的现象化疗——利用某些具有选择毒性的化学药物或抗生素对生物体的深部感染进

行治疗，可以有效的消除寄主体内的病原菌

灭菌方法：物理灭菌法和化学灭菌法

1）物理灭菌法热灭菌法——干热灭菌、湿热灭菌辐射灭菌法——紫外线、电离辐射、微波和超声波滤过除菌法——除菌滤器、适用物品其他：超声波（机制：裂解细菌、主要用于粉碎细胞、提取抗原）、干燥与低温抑菌1.灭菌方法常用的物理方法是高温灭菌（消毒）法（1）热灭菌法干热灭菌巴氏消毒法——低温62℃30min即可，如牛奶、酱油、果汁、酒干热空气灭菌法——加热160—170℃,2h（玻璃器皿、陶瓷）湿热灭菌煮沸消毒法——水煮100℃，5min，如注射器、毛巾、解剖用具间歇灭菌法——反复多次流动蒸汽间歇加热灭菌高压蒸汽灭菌法——最有效的湿热灭菌法121℃，15—20min连续加压灭菌法——加热135—140℃,5—15s,用于大规模加工厂灼烧灭菌法——直接用火焰灭菌（如接种环、试管口、三角瓶口手提式灭菌锅卧式灭菌锅干热灭菌箱干热灭菌箱（2）过滤除菌技术过滤除菌法——是指将含菌的液体或气体通过一个称作细菌滤器的装置，使杂菌受到机械阻力而留在滤器或滤板上，从而达到除去杂菌的目的。常用于不宜加热的液体物质，如：抗生素、血清、疫苗、毒素、维生素、糖类溶液等。优点：不破坏液体中各种物质的化学成分缺点：比细菌还小的病毒、支原体、衣原体仍留在液体中（3）辐射灭菌法辐射灭菌法紫外线波长：210—300nm,机理：干扰DNA的复制与转录特点：穿透力差，具有光复活现象，暗复活作用作用：空气消毒、表面消毒、诱变育种包括：γ射线（电子束，适用薄、密度低的物料）

β射线（同位素灭菌法）机理：产生游离基，破坏DNA特点：穿透力强、被灭菌物体温度变化小，适用于医用塑料制品和食品消毒电离辐射机理：高热导致微生物死亡，快速高效

适用于热不稳定者微波、超声波2）化学消毒技术凝固蛋白消毒剂——氯化钠、石灰酸类——盐酸、乳酸溶解蛋白消毒剂——漂白粉、氯胺—T(氯亚明)、二氯异氰尿酸钠、过氧乙酸、

高锰酸钾——季铵盐类，如新洁尔灭、消毒宁——福尔马林、戊二醛、环氧乙烷——碘伏、洗必泰酚类——酚、来苏儿、六氯酚，对皮肤有一定的刺激醇类——乙醇氧化蛋白类消毒剂阳离子表面活性剂烷基化消毒剂其他常用的消毒剂无菌操作目的：保证待检物品不被环境中微生物污染；防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。无菌操作技术：指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。2.无菌操作（1）无菌室的结构：应有更衣间、缓冲间、操作间应有良好的通风条件，安装空调设备及过滤设备无菌室1）无菌环境的要求与保持（2）无菌室的消毒和防污染无菌室内空气测试应基本达到无菌；每日（使用前）紫外线照射（1~2小时）；每周用甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）；每月用新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒；定期作实验室沉降菌计数，以检查无菌室微生物生长繁殖动态。定期检查无菌环境的空气是否符合规定；用紫外线灭菌处理30~60min；检查无菌器材是否完备；实验人员进入无菌室前先用肥皂洗手，然后用75％酒精棉球将手擦干净；缓冲室内换上洗净并经紫外线灯照射过的工作衣、帽、鞋。（3）进入无菌室前的准备工作灭菌器材：玻璃器皿、培养基、无菌衣等；

消毒器材：接种试管、无菌室内的凳子、试管架、天平、工作台等；2）无菌器材准备在操作中不应有大幅度或快速的动作；使用玻璃器皿应轻取轻放；在火焰上方操作；接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；在接种培养物时动作应轻、准。不能用嘴直接吸吹吸管；带有菌液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。3）实验室无菌操作要求实际生产中，对环境、设备、管线、物料、人员等均有控菌要求千方百计避免杂菌污染无菌操作案例1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微生物污染外，还有什么目的？2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。旁栏思考四、发酵的分类发酵原料糖类物质发酵石油发酵废水发酵发酵产物氨基酸发酵有机酸发酵抗生素发酵酒精发酵维生素发酵发酵形式固态发酵液体深层发酵发酵工艺流程分批发酵流加发酵连续发酵需氧情况厌氧发酵通风发酵微生物发酵的三种主要操作方式分批发酵：准封闭式，种子接种到培养基后除了气体流通外发酵液始终留在反应器内，一次加料一次放料。补料分批发酵：在分批发酵过程中补入新鲜料液，只有输入无输出，又称流加发酵。常用，红霉素发酵用此法半连续式发酵：菌体和培养液一起装入发酵罐，每隔一定时间取出部分发酵培养物（带放），同时补充同等数量的新培养基，然后继续培养至发酵结束放出全部发酵液。连续发酵：一边补入新鲜料液，一边以相近的流速放料，维持发酵液原来的体积。发酵方式优点缺点适用范围案例分批发酵周期短；产品易掌握；不易发生染菌；条件变化或需要生产新产品时易改变处理对策；对原料组成要求较粗放发酵前后期基质浓度变化大，不利于细胞生长和代谢。对基质浓度敏感的产物或次级代谢产物不适合用此法脂肪酶流加发酵避免高浓度产物和底物的抑制作用，同时防止后期养分不足而限制菌体生长；降低发酵液浓度，增加溶氧发酵液体积不断增加，受发酵罐操作容积限制发酵周期较短的发酵过程红霉素连续发酵产率、生产质量、生产能力、稳定性、设备利用率、易于实现自动化方面较好；可不断收获产物，提高菌体密度染杂菌机会多，细胞已发生变异和退化生产能力大，微生物变异小，酶活稳定，产品需连续处理的工业体系，仅限于纯培养要求不高的情况污水处理酒精发酵药用酵母饲料酵母面包酵母微生物发酵产品的类型：1）以菌体为产品：如酵母、作为人类或动物的食物的微生物细胞(单细胞蛋白质)；2）以微生物的酶为产品：如广泛用于食品加工、纤维脱浆、葡萄糖生产的淀粉酶，澄清果汁、精炼植物纤维的果胶酶，在皮革加工、饲料添加剂等方面用途广泛的蛋白酶等；3）以微生物的代谢产物为产品：①初级代谢产物-微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。不同种类微生物细胞初级代谢产物种类基本相同。初级代谢产物的合成在不停地进行着，任何一种产物合成发生障碍都会影响微生物正常生命活动；②次级代谢产物-微生物生长到一定阶段才产生的化学结构十分复杂、对该微生物无明显生理功能或并非是微生物生长和繁殖必需的物质，如抗生素、毒素、激素、色素等。不同种类的微生物所产生的次级代谢产物不相同，它们可能积累在细胞内，也可能排到外界环境中。4）将一个化合物经过发酵改造化学结构--生物转化过程：如将乙醇用微生物转化成乙酸，利用生物转化过程生产甾体、手性药物、抗生素和前列腺素等。次级代谢发酵原理当微生物生长到一定阶段，由于营养减少和有害代谢物积累，使比生长速率下降趋零。为了维持生存，微生物体触发有关次级代谢基因，产生次级代谢产物，以取得环境竞争优势，保存自身。迟滞期对数期平台期衰亡期发酵周期生长期生产期微生物1.分类2.菌落3.纯培养4.大小5.分布6.祸福培养基1.概念2.通用成份3.类别4.配制灭菌与无菌操作1.灭菌方法2.无菌操作

第二部分发酵的影响因素及其控制PART02发酵的影响因素及其控制影响发酵过程的因素有培养基、菌体的质量及浓度、温度、pH值、溶氧量、二氧化碳、加料方式、泡沫、压力、搅拌、产物浓度和发酵时间等。一、培养基对发酵的影响及其控制

C源、N源、矿物盐、生长因子、促进剂、前体物质1.碳源碳源用于提供微生物能量来源、构建细胞和形成产物。

碳源包括单糖、双糖、多糖、天然复合物、油脂、低级醇烃等，如葡萄糖、蔗糖、淀粉、面粉、豆油、甘油等。

当培养基中碳源达到5%以上就形成高渗透压溶液，影响发酵。同时在一定浓度下碳源会阻遏产物合成酶，形成碳分解代谢物阻遏（阻遏效应）。种类：葡萄糖优点：

吸收快，利用快，能迅速参加代谢合

成菌体和产生能量缺点：

有些品种产生分解产物阻遏效应。迅速利用的碳源缓慢利用的碳源种类：淀粉、乳糖、蔗糖、麦芽糖、玉米油优点：不易产生分解产物阻遏效应

有利于延长次级代谢产物的分泌期缺点：溶解度低，发酵液粘度大发酵工业中常采用含迅速利用的碳源和缓慢利用的碳源的混合碳源。迅速利用的碳源满足菌体生长的消耗；缓慢利用的碳源，满足产物合成，可延长合成期，提高产量，并可解除葡萄糖效应（阻遏效应）。在发酵过程中，补加糖类控制碳源浓度。（液糖）2.氮源氮源是微生物蛋白质和其他含氮有机物的来源，也参与形成含氮产物。

氮源包括无机氮源和有机氮源，如铵盐、硝酸盐、玉米浆粉、蛋白胨等。

无机氮中的铵离子及有机氮通过降解得到的铵离子也有阻遏产物合成酶的性质。种类：氨水、铵盐和玉米浆优点：易被菌体利用，明显促进菌体生长缺点：

对于有些品种高浓度的铵离子抑制产

物合成迅速利用的氮源缓慢利用的氮源种类：黄豆饼粉、花生饼粉、棉子饼粉优点：利用缓慢，有利于延长次级代谢产物的分泌期。防止早衰。缺点：溶解度低，发酵液粘度大。发酵工业中常采用含迅速利用的氮源和缓慢利用的氮源的混合氮源。迅速利用的氮源促进菌体生长繁殖；缓慢利用的氮源，满足产物合成，可延长合成期，延缓自溶期。发酵过程中，通过控制基础培养基中氮源的配比和补加氮源来调控氮源浓度。（氨水、硫酸铵）3.矿物盐磷酸盐、镁盐、钙盐是微生物能量代谢和生长的参与因素。

锌、铁、钼、钴等是微生物所需要的微量元素。碳酸钙可以调节发酵液pH，但盐浓度达到一定程度则成为生长抑制和产抗调节因素。一般在基础培养基中采用适宜浓度

对于初级代谢产物，磷酸盐浓度采用足量

对于次级代谢产物，磷酸盐浓度采用生长亚适量一般磷酸盐采用单消，防止发生沉淀反应使溶磷量达不到最适量要控制有机氮源中的磷含量，以防溶磷量超过最适量当菌体生长缓慢时，可适当补加适量的磷，促进菌体生长如：磷酸盐的调控磷酸盐能明显促进产生菌的生长（0.32-300mM/L）对于次级代谢产物，高浓度的磷酸盐能抑制产物合成（10mM/L以下）5.产物促进剂非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。4.生长因子

许多微生物生长需要它们所不能合成的生长因子，如特殊氨基酸、维生素、生物素、嘌呤等。一般在天然复合物（如酵母粉、玉米浆）中有存在，但有时也必须单独添加以保证需要。

促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的（机理不详）。有些促进剂本身是酶的诱导物；有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产；也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用；有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。6.前体物质次级代谢产物的合成往往需要特定化学结构物质作为反应起始物。这些物质虽然也能够通过微生物代谢合成得到，但如果予以人为添加则可以有效减少限制，促进产物合成。

加入到发酵培养基中的能够直接被微生物在生物合成过程中结合到产物分子中去而自身结构没有显著变化的一类小分子物质。

如青霉素发酵中添加苯乙酸，红霉素发酵中添加正丙醇，达托霉素发酵中添加癸酸，雷帕霉素、环孢菌素等添加特定氨基酸，效价可以提高好几倍。前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利。如苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%，癸酸必须培养15h后加入。前体添加过多，容易引起挥发和氧化，分解等。因此，使用过程中，常采用流加方法，有利于提高前体的转化率。（正丙醇）

在产物的生物合成过程中，被菌体直接用于产物合成而自身结构无显著改变的物质。产品前体产品前体青霉素G青霉素V金霉素灰黄霉素红霉素达托霉素苯乙酸苯氧乙酸氯化物氯化物正丙醇癸酸核黄素类胡萝卜素L-异亮氨酸L-色氨酸L-丝氨酸西索霉素丙酸盐β-紫罗酮

-氨基丁酸邻氨基苯甲酸甘氨酸蛋氨酸二、培养条件对发酵的影响及其控制温度、pH、溶氧、灭菌条件、剪切力1.温度温度影响微生物酶系的活力，这些酶分别决定微生物的初级代谢生长和次级代谢产抗。不同微生物菌种的生长温度不一样，而生长和产抗阶段的最适温度也有差异。发酵温度的设计要综合考虑能源消耗、发酵周期、稳定培养和产率水平因素，必要时可考虑变温培养。

菌名 生长温度 发酵温度 累积产物温度链球乳杆菌 34 40 产细胞：25~30

产乳酸：30

红色糖多孢菌 34 30~35 _青霉菌 30 25 20发酵液的温度变化受生物热、搅拌热、蒸发热、辐射热和显热的影响用公式表示为：Q发酵＝Q生物+Q搅拌－Q蒸发－Q辐射－Q显生物热：是菌体在生长繁殖过程中产生的热能，来自菌体的分解代谢搅拌热：搅拌器转动引起的液体之间和液体与设备之间的摩擦所产生的热量蒸发热：空气进入发酵罐，与醪液充分混合，引起水分蒸所需的热能显热：水分蒸发、进气和废气排出因温度差异所带走的部分热能辐射热：发酵罐外壁与大气间的温度差异使发酵罐中的部分热能通过罐体向大

气辐射的热能生产中，温度的控制是采用冷却水通入发酵罐的蛇管或夹套中热交换保持恒温发酵的2.pHpH对微生物的影响，主要也是作用于酶，对营养利用和细胞结构也有重要影响。

无控制的条件下，pH呈现如下变化规律：有机氮分解，形成大量NH4+NH4+消耗利用碳源消耗产生有机酸菌体老化，进入鸟氨酸循环形成大量NH4+菌体二次生长pH调节首要在基础培养基的设计，如生理酸碱性物质的搭配、缓冲体系的设计等。另外可以加入外源性的酸碱物质进行调控，如盐酸、氨水等。在流补体系中，往往通过葡萄糖和氨水的流加平衡pH，同时也兼具营养补充功能。同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程中，对pH值的要求也不同。举例：Aspergillusniger在pH2~2.5范围时有利于合成柠檬酸，当在pH2.5~6.5范围内时以菌体生长为主，而在pH7.0时，则以合成草酸为主。

丙酮丁醇梭菌在pH5.5~7.0范围时，以菌体生长为主，而在pH4.3~5.3范围内才进行丙酮丁醇发酵。微生物 生长最适pH 合成抗生素最适pH灰色链霉菌 6.3~6.9 6.7~7.3红霉素链霉菌 6.6~7.0 6.8~7.3产黄青霉 6.5~7.2 6.2~6.8金霉素链霉菌 6.1~6.6 5.9~6.3龟裂链霉菌 6.0~6.6 5.8~6.1灰黄青霉 6.4~7.0 6.2~6.53.溶氧工业微生物大都为好氧微生物，氧的供应和利用影响初级生长和次级代谢。氧的溶解度仅为6.4mg/L，工业发酵中，将无菌空气通入培养基，通过搅拌桨分散气体以实现有效利用，同时维持一定罐顶压以增大氧的溶解度。反映氧的供给和利用情况的数值包括：DO溶解氧、OUR摄氧率、Kla氧传递速率等，可通过溶氧电极、发酵尾气分析仪等获得。生长和产抗往往有不同的氧需求。通过调节通气量、搅拌速率、罐压可以有效控制和保证氧的供给。而发酵黏度、泡沫等因素往往导致氧利用的恶化，需要警惕和控制。谷氨酸发酵时，通气不足会积累大量乳酸和琥珀酸天氡酰胺酶发酵，前期为好气培养，后期为厌氧培养，产酶能力会大大提高4.灭菌条件发酵罐和培养基灭菌是无菌培养的必要前提，同时也导致营养损失和毒性物质积累。因此对于敏感菌种往往需要对部分养分单独灭菌，以降低影响。但是这些影响因素往往会成为控制生长、调节微生物产抗的必要因素。通过灭菌温度、时间的调整来控制微生物发酵也是常用的手段。

5.剪切力发酵生产培养中，搅拌促进氧的分散利用，但桨叶尖端末速形成的剪切力也会损伤菌体，造成菌体断裂破碎，进而导致二次生长、黏度提高、菌种变异等情况，使发酵恶化。对于剪切，可以筛选耐剪切力菌种，提高菌种抵抗能力。在设备上也可以选择低剪切、高分散效率的搅拌桨，如轴流推进式桨叶。三、泡沫对发酵的影响及其控制1.泡沫的性质

泡沫是气体被分散在少量液体中的胶体体系。

分散相是无菌空气和代谢气体，连续相是发酵液。分类发酵液液面上的泡沫出现在粘稠的菌丝发酵液当中的泡沫（又称流态泡沫）起因由外界引进的气流被机械地分散形成发酵过程中产生的气体聚结生成（发酵泡沫）2.泡沫对发酵的影响①使发酵液的装料系数减少，一般为0.7左右；②大量的泡沫易造成逃液，增加污染杂菌的机会；③泡沫的持久存在影响着微生物对氧的吸收，妨碍二氧化碳的排除，因而破

坏其生理代谢的正常进行；④增加了菌群的非均一性；⑤消泡剂的加入影响发酵或下游提取工作的困难。3.泡沫的消除和控制机械消泡法化学消泡法--消泡剂

消泡剂消泡机理：①消泡剂的表面张力比较低，使气泡局部的表面张力降低，力的平衡破坏，导致泡沫破裂；②如果泡沫的表层带有极性的表面活性物质形成双电层时，可以加入一种具有相反电荷的表面活性剂，以降低泡沫的机械强度；或加入某些具有强极性的物质与发泡物质争夺液膜上的空间，降低液膜强度，使泡沫破碎。③如果泡沫液膜的表面粘度较大，可加些分子内聚力较小的物质，以降低液膜的表面粘度，使液膜的液体流失，使泡沫破碎。

常用消泡剂的种类天然油脂类（碳源）：玉米油、豆油、棉子油、米糠油、猪油、鱼油等聚醚类：如聚氧丙烯甘油（GP）和聚氧乙烯氧丙稀甘油（又称泡敌，GPE）高级醇类：最常用的是十八醇、聚二醇硅酮类：这类消泡剂主要是聚二甲基硅氧烷及其衍生物消泡剂使用的注意事项不能用量过大细密地扩散到泡沫效果好加入土温-80具有增效作用多种消泡剂并用4.泡沫的检测和控制最简单的检测是定时在发酵罐视孔上，观察泡沫产生情况，发现泡沫持续上升时，开启消泡剂贮罐的阀门，流加少量消泡剂，使泡沫消失即可。也可在罐内顶部装液位仪与控制仪表连结，用以控制消泡贮率阀门的开启。当泡沫上升接触探头顶端时产生的信号，通过控制装置，指令打开泵开关或阀门，自动加入消泡剂，泡沫消失，信号也随之消失，阀门关闭。四、其他因素对发酵的影响及其控制

1.种子质量的影响（健壮均一、足够数量、缩短迟滞期）

2.设备的影响良好可靠的发酵设备是发酵生产的必要因素。设备对于发酵生产的负面影响表现如：轴封磨损、管路接头缝隙、过滤器失效导致染菌问题；搅拌不平衡导致罐体震动，影响供氧；开关阀门动作失灵导致温度、pH控制不稳等等。

3.人员操作的影响人员操作是发酵生产控制的重要因素,对发酵生产各环节都有决定性影响。只有严格按照操作规程操作，才能避免由于粗略和错误的影响。

4.环境因素环境因素往往导致发酵水平的季节性波动。如环境空气的温湿度会使无菌空气的温湿度有差异，导致培养体积随时间的增减，影响发酵环境。五、发酵终点的判断1.发酵的评价指标发酵产率：单位体积的产物含量g/L

发酵总亿：发酵液中产物总产量十亿单位/kg

发酵系数：产物总产量/总发酵体积*总发酵时间kg/m3*h

发酵成本：发酵(原料+动力+人员+其他)成本/总产量元/kg

2.终点判断标准发酵终点的判断主要从技术和经济指标两方面来衡量。技术上需要寻找发酵总亿与发酵系数的平衡点。当总亿增加，发酵系数却趋低时即应考虑放罐。同时从分离角度考虑，一方面残余营养物要尽量减少，另一方面菌体自溶不能大量出现。此外，一旦难分离杂质组分有升高趋势，也将影响分离得率和总的成本。从经济角度考虑，发酵终点应处于最低发酵成本位置，但同时也应兼顾分离提取需要。

第三部分红霉素发酵工艺PART03制药学训工场01红霉素发酵车间03阿奇霉素车间04中央控制室02红霉素提取车间1无菌压缩空气的准备3补料的准备2培养基的准备4种子的扩大培养红霉素发酵液发酵5红霉素发酵车间红霉素提取车间1陶瓷膜微滤3纳滤膜浓缩2树脂脱色4粗品结晶成品三合一5粗品三合一萃取成品结晶回收一、红霉素简介二、红霉素发酵工艺1.无菌压缩空气制备2.培养基制备3.补料的制备4.种子扩大培养5.发酵一.红霉素简介红霉素为大环内酯类抗生素，抗菌谱与青霉素相似但略广。对G+菌有强大抗菌作用，百日咳杆菌对其较敏感；是1952年从红色糖多孢菌的培养液中分离出来的一种抗生素，其主要成分为红霉素A及其盐类。红霉素为白色或类白色的结晶或粉末；无臭，味苦；微有引湿性。在甲醇、乙醇、丙酮、醋酸丁酯中易溶，在水中极微溶解。理化性质药理作用

本品为大环内酯类抗生素，抗菌谱与青霉素近似，对革兰阳性菌，如葡萄球菌、化脓性链球菌、绿色链球菌、肺炎链球菌、粪链球菌、溶血性链球菌、梭状芽孢杆菌、白喉杆菌、炭疽杆菌等有强的抑制作用。对革兰阴性菌，如淋球菌、螺旋杆菌、百日咳杆菌、布氏杆菌、军团菌、脑膜炎双球菌以及流感嗜血杆菌、拟杆菌、部分痢疾杆菌及大肠杆菌等也有一定的抑制作用。

此外，对支原体、放线菌、螺旋体、立克次体、衣原体、奴卡菌、少数分枝杆菌和阿米巴原虫有抑制作用。金黄色葡萄球菌对本品易耐药。作用机制主要是与核糖核蛋白体的50S亚单位相结合，抑制肽酰基转移酶，影响核糖核蛋白体的移位过程，妨碍肽链增长，抑制细菌蛋白质的合成，系抑菌剂。适应症

适用于支原体肺炎、沙眼衣原体引起的新生儿结膜炎、婴儿肺炎、生殖泌尿道感染（包括非淋病性尿道炎）、军团菌病、白喉（辅助治疗）及白喉带菌者、皮肤软组织感染、百日咳、敏感菌（流感杆菌、肺炎球菌、溶血性链球菌、葡萄球菌等）引起的呼吸道感染（包括肺炎）、链球菌咽峡炎、李斯德菌感染、风湿热的长期预防及心内膜炎的预防、空肠弯曲菌肠炎，以及淋病、梅毒、痤疮等。

临床上主要用于耐青霉素的金黄色葡萄球菌感染及对青霉素过敏的金黄色葡萄球菌感染。亦用于溶血性链球菌及肺炎球菌所致的呼吸道、军团菌肺炎、支原体肺炎、皮肤软组织等感染，此外，对白喉病人，以本品及白喉抗毒素联用则疗效显著。副作用

1）胃肠道反应，可有恶心、呕吐、腹痛及腹泻，反应与剂量大小有关。

2）过敏反应，可有荨麻疹及药物热。

3）可引起肝脏损害，如血清丙氨酸氨基转移酶升高，出现黄疸等。

4）静注或静滴乳糖酸红霉素可引起血栓性静脉炎，静注发生的可能性较多。肌注局部刺激性大，可引起疼痛及硬结，因此不宜肌注。几种代表药品红霉素眼药膏罗红霉素红霉素红霉素软膏琥乙红霉素红霉素肠溶胶囊二.红霉素发酵工艺红霉素发酵定义：生理状况稳定、活力强、能够迅速生长的红色链霉菌、红色链霉菌菌丝体、红色链霉菌孢子在一定的工艺条件下，以流加发酵的方式进行发酵生产，最终得到产物红霉素。1无菌压缩空气的准备3补料的准备2培养基的准备4种子的扩大培养红霉素发酵液发酵5（1）物料搅拌：使之均匀，提高利用率（2）物料传输的动力：靠压力差（3）为发酵或种子培养提供氧气：经济实惠1.无菌压缩空气用途（一）无菌压缩空气制备2.无菌压缩空气制备原理洁净压缩空气的制备压缩空气的灭菌除菌方法：加热灭菌、电除尘灭菌、介质过滤除菌。加热灭菌：利用蒸汽、电和空气压缩机产生的热量维持一段时间达到灭菌的目的；电除尘灭菌：空气中带有一定动能的粒子向强电场运动被电极吸附，达到除菌的目的；介质过滤除菌：空气经过高温灭菌的介质过滤层，将空气中的微生物等颗粒阻截在介质层中，达到除菌的目的。红霉素生产中空气除菌采用加热灭菌和介质过滤除菌相结合的方法，其中介质过滤除菌，必须保持过滤介质处于干燥状态。空气前置高效过滤器一级压缩一级冷却二级压缩丝网捕集器二级冷却捕集0.5um以下的颗粒灰尘及各种悬浮物总过滤器伴热P:80KPa45℃P:220KPa30℃油水分离33-35℃压缩空气管网过滤稳定气压（1）压缩空气制备3.无菌压缩空气制备工艺吹扫后更换滤芯安装滤芯1高效过滤器中效过滤器压缩空气P:215KPaF:100-120Nm3/h滤芯灭菌滤芯灭菌2蒸汽过滤器蒸汽高效过滤器降温降压P:220KPaP:218KPaP:216KPaT:30mint:135

℃空气灭菌P:30KPat:30-35

℃高效过滤器中效过滤器压缩空气空气灭菌3（2）压缩空气的灭菌（除菌）4.无菌压缩空气制备主要设备（1）空气过滤器（2）离心式压缩机（3）列管式换热器（压缩机一级、二级冷却器）（4）丝网捕集器（5）蒸汽过滤器（1）空气过滤器组成滤芯壳体分类初效中效高效作用过滤5μm及以上粒径的尘埃粒子捕集1-5um的颗粒灰尘及各种悬浮物捕集0.5um以下的颗粒灰尘及各种悬浮物材质无纺布；尼龙网无纺布；玻璃纤维玻璃纤维；化纤类原理拦截惯性和扩散静电作用化学过滤（2）离心式压缩机离心式压缩机是依靠动能的变化来提高气体压力的空气压缩设备原理：由叶轮带动气体做高速旋转，使气体产生离心力，使气体获得动能，气体进入定子后，将速度能量转换成所需的压力。动画操作程序及注意事项（3）列管换热器工作过程动画（4）丝网捕集器丝网捕集器用于分离压缩空气中夹带的液滴，以保证压缩空气的质量，可有效去除3--5um的雾滴。结构组成：由丝网、丝网格栅组成丝网块和固定丝网块的支承装置构成，丝网为各种材质的气液过滤网，气液过滤网是由金属丝或非金属丝组成。其组成结构与工作过程如下图：（5）蒸汽过滤器

蒸汽过滤器是利用蒸汽的高温来实现杀菌效果，可过滤蒸汽、空气、水、油液等多种介质，保证过滤后介质的清洁性。

蒸汽过滤器具备良好的耐高温能力、耐腐蚀能力和耐锈蚀能力。

它的滤芯是由不锈钢粉末真空烧结而成，或由五层不锈钢丝网经叠加、真空烧结而成。具有耐高温能力、耐腐蚀能力和耐锈蚀能力。（二）培养基制备培养基：供菌种生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接种后能迅速生长，达到一定的菌丝浓度，又要使长好的菌体能迅速合成产物营养成分：所有发酵培养基都必须提供微生物生长繁殖和产物合成所需的碳源、氮源、无机元素、生长因子、水和氧气等。大规模发酵生产中还必须重视培养基原料的价格和来源。种子培养基：孢子发芽、生长和菌体繁殖的基础，使细胞迅速进行分裂和菌丝快速的生长，为发酵生产培养出强壮、健康、活性高的有益发酵菌群。满足菌体生长。必须有较完全和丰富的营养物质，特别需要充足的氮源和生长因子；各种营养物质的浓度不能太高；成分与发酵培养基的主要成分相近。发酵培养基：发酵产生目标产物的基础，它不仅耗用大量的原材料，而且也是决定发酵生产成功与否的重要因素。满足大生产中大量菌体生长和繁殖以及代谢产物积累。提供的营养成分必须满足细胞生长，代谢活动和合成产物所需的基本要求；除含有菌体生长所必须的营养物外，还要有产物所需的特定元素、前体物质和促进剂等；主成分与其他成分的配比要使发酵生产有利于目标产物的产生。1.红霉素种子培养基制备工艺项目单位参数搅拌转速r/min

加热温度℃60～70pH值

5.5原料玉米浆、固体物料、液体物料固体物料玉米淀粉、葡萄糖、黄豆饼粉、氯化钠、硫酸铵、碳酸钙液体物料玉米油、消沫剂、一次水红霉素种子培养基工艺条件工艺过程：来自槽车的玉米浆压入玉米浆贮罐，经离心泵打入计量罐，通过计量后加入种子培养基配制罐；固体物料经称量后加入培养基配制罐；液体物料经计量后加入配制罐。在配制罐内上述物料及一次水经搅拌混合均匀、调节温度和pH值等参数进行种子培养基的配制。配制合格的培养基经离心泵打入种子罐经实罐灭菌后用于种子培养。红霉素发酵培养基工艺条件项目单位参数搅拌转速r/min

加热温度℃60～70PH值

5.2～5.6原料玉米浆、固体物料、液体物料固体物料玉米淀粉、黄豆饼粉、硫酸铵、氯化钴、碳酸钙液体物料玉米油、消沫剂、一次水2.红霉素发酵培养基制备工艺工艺过程：来自槽车的玉米浆压入玉米浆贮罐内，经离心泵打入计量罐，通过计量后加入发酵培养基配制罐；固体物料经称量后加入培养基配制罐；液体物料经计量后加入配制罐。在配制罐内上述物料及一次水经搅拌混合均匀、调节温度和pH值等参数进行发酵培养基的配制。配制合格的培养基经离心泵打入发酵罐经实罐灭菌后用于发酵生产。备料种子培养基配置种子罐实消种子培养25℃60-70℃pH：5.5120-123℃p：120-130KPaT:40min固体物料：蔗糖、硫酸铵、碳酸钙。液体物料：玉米油、消沫剂备料发酵培养基配置发酵罐实消发酵25℃60-70℃pH：5.2-5.6120-123℃p：120-130KPaT:40min固体物料：麸质粉、硫酸铵、磷酸二氢钾、氢氧化钙、碳酸钙。液体物料：玉米油、消沫剂种子培养基制备发酵培养基制备培养基和发酵设备的灭菌方法实罐灭菌（实消）空罐灭菌（空消）连续灭菌（连消）过滤器及管道灭菌3.主要设备（1）贮罐：贮存物料（2）计量罐：对物料进行有效的计量和控制（3）配制罐：配制培养基，不需灭菌（4）种子罐：种子培养（5）发酵罐：发酵（6）离心泵：物料输送计量罐：采用液位计、超声波检测仪、压力测量仪等检测仪器测量物料在容器中高低差，计算出物料储存量，根据生产工艺和技术要求，取得检测仪器得到的物料高低位差信号，通过信号放大自动控制物料进出口执行部件（如泵、阀等），对物料进行有效的计量和控制。发酵罐：工业上用来进行微生物发酵的装置。主体一般用不锈钢板制成的立式圆筒；结构严密，合理；能耐受蒸汽灭菌；有一定操作弹性；内部附件尽量减少（避免死角）；物料与能量传递性能强；便于清洗、减少污染。1.电动机

2.减速器

3.可视镜

4.消沫装置5.冷却管6.搅拌器

7.联轴器

8.挡板

9.空气分布器

10.夹套罐体：发酵罐的主体，罐顶接有进料管、补料管、排气管、接种管和压力表接管；罐身上接有冷却水进出管、进空气管、取样管、温度计管和测控仪表接口。搅拌器：打碎气泡，使空气与溶液接触均匀，使氧溶解于发酵液中。罐内壁：通常有4到6块挡板，用来改变液流的方向，促使液体剧烈翻动，增加溶解氧。空气分布器：吹入无菌空气，并使空气均匀分布。减速器：将电动机的回转数减速到所要的回转数。联轴器：对轴进行固定，防止摆动，同时又不影响转动。消沫装置：消除泡沫稳定发酵的作用。夹套与冷却管：稳定罐内物料温度的装置。搅拌装置是反应器的关键部件，由搅拌轴和搅拌电机组成。物料充分混合、增强物料分子碰撞、加快反应速率、强化传质与传热效果、促进化学反应。

补料是发酵过程中补入的新鲜料液，用以克服营养不足而导致发酵过早结束的缺点。可以维持低的基质浓度，避免快速利用碳源的阻遏效应；通过补料控制达到最佳的生长和产物合成条件；稳定最佳生产工艺、发酵基质和缓冲液等。最常见的流加物料是糖等能源和碳源物质、氨水等用来控制发酵液pH的物质。

（三）补料的制备红霉素发酵生产中主要的补料五种：正丙醇溶液：实罐灭菌硫酸铵溶液：实罐灭菌消

泡

剂：实罐灭菌液

糖：系统空消+物料连消氨

水：系统空消+氨水过滤除菌正丙醇的制备无菌空气准备1实罐灭菌2正丙醇的使用3正丙醇蒸汽正丙醇的使用正丙醇无菌计量罐P：100-150KPa;T:121℃;t:30min降温至35℃①物料搅拌；②物料输送。工艺过程：正丙醇在配制罐内加水配成50％溶液，用蒸汽加热升温。合格正丙醇经管道过滤器过滤后，由离心泵打入正丙醇无菌计量罐，在无菌计量罐内经实罐灭菌后，靠高效过滤的压缩空气压入发酵罐计量杯，用于红霉素发酵生产。工艺条件：浓度50%、温度60℃～70℃、无菌计量（实罐灭菌）、无菌压缩空气输送用于红霉素发酵生产。硫酸铵的制备无菌空气准备1实罐灭菌2硫酸铵的使用3硫酸铵蒸汽硫酸铵的使用硫酸铵无菌计量罐P：100-150KPa;T:121℃;t:30min降温至35℃①物料搅拌；②物料输送。工艺过程：固体硫酸铵在配制罐内加水配成15%溶液；蒸汽加热升温；合格的硫铵溶液经管道过滤器过滤后由离心泵打入硫酸铵无菌计量罐，在无菌计量罐内经实罐灭菌后，靠高效过滤的压缩空气压入发酵罐计量杯，用于红霉素发酵生产。工艺条件：浓度15%、蒸汽加热温度：60℃～70℃、无菌计量（实罐灭菌）、无菌压缩空气输送用于红霉素发酵生产。消泡剂的制备无菌空气准备1实罐灭菌2消泡剂的使用3消泡剂储罐蒸汽消泡剂的使用消泡剂无菌计量罐P：100-150KPa;T:121℃;t:40min降温至35℃①物料搅拌；②物料输送。工艺过程：来自槽车的玉米油压入消沫剂贮罐，从罐口加入一定量泡敌等其它类型的化学消泡剂，制成复合型消泡剂，由离心泵打入消泡剂无菌罐，在无菌罐内经实罐灭菌后，靠高效过滤的压缩空气压入已空消灭菌的消泡剂计量罐，计量罐内的消泡剂依靠高效过滤的压缩空气压入发酵罐控制红霉素发酵过程中泡沫层的高度。工艺条件：原料是玉米油、泡敌等化学消泡剂；消泡剂无菌罐储存（实罐灭菌、泵输送）；无菌计量（实罐灭菌）、无菌压缩空气输送控制红霉素发酵过程中泡沫层的高度。液糖的制备无菌空气准备1液糖系统空消灭菌2物料连续灭菌34无菌液糖使用蒸汽联消塔维持罐消后计量罐P：200-300KPa;T:121℃;t:10minP：100-150KPa;T:121℃;t:30minP：280KPa;T:132℃;t:10min蒸汽联消塔维持罐消后计量罐T:35-40℃液糖200-400KPa蒸汽升温：80-90℃

工艺过程：来自槽车的液糖压入糖贮罐，升温后的液糖由加压泵送入连消塔，在此与高温蒸汽直接混合升温后流入维持罐内进行持续一定时间的保温，保温合格后输送至已空消灭菌的液糖消后计量罐并降温，温度合格后靠高效过滤的压缩空气压入发酵罐计量杯，用于红霉素发酵生产。工艺条件：储罐蒸汽加热温度：80℃～90℃、连消塔灭菌：（压力：0.4MPa～0.6MPa，蒸汽直混迅速升温至125℃～130℃）、维持罐（时间：30分钟；温度：120℃）、消后计量罐（温度：降至28℃）、无菌压缩空气输送用于红霉素发酵生产。无菌氨水的制备无菌空气的准备1氨水过滤34无菌氨水使用无菌计量罐及管路空消2P：100-150KPa;T:121℃;t:30min灭菌后降温至40℃氨水贮罐P:220KPa预过滤器精过滤器无菌氨水计量罐P:180KPa①物料搅拌；②物料输送。工艺过程：来自槽车的氨水压入氨水贮罐内，罐内的氨水借助压缩空气的作用流入中效过滤器和高效过滤器，过滤后的氨水进入已空消灭菌的氨水无菌计量罐，合格的氨水靠高效过滤的压缩空气压入发酵罐计量杯，用于红霉素发酵生产。工艺条件：氨水储罐（压缩空气输送）经预过滤器和精过滤器过滤、无菌计量（实罐灭菌）、无菌压缩空气输送用于红霉素发酵生产。主要设备连消塔连消塔是给物料加热升温的作用；连续性强，快速灭菌消毒，培养基营养成分破坏少，适用于大容积发酵罐物料的连续灭菌消毒。但由于附加设备多，操作环节多，因此染菌机会增加，染菌涉及面广。连消塔与维持罐联合使用，维持罐是由连消塔打入高温物料，在维持罐内自下而上的层流，排出后进入冷却器；这个层流的过程就是物料保温灭菌的维持过程。维持罐在打料过程中要严格控制打料速度，以防止维持时间短而染菌。工艺要求：总蒸汽压力稳定在0.4MPa，并减少波动；打料泵无泄漏，泵的出口压力应稳定在0.5-0.6MPa；打料泵前的筛板过滤器无堵塞；连消塔和维持罐应定期清理焦化物，防止堵塞。维持罐1.种子制备基础知识种子制备概念：由保藏的菌种开始，经过不断的扩大培养，使菌体数量达到能够满足生产中发酵或是实验室摇瓶发酵接种量的需要所涉及的菌种培养的过程。适合于工业化发酵生产的菌种必须满足条件：生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延滞期短；菌体的生理特性及生产能力稳定；菌体总量及浓度能满足发酵罐接种量的要求；无杂菌污染。（四）种子扩大培养1）种子制备过程固体孢子进罐：适合繁殖能力强、孢子数量多的菌种，可近同步生长菌丝进罐：适合孢子数量少的菌种，适应较快固体孢子培养摇瓶种子培养一级种子罐培养二级种子罐培养发酵罐培养固体孢子制备摇瓶种子制备用三角瓶等进行液体恒温震荡培养摇瓶培养在种子罐中用液体培养基搅拌培养；容积为发酵罐容积的10%左右种子罐种子制备孢子摇瓶种子一级种子…n级用固体培养基在斜面上进行培养发酵罐液体种子二级…n+1级发酵脱离亲本后能发育成新个体的单细胞或少数细胞的繁殖体。孢子一般有休眠作用，能在恶劣的环境下保持自有的传播能力，并再在有利条件之下才直接发育成新个体。（1）孢子制备过程菌种类别培养基特点培养条件技术要点霉菌大米、麦麸等自然培养基；简单易得；比表面积大，适合霉菌孢子繁殖，得孢子数量多25-28℃4-14天4℃保存1.母斜面上的菌落要求分散，以便于挑选理想菌落；2.挑单菌落斜面时，要挑取菌落中央部位孢子；3.孢子成熟后，在真空下将水分含量抽至10%以下，密封后置4℃冰箱中保存备用。孢子制备概念：将保藏的菌种接种到斜面培养基（固体）上，培养出含大量孢子或菌体的菌种。菌种类别培养基特点培养条件技术要点放线菌多用琼脂斜面培养基；含有适合产孢子的营养成分，麸皮、蛋白胨和一些无机盐类等28-37℃5-7天4℃保存1.灭菌后的培养基在放凉且未凝固时摆成斜面，如有不溶解的原材料，应轻轻摇匀，但不要产生气泡；2.斜面凝固后置28-37℃培养2-3天，经检查无杂菌和无冷凝水后方可使用；3.第一次从沙土管或冻干管中接出的菌种往往生长缓慢，菌落稀少，因尚未从休眠中恢复，可用子斜面培养培养。菌种类别培养基特点培养条件技术要点细菌碳源限量而氮源丰富的培养基，牛肉膏、蛋白胨是常用的有机氮源37℃2-3天4℃保存1.灭菌后的培养基在放凉且未凝固时摆成斜面，如有不溶解的原材料，应轻轻摇匀，但不要产生气泡；2.斜面凝固后置28-37℃培养2-3天，经检查无杂菌和无冷凝水后方可使用；3.根据菌种不同，取适量菌种直接接种在斜面上，如果要分离单菌落也可以制成菌悬液，然后再接种在斜面上。（2）摇瓶种子制备过程液体种子制备概念：将固体培养基上培养好的孢子或菌体转入液体培养基中，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。培养基和工艺条件：有利于孢子发芽和菌丝的繁殖。步骤：摇瓶种子制备→种子罐种子制备培养基配制斜面种子或米孢子分装（锥形瓶）灭菌接种恒温震荡培养摇瓶种子（母瓶）摇瓶种子（子瓶）均可用于种子罐种子或摇瓶发酵试验用种子操作步骤技术要点注意事项培养基配制培养基配方与种子罐相似，要求培养基成分比较丰富和完全；易被菌体分解利用；氮源丰富利于菌丝生长；不宜过浓，子瓶浓度高于母瓶1.考虑通过生理酸性和碱性物质等保持pH稳定；2.高压蒸汽灭菌注意事项。接种一般采用斜面种子挖块法或米孢子粒计数接入法如菌种对接种量较敏感，则用菌悬液接种法培养恒温摇床培养，控制转速，使摇瓶种子具有较合适的溶解氧为了使摇瓶中水分蒸发量保持稳定，适当控制湿度保存应在培养成熟后立即使用；如暂时不用，4℃冰箱保存不超过3填经过保存的摇瓶种子一般不用做生产种子，仅用于实验摇瓶种子制备工艺要点（3）种子罐种子制备过程种子罐种子制备概念：将摇瓶种子接入种子罐内培养，使其发芽、生长并繁殖成大量菌体，满足接种发酵罐的需要。摇瓶种子一级种子二级种子三级发酵种子罐级数主要取决于菌种的性质、生长速度和发酵罐容积生长慢菌种常采用多级