CRISPR-Cas9与碱基编辑技术的研究进展

CRISPR-Cas9与碱基编辑技术的研究进展摘要：基因组编辑技术的迅速发展为生物科学领域带来了一场革命，CRISPR-Cas9技术作为新一代的基因组编辑技术，可在基因组上实现定点修饰，具有操作简单，特异性强，耗时短等诸多优点。经过不断发展现开发出了多种Cas9核酸酶衍生物，如摆脱5'-NGG-3'PAM限制的xCas9等，这些Cas9核酸酶衍生物已广泛应用在不同细胞类型和生物体的基因组编辑。由CRISPR-Cas9系统改进而来的碱基编辑技术(baseediting，BE)不需切割DNA双链就能够实现高精度的目标基因编辑。借助碱基编辑工具，目前已经可以实现嘧啶-嘧啶(CBE)，嘌吟-嘌吟(ABE)，嘧啶-嘌吟(CGBE1或miniCGBEl)的转换。CRISPR-Cas9系统在研究基因功能、研究遗传病的发病机理、以及用于基因治疗等诸多领域发挥着重要作用。就CRISPR-Cas9技术和碱基编辑技术的研究进展进行综述。关键词：CRISPR-Cas9;Cas9核酸酶；碱基编辑一、基因组编辑技术基因组编辑技术是一种新兴的能精准的对生物体特定目标基因座进行修饰的一种基因工程技术，在生物科学和医学领域产生了革命性的影响，该技术斩获2020年度的诺贝尔化学奖。其发展历程主要经历了三代，包括锌指核酸酶ZFNs［1-3］，转录激活因子样效应物核酸酶TALENs［4-6］和成簇的有规则间隔的短回文重复序列CRISPR-Cas9。前两项技术的策略是将核酸内切酶催化结构域与DNA结合蛋白连接，在特定基因组序列上实现DNA双链断裂。Cas9核酸酶由一小段gRNA引导至靶向基因组序列制造DNA双链断裂(图1),具有操作便捷，特异性强，设计简单等诸多优点［7］，现已广泛应用在不同细胞类型和生物体的基因组编辑。Cas9核酸酶在特定的基因座上制造双链断裂后细胞主要通过两种途径修复：NHEJ和HDR。NHEJ不需要同源模板，直接将断裂的DNA双链末端重新连接在一起，但是会引入各种长度的插入/缺失突变(Indels)。HDR是另一种主要的DNA修复途径，可通过外源提供的DNA“供体模板”来修复断裂的双链DNA，从而在目标基因座上进行精准修饰。HDR通常只在细胞分裂过程中发挥作用，HDR的效率因细胞生长状态和类型以及修复位点和修复模板的不同而有很大差异［7］。图1RNA引导的Cas9核酸酶的示意图(以人的EMX1基因为例)［7］二、CRISPR-Cas9技术的发展最早在大肠杆菌中报道CRISPR重复序列，当时在其它原核生物中未找到同源序列，CRISPR的生物学功能在当时并不清楚［8］。2002年报道了只存在于原核生物而真核生物或病毒中不存在的重复DNA序列，命名为CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)用于描述细菌和古细菌中长度在21-37bp簇状有规则间隔的短回文重复序列［9］，该研究鉴定出了4个CRISPR相关基因。CRISPR技术在2006年被首次提出可以作为细菌的适应性免疫系统，并将cas基因根据蛋白序列归类为25个不同的家族四。2009年CRISPR切割RNA首次报导，由来自CRISPR基因座的靶向侵袭小分子的psiRNA和Cmr蛋白组成，psiRNA与Cmr蛋白复合物可以识别并结合入侵的RNA。psiRNA-Cmr蛋白复合物可从psiRNA的3'端切割互补靶RNA，然后复合物切割入侵的RNA，破坏遗传信息并可能阻断病毒的生命周期，psiRNA以两种大小形式存在，它们共享一个共同的5'序列标签，但具有不同的3'末端［11］oCas9核酸酶可以在crRNA与靶DNA互补配对结合的条件下作为内切酶制造DNA双链断裂，tracrRNA：crRNA引导的Cas9核酸酶利用独特的核酸内切酶结构域（HNH和RuvC结构域）来切割目标DNA中的两条链。HNH结构域切割互补链，而RuvC结构域切割非互补链。Cas9识别靶标DNA既需要特定的crRNA的序列，也需要与DNA靶标中的crRNA结合区相邻的含GG二核苷酸的PAM序列［12］。通过对PAM依赖性靶DNA融合和RNA-DNA杂合体形成的机制研究，进一步明确了PAM识别的核心重要性。Cas9核酸酶与gRNA和含有5'-NGG-3'的PAM区DNA序列形成复合体。通过与Cas9的羧基末端结构域的保守精氨酸残基相互作用，识别出非互补链GG二核苷酸。在目标DNA链中+1位与PAM双链体的小沟和磷酸二酯键的相互作用导致PAM上游局部链的分离［13］。张锋团队设计了两种不同的II型CRISPR-Cas系统，在人和小鼠细胞的内源性基因组位点诱导精确切割。Cas9核酸酶也可以转化为切口酶以促进同源性定向修复。多个引导序列可以编码成一个单一的CRISPR阵列，从而可以同时编辑哺乳动物基因组中的几个位点，表明CRISPR-Cas9技术的易编程性和广泛的适用性［14］。CRISPRa平台提供了一个模块化的蛋白效应器系统，当与转录激活因子结合时，该系统可用于基因激活。通过RuvC和HNH结构域的突变产生无核酸酶活性的失活Cas9（dCas9）［15］，将转录激活子VP64或p65的结构域与dCas9融合。dCas9-VP64和dCas9-p65都可以有效地激活报告基因表达［16］，dCas9可以作为一个通用的平台广泛用于各种类型的转录控制，从而增加内源性人类基因的表达。VI-BCRISPR系统Cas13b能够高效、特异性地敲除RNA，这为研究非编码RNA以及在转录水平上控制细胞过程的研究提供了基础，无催化活性的Cas13b（dCas13b）保留了RNA的结合能力。将dCas13b与ADAR2的腺苷脱氨酶结构域融合来实现精确的A对I编辑。该系统进一步优化产生REPAIRv2，比以前描述的RNA编辑工具具有更高的特异性，同时保持了高水平的靶标活性［17］。三、碱基编辑技术的研究进展CRISPR-Cas9基因组编辑技术经过不断优化后可在真核细胞中实现高度灵活且特异的基因组编辑。通过与特异靶点的序列进行碱基配对从而引导Cas9核酸酶至特定的靶位点进行切割，然后通过非同源性末端接合（NHEJ）或同源重组（HDR）对断裂的DNA进行修复，虽然HDR修复精确度高，但修复效率极低且局限于有丝分裂细胞限制了HDR修复的应用。因此，精准修复致病基因点突变依然是一大难题。最近开发出不需要切割DNA的碱基编辑技术，对于基因突变导致的遗传疾病的治疗具有重大意义。碱基编辑技术能够实现非常高精度的目标打靶，因此碱基编辑技术非常有望成为地中海贫血、血友病等罕见病基因治疗的热门工具之一。基于来源于大鼠胞嘧啶脱氨酶（APOBEC1）与Cas9n核酸酶和尿嘧啶糖苷酶抑制剂（UGI）融合形成的碱基编辑工具CBEs（图2），包括BE1,BE2,BE3。其中BE3可以在不切断DNA双链的情况下精确地引入由C/G碱基到T/A碱基的转换，也是目前应用的最为广泛的嘧啶碱基编辑工具，目前BE3已应用到基因编辑，动物模型制作及功能基因筛选等领域［18］。有研究表明将来源于七鳃鳗的胞嘧啶脱氨酶与Cas9n核酸酶和尿嘧啶糖苷酶抑制剂融合，该系统可在哺乳动物细胞中实现15%-55%靶向突变［19］。-J-APOBEC1XTENS.pyogenesCas9nUGI一

图2CBEs（Cytidinebaseeditors）结构示意图［18］胞嘧啶脱氨酶同样可以与其他Cas9核酸酶衍生物融合得到新型碱基编辑器，DavidLiu开发了摆脱PAM限制的新型高效的碱基编辑工具，如VQR-BE3（PAM:NGAN），EQR-BE3（PAM:NGAG），SaBE3（PAM:NNGRRT）等。将Cas9核酸酶与突变的胞苷脱氨酶结构域融合得到的碱基编辑器可将编辑窗口的宽度从5个核苷酸缩小到了1-2个核苷酸。能够区分相邻的腺嘌吟从而实现更精准的编辑，其中以YE1-BE3（W90Y+R126E）为最优，编辑活性与BE3保持相当的同时编辑窗口可以精确到1-2个碱基四。通过扩充PAM的CBE，使CBE工具的使用更加灵活。但在碱基编辑过程中产生较低频率的indels及非预期突变（C到G或A的突变），降低了产物纯度四。通过优化linker及UGI的表达量得到变体BE4和eBE-S3均可以不同程度地降低indels及非目标突变，提高其产物纯度纣21］，经过不断优化CBE的编辑效率，产物纯度均有明显的提升，有望成为未来基因治疗的工具。CBE只能实现嘧啶碱基的替换，无法对嘌吟碱基进行编辑。另一种碱基编辑工具ABE利用进化的腺苷脱氨酶与无催化活性的Cas9核酸酶融合可以实现在基因组DNA中将目标A/T碱基对有效地转化为G/C碱基对（在人类细胞中效率约为50%），原理是腺嘌吟脱氨基之后为肌苷，在DNA水平被当作G进行复制（图3）。然而细胞内对于肌苷的切除修复并不敏感，因此ABEs能够实现较高的A/T到G/C的突变，且产品纯度高，额外的Indel频率低。ABE可以更有效地引入点突变，并且脱靶效应更低，ABE结合以前的碱基编辑器一起可以直接引入四种突变，而无需对双链DNA进行切割［2气但由于CRISPR-Cas9技术用于基因组编辑和其他应用时的一个关键要求是在目标靶点上存在5'-NGG-3'的PAM，限制了碱基编辑技术的进一步应用。DavidLiu使用噬菌体辅助持续进化得到一个SpCas9变体xCas9，xCas9核酸酶可以识别更广泛的PAM序列（xCas93.7最优），包括NG，GAA和GAT。xCas9可在人类细胞中的应用，包括靶向转录激活和基因敲除。尽管xCas9核酸酶具有更广泛的PAM兼容性，但它可以保持较低的脱靶效应，在测试的NGG目标位点上，全基因组范围内的脱靶效率均显著降低。xCas9核酸酶的发现扩大了CRISPR系统的DNA靶向范围。将xCas9核酸酶与CBE或ABE融合，同样增加了碱基编辑的靶向范围。与SpCas9-BE3相比，xCas9（3.7）-BE3（C/G-T/A碱基编辑）将可能靶向的ClinVar数据库中4422种病原性SNP的百分比从26%提高到73%。同样xCas9（3.7）-ABE（A/T-G/C碱基编辑）将可能靶向的ClinVar中14969种病原性SNP的比例从28%增加到71%［23］O后来DavidLiu发现表达水平是碱基编辑的瓶颈，通过修饰核定位信号（NLS）和密码子优化构建了新型碱基编辑器BE4max和ABEmax可进一步提高碱基编辑效率［24］。图3ABEs（Adeninebaseeditors）工作示意图［22］CRISPR引导的胞嘧啶和腺嘌吟碱基编辑器被广泛用于许多应用，但主要产生嘧啶到嘧啶或嘌吟到嘌吟碱基的转变。无法实现嘧啶与嘌吟之间的碱基互换。最近J.KeithJoung开发了两个新的碱基编辑器CGBE1和miniCGBEl（图4），可以有效地诱导腺嘌吟转换为胞嘧啶，尤其是在人类细胞中富含AT的序列中，并减少了不必要的突变（C变A或T）oCGBE1由RNA引导的Cas9切口酶，大肠杆菌衍生的尿嘧啶DNAN-糖基化酶（eUNG）和大鼠APOBEC1胞苷脱氨酶变体（R33A）组成。将CGBE1删除eUNG结构域得到miniCGBE1，具有体积更小的优点。CGBE1或miniCGBE1进一步扩展了碱基编辑器的研究和治疗应用。从C到G的转换允许引入新的密码子和序列突变。CBE在密码子的第三个核苷酸位置进行的C变T只能诱导两个氨基酸改变，艮PMet变为Ile（ATG—ATA）和Trp变为终止密码子（TGG—TGA）。同样ABE诱导的A变G只能诱导Ile变为Met（ATA—ATG）和终止密码子变为Trp（TGAtTGG）。相比之下，通过CGBE1或miniCGBE1在密码子的第三个核苷酸位置进行C变G可实现14种不同的氨基酸改变，而CBE和ABE则无法实现。密码子的第一个和第二个核苷酸位置的C到G的改变也使其他氨基酸替换成为可能。在编码区和非编码区CGBE1或miniCGBE1C变G的能力可纠正现有单碱基编辑技术无法实现的其他致病突变［25］O图4CGBE1和miniCGBEl结构示意图[25]四、展望CRISPR-Cas9技术作为新一代的基因组编辑技术，已经在生命科学和医学领域发挥着越来越重要的作用。通过靶向编辑可以改造特定的基因来研究基因功能、研究遗传病的发病机理、开发新药以及用于基因治疗和作物改良等诸多领域。结合碱基编辑技术进一步拓宽了CRISPR-Cas9技术的应用范围，对生物学，医学，农学等领域产生了深