《细胞工程》第4章(3)动物细胞培养工程4

细胞工工程CellEngineeringChapter4、动物物细胞胞培养养工程程4．1概述4．2生产用用动物物细胞胞系4．3培养液液和培培养环环境4．4动物细细胞培培养工工艺4．5动物细细胞培培养过过程的的放大大与优优化4．6动物细细胞代代谢工工程4．7动物细细胞工工程产产品制制备及及质控控4．8动物细细胞工工程表表达产产品的的应用用4．5动物细细胞培培养过过程的的放放大大与优优化4．5．1动物细细胞培培养工工艺的的研究究A、开发发重要要性：：真核细细胞表表达产产物糖糖基化化，有有疗效效；动物细细胞体体外培培养广广泛应应用于于基因因工程程蛋白白质与与病毒疫苗苗等生生产；；动物物细胞胞表达达产品品十分分昂贵贵，开开发周周期长，研研发成成本高高，技技术难难度大大；如如：美美国，，Immunex公司，已已被Amgen公司兼兼并，，生产产治疗疗风湿湿性关关节炎炎蛋白白药物，，2.6g/人、年年×6154美元/g=16000美元，，2002年，销售额额达8.02亿美元元，其其中，，被替替代损损失10亿，因因为产产量低，，计划划投入入数亿亿美元元，耗耗时3-5年，扩扩大规规模、、优化生产产工艺艺，提提高产产量。。B、主要要内容容：生产工工艺的的放大大、生生产工工艺的的稳定定性和和重复复性。。C、初步步研究究：首先必必须较较快建建立一一个基基本（（不要要求是是最优优）的的细胞培养养工艺艺。4．5．2动物细细胞培培养工工艺的的优化化A、影响响蛋白白质产产量的的关键键参数数，营营养养物耗耗尽；；B、决定定细胞胞浓度度有毒废废物的的积累累的关键键参数数培养物物理条条件的的恶化化提高蛋蛋白质质表达达水平平C、细胞胞培养养工艺艺细胞新新陈代代谢的的控制制优化策策略流加工工艺的的优化化4．5．3动物细细胞培培养工工艺的的放大大A、生物物反应应器尺尺寸放放大鼓泡B、氧气气的传传输提高氧氧气传传递的的其它它方法法搅拌速速率和和搅拌拌器的的设计计C、混合合剪切力力和细细胞损损伤D、工业业生产产中的的动物物细胞胞培养养4．6动物细细胞代代谢工工程4．6．1概述A、生命命的代代谢活活动是通过过活细细胞和和细胞胞群的代代谢网网络进进行的的，后后者由由一系系列酶酶催化化的级联联化学学反应应以及及特异异性的的膜转转移系系统所所构成。。然后后，活活细胞胞这种种自身身固有有的代代谢网网络相对对实际际应用用而言言，其其遗传传特性性并非非最佳佳，需要要对细细胞代代谢途途径进进行修修饰；；B、代谢谢控制制发酵酵（metaboliccontrolfermentetion）——是指利利用遗遗传学学或生生物化化学方方法，，人为地在在DNA分子水水平上上改变变和控控制微微生物物的代谢谢，使使目的的产物物大量量的生生成、、积累累的发酵；；C、在代代谢控控制发发酵的的理论论基础上上，提提出和形成成了““代谢谢工程程”概概念；；D、代谢谢工程程（也称称途径径工程程，pathwayengineering）——是指应应用重重组DNA技术和和分析析生物物学相相关的的遗传学学手段段进行行有精精确目目标的的遗传传操作作，改改变酶酶的功能能和输输送体体系的的功能能，甚甚至改改变产产能系系统的的功能，，以改改变细细胞某某些方方面代代谢活活性的的整套套工作作（包括括代谢谢分析析、代代谢设设计、、遗传传操作作和目目的代代谢活性性的实实现））；即即是指指生物物化学学反应应代谢谢网络络有目的的地被被修饰饰。4．6．2基本原原理A、代谢谢网络络理论论细胞代代谢网网络由由上万万种酶酶催化化的系系列反反应系系统、膜膜传递递系统统、信信号传传递系系统组组成，，并且且既受受精密调节，，又互相协协调；代谢网络分分泌处的代代谢产物称称为节点。。根据可变程度节节点可分：：柔性节点点、刚性节节点和半柔柔性节点；柔性和半柔柔性节点是是代谢工程程设计的主主要对象，节点刚刚性程度在在改选前要要进行分析析判断；生物合成相相关代谢调调节和调节节网络理论论代谢工程代代谢流及及节点分析析理论涉及碳碳源、呼呼吸系统和和氧化还原原重新设计计主要内容中中心代谢产产物作用机机制及相关关代谢分析析B、代谢流及及中间产物物分析——静态分析C、代谢控制制分析——动态分析4．6．3代谢调节的的基本类型型及其机制制A、代谢调节节的基本类类型直线式代谢谢的反馈控控制协作式多价价反馈控制制合作反馈控控制累积反馈控控制顺序反馈控控制同工酶控制制B、酶合成及及酶活性的的调节机制制末端代谢产产物阻遏酶的阻遏酶酶合成的分分解代谢物物阻遏和酶的诱导导酶酶的诱导导与合成变变构酶活性的调调节同同工多功能酶4．6．4代谢工程的的研究方法法A、设计思路路改变代谢谢流扩展代谢途途径和构建建新的代谢谢途径常规方法——分子生物、、生化、物物化代谢通量分分析（MFA）—静态B、研究代谢控制分分析（MCA）—动态方法代谢网络生生化系统理理论（BST）—最优化原理理定量分析控控制论模型型（CM）—非线性途径分析——途径定位细胞代谢模模型C、代谢模型型的发展与优化化神经网络计算生物学学方法遗传算法D、逆代谢工工程4．7动物细胞工工程产品制制备及质控控4．7．1动物细胞工工程产品制制备A、初级分离离——离心、过滤滤、吸附B、纯化——色谱法C、制剂与冷冷冻干燥4．7．2动物细胞工工程产品的的质量控制制PAGE纯度SDS液相色谱A、物化指标标测定含含量B、安全性评评介分分子量C、稳定性4．8动物细胞工工程表达产产品的应用用4．8．1重组蛋白药药物A、组织型纤纤溶酶原活活化剂（t-PA）突变体Tenecteplase，商品名TNKaseTM，急性心肌梗梗死病人溶溶栓治疗，，人t-PA基因位于8号染色体p12-q11.2，全长36594bp，14个外显子，，13个内含子，，t-PA由527个氨基酸，，单链糖蛋蛋白，开始始酵母表达，，不能分离离纯化t-PA突变体，由由双链糖蛋蛋白，现用CHO细胞高效表表达成功（（参见下图图）B、β-干扰素（IFN-ββ）最早，为一一种在同种种细胞上具具有广谱抗抗病毒活性的蛋蛋白质，普普遍存在于于个体脾、、肝、肾、淋巴细细胞、骨髓髓，被多因因素诱发，，现为一组多功能能细胞因子子，具有抗抗病毒、肿肿瘤活性，调节免免疫反应，，控制细胞胞生长与分分化，天然IFN-ββ——刺激体外培培养人成纤纤维细胞，，大肠杆菌表表达，活性性低，不稳稳定，Cys17形成二硫键键，缺少N-Met，无糖基化化重组IFN-ββ点突变改造造，使Cys17变为中性氨氨基酸，如：丝、酪酪氨酸，商商品名为：：IFN-ββ-1bCHO细胞表达，，与天然一一样，天然然糖基化，，分离简单。。C、新型红细细胞生成刺刺激蛋白（（NESP）D、血友病——缺少凝血因因子Ⅶ（FⅦ）或含量过过低疾病4．8．2MAb药物（参见见下图）——因为体内同同一抗原具具多个表位位，刺激机体产生生不同抗体体（多克隆隆抗体）杂交瘤技术术能将多克克隆抗体纯纯化为具有高度均一一性，抗原原识别专一一性的MAb，降低抗原识识别交叉反反应；4．8．3基因工程与与亚单位疫疫苗A、乙肝疫苗苗（参见下下图）衣壳——衣壳表面抗抗原（HBsAg），核心抗原——核心抗原（（HBcAg）、e抗原（HBeAg）和核酸第一代疫苗苗，血中提提取，弱反反应，10%不产生反应应，81-82年，美法，，85年，中国第二代疫苗苗，在哺乳乳细胞或CHO细胞表达，，81年，法美，91、92年，中国第三代疫苗苗，PreS抗原（重要要作用），，CHO细胞表达B、艾滋病疫疫苗（参见见下图）CHO表达疫苗——理论上，有有致瘤性昆虫细胞表表达疫苗——昆虫细胞-杆状病毒表表达系统（安全性好好，容量大大，表达效效率高）C、肿瘤疫苗苗灭活自体肿肿瘤细胞对细胞因子子基因修饰饰，主动加加强疫苗免免疫原性免疫同同种种异体的肿肿瘤细胞树突状细胞胞（抗原提提呈细胞））体内外诱导导CTL生成（细胞毒性性T淋巴细胞））激发特异性性抗肿瘤免免疫功能（注射用曲曲妥珠单抗抗，原产地地英文商品品名:赫赛汀）（Zevalin泽娃灵是世世界上第一一个放射性性标记的单单克隆抗体体，2002年在美国上上市，被批批准用于难难治复发B细胞非霍奇奇金淋巴瘤瘤的治疗。。）4．8．4基因治疗产产品基因治疗（（genetherapy）——是指把外界界的正常基因因或治疗基基因通过载载体转入特特定靶细胞，以最最终预防或或改变特殊殊疾病状态态的治疗方法。基基因的转移移可通过物物理或化学学的方法，也可通通过各种病病毒或非病病毒载体的的介导，还可通过改改造细胞（（造血干细细胞、成纤纤维细胞、骨髓肌肌细胞、肝肝细胞、神神经细胞））进行细胞治疗。。A、神经系统统疾病的基基因或细胞胞治疗：B、造血干干细胞治治疗癌症症HSC基因（参参见下图图）胰岛素