m第十四章基因工程

临床床医医学学院院生生物物化化学学教教研研室室佘集集凯凯基因因重重组组和和基基因因工工程程第十十四四章章目录录第一一节节DNA的重重组组DNARecombinationDNA重重组组细菌菌的的基基因因转转移移与与重重组组接合合作作用用、、转转化化作作用用、、转转导导作作用用转座座重重组组同源源重重组组特异异位位点点的的重重组组发生生在在同同源源序序列列间间的的重重组组称称为为同源源重重组组，又又称称基本本重重组组。是是最最基基本本的的DNA重重组组方方式式，，通通过过链链的的断断裂裂和和再再连连接接，，在在两两个个DNA分分子子同同源源序序列列间间进进行行单单链链或或双双链链片片段段的的交交换换。。以E.coli的同源源重组为为例，了了解同源源重组机机制的Holliday模型型。一、同源源重组Holliday模型型中，同同源重组组主要4个关键键步骤①两个同同源染色色体DNA排列列整齐②一个DNA的的一条链链断裂、、并与另另一个DNA对对应的链链连接，，形成Holliday中间间体③通过分分支移动动产生异异源双链链DNA④Holliday中中间体切切开并修修复，形形成两个个双链重重组体DNA，，分别为为：片段重组体拼接重组体

内切酶(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移(recA)

内切酶(recBCD)

DNA连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体体5´3´5´3´5´3´5´3´目录片段重组组体：切开的链链与原来来断裂的的是同一一条链，，重组体体含有一一段异源源双链区区，其两两侧来自自同一亲亲本DNA。拼接重组组体：切开的链链并非原原来断裂裂的链，，重组体体异源双双链区的的两侧来来自不同同亲本DNA。。Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(ruvC)内切酶(ruvC)DNA连接酶DNA连接酶片段重组组体拼接重组组体目录二、细菌菌的基因因转移与与重组接合作用用转化作用用转导作用用细胞融合合（一）接接合作用用当细胞或细菌菌通过菌毛相相互接触时，，质粒DNA从一个细胞胞（细菌）转转移至另一细细胞（细菌）），这种DNA转移称为为接合作用。质粒——细菌染色体外外的小型环状状双链DNA分子可接合质粒如如F因子子(Ffactor)（二）转化作作用通过自动获取取或人为地供供给外源DNA，使细胞胞或培养的受受体细胞获得得新的遗传表表型，称为转化作用。例：溶菌时，裂解解的DNA片片段被另一细细菌摄取。目录（三）转导导作用当病毒从被被感染的细细胞（供体体）释放出出来、再次次感染另一一细胞（受受体）时，，发生在供供体细胞与与受体细胞胞之间的DNA转移移及基因重重组即为转导作用。λ噬菌体的的生活史溶菌生长途途径溶源菌生长长途径例目录目录三、位点特特异重组位点特异重重组是由整合酶酶催化，在在两个DNA序列的的特异位点点间发生的的整合。例（一）λ噬菌体DNA的整整合λ噬菌体的的整合酶识识别噬菌体体和宿主染染色体的特特异靶位点点发生选择择性整合；；反转录病病毒整合酶酶可特异地地识别、整整合反转录录病毒cDNA的长末端重复复序列(LTR)。例（二）细菌菌的特异位位点重组鼠伤寒沙门门杆菌H片片段倒位决决定鞭毛相相转变hix为反向重复复序列，它它们之间的的H片段可可在Hin控制下进进行特异位位点重组(倒位)。。H片段上上有两个启启动子P，，其一驱动动hin基因表达，，另一正向向时驱动H2和rH1基因表表达，反向向(倒位)时H2和和rH1不不表达。rH1为H1的阻遏遏蛋白基因因。H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重组酶转位片段H1鞭毛素沙门氏菌H片段倒位位决定鞭毛毛相转变hinH2IDNA启动序列H1启动序列hinH2IH1例（三）免疫疫球蛋白基基因的重排排免疫球蛋白白(Ig)，由两条条轻链(L链)和两两条重链(H链)组组成，分别别由三个独独立的基因因族编码，，其中两个个编码轻链链(和)，一个编编码重链。。轻链的基因因片段：重链的基因因片段：LVJCLVDJC重链(IgH)基因因的V-D-J重排排和轻链(IgL)基因的V-J重排排均发生在在特异位点点上。在V片段的下下游，J片片段的上游游以及D片片段的两侧侧均存在保保守的重组组信号序列列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的的重组酶基基因rag(recombinationactivatinggene)共有两个个，分别产产生蛋白质质RAG1和RAG2。CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重组信号序列基因片段V片段J片段RSSRSS间插DNAOHOHVJ单链切开RAG1RAG2分子内转酯酯反应单链切开转移核苷酸酸修复、连接接免疫球蛋白白基因重排排过程目录四、转座重重组由插入序列列和转座子子介导的基基因移位或或重排称为为转座(transposition)。典型的插入入序列(IS)组成：二个分离的的反向重复复(IR)序列一个转座酶酶（transposase)编码基基因特有的正向向重复序列列IRTransposaseGeneIR发生形式：：保守性转座座复制性转座座（一）插入入序列转座座插入序列的的复制性转转座目录转座子(transposons)——可从一一个染色体体位点转移移到另一位位点的分散散重复序列列。转座子组成成：反向重复序序列转座酶编码码基因抗生素抗性性等有用的的基因IRIRTransposaseGene有用基因（二）转座座子转座由转座子介介导的转座座目录第二节节重重组DNA技术DNARecombinationTechnique重组DNA技术的发发展史年G.J.Mendel的豌豆杂杂交试验1944年年O.T.Avery的的肺炎球菌菌转化实验验1973年年美国国斯坦福大大学的科学学家构建第一一个个重组组DNA分分子子1977年年美美国国南南旧旧金金山山由由博博耶耶和和斯斯旺旺森森建建立立世世界界上上第一一家家遗传传工工程程公公司司，，专专门门应应用用重重组组DNA技技术术制制造造医医学学上上重重要要的的药药物物。。1980年年开开始始建建造造第一一家家应用用重重组组DNA技技术术生生产产胰胰岛岛素素的的工工厂厂1997年年英英国国罗罗林林研研究究所所成成功功的的克克隆隆了了多莉莉相关关概概念念DNA克克隆隆工具具酶酶目的的基基因因基因因载载体体基本本原原理理重组组DNA技技术术与与医医学学的的关关系系本节节主主要要内内容容一、重组DNA技术相关关概念克隆(clone)来自同一始祖祖的相同副本本或拷贝的集集合。获取同一拷贝贝的过程称为为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆技术水平：分子克隆即即DNA克隆隆细胞克隆个体克隆（动动物或植物））DNA克隆隆应用酶酶学的的方法法，在在体外外将各各种来来源的的遗传传物质质（同同源的的或异异源的的、原原核的的或真真核的的、天天然的的或人人工的的DNA））与载载体DNA接合合成一一具有有自我我复制制能力力的DNA分子子———复制制子，，继而而通过过转化化或转转染宿宿主细细胞，，筛选选出含含有目目的基基因的的转化化子细细胞，，再进进行扩扩增提提取获获得大大量同同一DNA分子子。也也称基因克克隆或或重组组DNA。生物技技术工工程:基因工工程、、蛋白白质工工程、、酶工工程、、细胞胞工程程等目的①分分离获获得某某一感感兴趣趣的基基因或或DNA②获获得感感兴趣趣基因因的表表达产产物（（蛋白白质））基因工工程(geneticengineering)——实实现现基因因克隆隆所用用的方方法及及相关关的工工作称称基因因工程程，又又称重组DNA工艺艺学。（二））工具具酶限制性性核酸酸内切切酶DNA聚合合酶ⅠⅠ逆转录录酶T4DNA连接接酶碱性磷磷酸酶酶末端转转移酶酶TaqDNA聚合合酶重组DNA技术术中常常用的的工具具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基限制性性核酸酸内切切酶定义限制性性核酸酸内切切酶(RE)是识别DNA的特特异序序列,并并在识识别位位点或或其周周围切切割双双链DNA的一一类内内切酶酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ作用与甲基基化酶酶共同同构成成细菌菌的限限制-修饰饰系统统，限限制外外源DNA，保保护护自身身DNA。。分类Ⅰ、Ⅱ、ⅢⅢ（基因工程程技术中常常用Ⅱ型））第一个字母母取自产生生该酶的细细菌属名，，用大写；；第二、第三三个字母是是该细菌的的种名，用用小写；第四个字母母代表株；；用罗马数字字表示发现现的先后次次序。命名HindⅢ属

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆杆菌d株的第三种种酶Ⅱ类酶识别别序列特点点——回文结构构(palindrome)切口：：平端切口口、粘端切口口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口口粘端切口口同功异源源酶来源不同同的限制制酶，但但能识别别和切割割同一位位点，这这些酶称称同功异源源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ同尾酶有些限制制性内切切酶虽然然识别序序列不完完全相同同，但切切割DNA后，，产生相相同的粘粘性末端端，称为为同尾酶。这两个个相同的的粘性末末端称为为配伍未端端。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA（三）目的基基因cDNA基因组DNA目的基因①分离获得得某一感兴趣趣的基因或DNA②获得感兴兴趣基因的表表达产物（蛋蛋白质）（四）基因载载体定义为携带目的基基因，实现其其无性繁殖或或表达有意义义的蛋白质所所采用的一些些DNA分子子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA克隆载体(cloningvector)为使插入的外外源DNA序序列被扩增而而特意设计的的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外外源DNA序序列可转录翻翻译成多肽链链而特意设计计的载体称为为表达载体。载体的选择标标准能自主复制；；具有两个以上上的遗传标记记物，便于重重组体的筛选选和鉴定；有克隆位点（（外源DNA插入点），，常具有多个个单一酶切位位点，称为多多克隆位点；；分子量小，以以容纳较大的的外源DNA。1.质粒(plasmid)特点能在宿主细胞胞内独立自主主复制；带有有某些遗传信信息,会赋赋予宿主细胞胞一些遗传性性状。目录λ噬菌体DNA改造系统统λgt系列（（插入型，适适用cDNA克隆）EMBL系列列（置换型，，适用基因组组克隆）2.噬菌体体(phage)M13噬菌体体DNA改造造系统（含lacZ基因因）M13mp系系列pUC系列M13噬菌体体pUC系列列的物理图谱谱3.粘性质质粒(cosmid)酵母人工染色色体(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色色体(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载载体（如腺病毒，，腺病毒相关关病毒，逆转转录病毒）其他二、重组DNA技术基本本原理克隆基本过程目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

以质粒为载体的DNA克隆过程目录（一）目的基基因的获取1.化学合合成法要求：已知目目的基因的核核苷酸序列或或其产物的氨氨基酸序列。。2.基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)3.cDNA文库(cDNAlibrary)4.聚合酶酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)（见第22章章）*1、化学学合成法获取取目的基因由已知氨基酸酸序列推测可可能的DNA序列组织或细胞染染色体DNA基因片断克隆载体重组DNA分分子含重组分子的的转化菌限制性内切酶酶受体菌基因组DNA文库存在于转化细细胞内由克隆隆载体所携带带的所有基因因组DNA的的集合*2、从基基因组DNA文库获取目目的基因目录限制酶切位点限制酶消化除去中间片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色体DNA限制酶部分消化外源DNA与载体DNA混合连接反应体外包装用重组噬菌体感染大肠杆菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文库目录mRNAcDNA双链cDNA重组DNA分子cDNA文库反转录酶载体受体菌复制*3、从cDNA文库获取目的基因逆转录酶AAAA

TTTTAAAASI核酸酶

DNA聚合酶Ⅰ碱水解

TTTT目录（二）克隆载载体的选择和和构建（三）外源基基因与载体的的连接1.粘性末末端连接方式：(1)同一限限制酶切位点点连接(2)不同限限制酶切位点点连接配伍末端连接接非配伍末端连连接BamHⅠ切割反应应

GGATCCCCTAGGT4DNA连接酶酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切切位点连接目录BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA不同限制酶切切位点（配伍伍末端）的连连接配伍末端的连连接情况和同同一限制酶切切位点连接相相似。不同限制酶切切位点（非配配伍末端）的的连接EcoRⅠ切割位点点BglⅡ切割位点点+EcoRⅠ+BglⅡ双酶切EcoRⅠ+BglⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体目录2.平端连连接适用于：限制性内切酶酶切割产生的的平端粘端补齐或切切平形成的平平端目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连目录3.同聚物物加尾连接在末端转移酶酶(terminaltransferase)的作用下，在在DNA片段段末端加上同同聚物序列、、制造出粘性性末端，再进进行粘端连接接。5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´

3´3´5´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体目录4.人工接接头(linker)连接由平端加上新新的酶切位点点，再用限制制酶切除产生生粘性末端，，而进行粘端端连接。人工接头及其其应用CCGAATTCGGGCTTAAGC5´-3´-EcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠEcoRⅠ目录受体菌条件安全宿主菌（从大肠杆菌菌K-12改改造）限制酶和重组组酶缺陷处于感受态导入方式转化转染感染（四）重组DNA导入受受体菌（五）重组体体的筛选1.直接接选选择择法法(1)抗药药性性标标记记选选择择(2)标标志志补补救救(markerrescue)(3)分分子子杂杂交交法法原位位杂杂交交Southern印印迹迹2.免免疫疫学学方方法法如免免疫疫化化学学方方法法及及酶酶免免检检测测分分析析等等(插插入入失失活活法法)抗药药性性标标记记选选择择目录录组氨氨酸酸缺缺陷陷型大大肠肠杆杆菌菌无组组氨氨酸酸的培培养养基基酵母母咪咪唑唑甘甘油油磷磷酸脱脱水水酶酶基基因因促进进组组氨氨酸酸合合成成λDNA重组组体体标志志补补救救目录录α互互补补目录录α互互补补的的检检测测目录录原位位杂杂交交目录录Southern印印迹迹目录录鸡的的ββ肌肌球球蛋蛋白白的的克克隆隆和和检检出出目录录重组组DNA技技术术操操作作过过程程可可形形象象归归纳纳为为小结结分分离目的基因切限制酶切目的基因与载体接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体重组组DNA技技术术操操作作的的主主要要步步骤骤载体质粒噬菌体病毒目的基因（外源基因）基因组DNAcDNA人工合成PCR产物限制酶消化开环载体DNA目的基因连接酶重组体转化体外包装，转染带重组体的宿主筛选表型筛选酶切电泳鉴定菌落原位杂交目录录表达达体体系系的的建建立立表达达载载体体的的构构建建受体体细细胞胞的的建建立立表达达产产物物的的分分离离纯纯化化（六六））克克隆隆基基因因的的表表达达1.原原核核表表达达体体系系（E.coli表表达达体体系系最最为为常常用用））标准准：：选择择标标志志强强启启动动子子翻译译调调控控序序列列多多接接头头克克隆隆位位点点E.coli表表达达体体系系的的不不足足不宜宜表表达达真真核核基基因因组组DNA不能能加加工工表表达达的的真真核核蛋蛋白白质质表达达的的蛋蛋白白质质常常形形成成不不溶溶性性包包涵涵体体(inclusionbody)很难难表表达达大大量量可可溶溶性性蛋蛋白白大鼠鼠胰胰岛岛素素原原cDNA的表表达达和和分分泌泌目录录优点点：：可表表达达克克隆隆的的cDNA及及真真核核基基因因组组DNA可适适当当修修饰饰表表达达的的蛋蛋白白质质表达达产产物物分分区区域域积积累累缺点点：：操作作技技术术难难、、费费时时、、经经济济转染染———将表表达达载载体体导导入入真真核核细细胞胞的的过过程程方法法：：磷酸酸钙钙转转染染DEAE葡葡聚