中医药研究常用分子生物学技术1课件

中医药研究常用分子生物学技术米丽华生物教研室2272304教学参考资料唐炳华、王继峰:医学分子生物学(第一版）,中国中医药出版社,2006年胡维新:医学分子生物学（第一版）,科学出版社,2007年T.A.Brown著，魏群等译：基因克隆和DNA分析（第五版），高等教育出版社，2003年王艳明、周坤福、徐力：分子生物学与中医药研究，上海中医药大学出版社，2000年RobertF.Weaver：MolecularBiology（3rd

ed

），

McGraw-HillPress.2005[美]J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著，黄培堂等译：分子克隆实验指南（第三版），科学出版社，2002年朱玉贤、李毅、郑晓峰：现代分子生物学（第三版），高等教育出版社，2007年教学参考资料卢圣栋：现代分子生物学实验技术，高等教育出版社，1993年J.D.WatsonetalMolecularBiologyoftheGene

5thTheBenjamin/CummingsPublishingCompany,Inc.2003Lewin,B.,GENES

Ⅷ.UniversityPress,Oxford.2004孙乃恩孙东旭朱德煦：分子遗传学（第二版），南京大学出版社，1997年网址：/（参见教材P274表7-3）第一章绪论一、什么是分子生物学分子生物学已广泛渗透到医学科学的各个领域，成为现代医学的理论基础。微生物学临床各学科细胞学免疫学病理学药理学生理学分子生物学二、分子生物学的主要研究内容

（一）分子生物学理论1、核酸的分子生物学：研究核酸的结构及其功能。分子遗传学（moleculargenetics）是其主要研究内容包括①核酸/基因组的结构，②遗传信息的复制，③转录与翻译，④核酸存储的信息突变与修复，⑤基因表达调控和基因工程技术的发展和应用等。遗传信息传递的中心法则（centraldogma）是其理论体系的核心。二、分子生物学的主要研究内容

（一）分子生物学理论：1、核酸的分子生物学：研究核酸的结构及其功能。2、蛋白质的分子生物学研究执行各种生命功能的蛋白质的结构与功能。3、细胞信号转导的分子生物学：研究细胞内、细胞间信息传递的分子基础。信号转导机理的研究在理论和技术方面与上述核酸及蛋白质分子有着紧密的联系，是当前分子生物学发展最迅速的领域之一。二、分子生物学的主要研究内容

（二）

分子生物学技术2、核酸操作技术核酸的提取和纯化；DNA、RNA合成技术；DNA重组技术；核酸杂交技术；DNA序列测定技术等。3、实用蛋白技术蛋白质的提取和纯化；蛋白质测定；蛋白质印迹技术；蛋白质质谱分析技术等。二、分子生物学的主要研究内容（三）分子生物学在医学中的应用如癌的分子生物学；免疫分子生物学；人类基因分析；基因产物的医学用途；新药的发现；基因诊断、治疗；人类疾病的分子生物学等。二、分子生物学的主要研究内容（二）现代分子生物学的建立和发展阶段

这一阶段是从50年代初到70年代初，以1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型作为现代分子生物学诞生的里程碑，开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代。

1、中心法则的建立Watson和Crick就提出DNA复制的可能模型。1956年A.Kornbery首先发现DNA聚合酶。1958年Meselson及Stahl用同位素标记和超速离心分离实验为DNA半保留模型提出了证明。1968年Okazaki（冈畸）提出DNA不连续复制模型。（二）现代分子生物学的建立和发展阶段1972年证实了DNA复制开始需要RNA作为引物

1958年Weiss及Hurwitz等发现依赖于DNA的RNA聚合酶

1961年Hall和Spiege-lman用RNA-DNA杂交证明mRNA与DNA序列互补

60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等几组科学家的共同努力破译了RNA上编码合成蛋白质的遗传密码

1970年Temin和Baltimore又同时从鸡肉瘤病毒颗粒中发现以RNA为模板合成DNA的反转录酶

2、对蛋白质结构与功能的进一步认识

1956-58年Anfinsen和White根据对酶蛋白的变性和复性实验，提出蛋白质的三维空间结构是由其氨基酸序列来确定的。

1958年Ingram证明正常的血红蛋白与镰刀状细胞溶血症病人的血红蛋白之间，亚基的肽链上仅有一个氨基酸残基的差别

1969年Weber开始应用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量

1973年氨基酸序列自动测定仪问世。

中国科学家在1965年人工合成了牛胰岛素。在1973年用1.8AX-线衍射分析法测定了牛胰岛素的空间结构，为认识蛋白质的结构做出了重要贡献。（三）初步认识生命本质并开始改造生命的深入发展阶段

70年代后，以基因工程技术的出现作为新的里程碑，标志着人类深入认识生命本质并能动改造生命的新时期开始。其间的重大成就包括：

1、重组DNA技术的建立和发展1967-1970年R.Yuan和H.O.Smith等发现的限制性核酸内切酶为基因工程提供了有力的工具；1972年Berg等将SV-40病毒DNA与噬菌体P22DNA在体外重组成功，转化大肠杆菌，使本来在真核细胞中合成的蛋白质能在细菌中合成,打破了种属界限；1、重组DNA技术的建立和发展1977年Boyer等首先将人工合成的生长激素释放抑制因子14肽的基因重组入质粒，成功地在大肠杆菌中合成得到这14肽

1979年美国基因技术公司用人工合成的人胰岛素基因重组转入大肠杆菌中合成人胰岛素。

1、重组DNA技术的建立和发展这时期基因工程的迅速进步得益于许多分子生物学新技术的不断涌现。

1975-1977年Sanger、Maxam和Gilbert先后发明了三种DNA序列的快速测定法；

1985年Cetus公司Mullis等发明的聚合酶链式反应（PCR）的特定核酸序列扩增技术；90年代全自动核酸序列测定仪的问世。

2、分子生物学技术的应用和发展

⑴癌基因的发现⑵基因诊断⑶基因组文库的建立⑷基因工程生产人胰岛素⑸转基因动物⑹人类基因治疗⑺基因工程抗体技术的建立和发展⑻DNA芯片技术（基因芯片、生物芯片）4、基因表达调控机理

1961年，Jacob，F.和Monod，J.提出了操纵子模型，打开了人类认识基因表达调控的窗口。20世纪70年代以后才逐渐认识了真核基因组结构和调控的复杂性。

1977年最先发现猴SV40病毒和腺病毒中编码蛋白质的基因序列是不连续的，揭开了认识真核基因组结构和调控的序幕。

1981年Cech等发现四膜虫rRNA的自我剪接，从而发现核酶（ribozyme）。

20世纪80-90年代，使人们逐步认识到真核基因的顺式调控元件与反式转录因子、核酸与蛋白质间的分子识别与相互作用是基因表达调控根本所在。

5、细胞信号转导机理研究的深入

1957Sutheland年发现cAMP、1965年提出第二信使学说，是人们认识受体介导的细胞信号转导的第一个里程碑。1977年Ross等用重组实验证实G蛋白的存在和功能，深化了对G蛋白偶联信号转导途径的认识。20世纪70年代中期以后，癌基因和抑癌基因的发现、蛋白酪氨酸激酶的发现及其结构与功能的深入研究、各种受体蛋白基因的克隆和结构功能的探索等，使近10年来细胞信号转导的研究更有了长足的进步。目前，对于某些细胞中的一些信号转导途径已经有了初步的认识。二十一世纪生物学的新热点及领域

结构生物学（StructuralBiology）

生物大分子的高级三维结构与功能的统一生物大分子之间的互作→基因的社会学分子发育生物学（MolecularDevelopingBiology）基因表达，基因互作

器官发生胚胎形成个体发育21世纪生命科学发展的重要态势对生命现象的认识从单基因水平向全基因组整体水平发展现代生命科学研究的理论与技术从较长期的积累走向应用四、分子生物学与其他医学基础学科的关系

生物化学与分子生物学关系最为密切。两者同在我国教委和科委颁布的一个二级学科中，称为“生物化学与分子生物学”。生物化学主要从化学角度研究生命现象，它着重研究生物体内各种分子的结构、转化和新陈代谢。传统生物化学的主要内容是各种物质代谢。分子生物学则着重阐明核酸和蛋白质的结构与功能的关系、细胞内信号转导途径和基因表达调控的机制。细胞生物学与分子生物学关系也十分密切。遗传学与分子生物学关系密切。由于分子生物学涉及认识生命的本质，它也就自然广泛的渗透到医学各学科领域中，成为现代医学重要的基础。

生理学、微生物学、免疫学、病理学、药理学以及临床各学科，分子生物学都正在广泛地形成交叉与渗透。

五、分子生物学技术在中医药研究中的应用

（一）在中医基础理论研究中的应用2、治则治法的研究科研人员用抑癌扶正行气活血法治疗经二乙基亚硝胺诱导的肝癌大鼠，采用DD-PCR（差异显示技术）和Northernbolt对治疗后大鼠肝组织进行检测，发现肝癌组织若干癌基因转录水平降低。（见P8）五、分子生物学技术在中医药研究中的应用

（二）在中医临床上的应用吴志奎等进行了“补肾生血方对β-地中海贫血基因水平的影响”的研究，结果发现，补肾生血药能明显提高β-地中海贫血患者血红蛋白（Hb）和抗碱血红蛋白（HbF），提高血红蛋白的珠蛋白链比。起作用机制可能是补肾生血药能提高珠蛋白链γ/β+γ比值，促进γ-珠蛋白基因的表达，诱导HbF合成，从而代偿了β-珠蛋白基因功能缺陷。五、分子生物学技术在中医药研究中的应用

（三）在针灸研究中的应用1、针刺镇痛与C-fos、C-jun、CC-k基因的研究2、耳针与表皮生长因子RACTH的研究3、电针抗痫与CCK基因表达的研究4、电针与抗脑缺血与C-fos原癌基因表达的研究5、针刺抑制老年大鼠与垂体细胞因子基因表达6、电针对细胞凋亡的影响7、针刺对脊髓背角内生长期相关蛋白GAP43表达的影响8、针刺对雌性大鼠垂体雌激素受体mRNA表达和血雌二醇（E2）水平影响的研究9、“醒脑开窍”针法对实验性脑梗死大鼠脑细胞核糖核酸的影响（四）在中药研究中的应用1、鉴定中药材及药用植物资源保护常用DNA分子标记法，其是指以DNA多态性为基础的遗传标记。

DNA分子遗传标记常用的方法是RAPD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA——随机引物扩增多态DNA)是1990年由Williams等发展起来的。分子标记主要应用：

遗传育种

生药鉴定和药材道地性

五、分子生物学技术在中医药研究中的应用

2、获取有效成分一是有关代谢途径基因工程的研究。

二是有关转基因动、植物反应器构建的研究。

3、在中药质量评价中的应用聚合酶链反应（Polymerasechainreaction，PCR）是1985年由美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室Mullis等人发明，具有划时代的意义的。PCR技术能以其准确、无误、迅速、简捷和毫无置疑的检测结果，证明药材的真伪，从而能够从根本上彻底解决中药材的造假问题。4、新药开发中药治疗癌症主要以扶正为主，提高机体本身的防御能力，我国二类抗癌新药还有攻击癌细胞的作用。如“威麦宁胶囊”以野生植物为原料，他对癌细胞RNA逆转录酶有抑制作用。

5、中药药理研究唐利龙等研究川穹嗪对原代培养血管平滑