泌尿生殖系统感染8联检检测试剂盒标准操作规程

泌尿生殖系统8联检检测试剂盒标准操作规程１目的明确泌尿生殖系统8联检检测试剂盒检测的操作规程，指导检验人员正确进行基因芯片检测。2适用范围2.1适用于进行泌尿生殖系统8联检的检验人员。2.2适合仪器：常规基因扩增仪、恒温杂交箱。2.3方法原理：采用PCR和DNA杂交相结合的DNA芯片技术。2.4样品要求：泌尿生殖道样本。2职责实验操作人员应严格按操作规程进行实验。4试剂来源《泌尿生殖系统8联检检测试剂盒》（昆明寰基生物芯片开发有限公司）。5质控物阴性对照来源于试剂盒6检验方法6.1仪器和耗材6.1.1无菌操作台；6.1.2基因扩增（PCR）仪（适用0.2mlPCR薄壁管）；6.1.3取样器（0.5-10μl、40-200μl、200-1000μl）；6.1.4台式离心机（转速可达12,000rpm）；6.1.5恒温培养箱（可恒温42℃）或可调42℃的保温台6.1.6水浴恒温振荡器（可恒温25℃）；6.1.7载玻片架及玻片洗脱容器2个；6.1.8芯片激光扫描仪(AxonGenePix4000B)；6.1.9PCR扩增所需一次性耗材。6.2检测前准备6.2.1芯片洗脱液配制（若10%SDS出现白色絮状沉淀，请于42℃条件加热至溶液透明后再使用）6.2.1.1在芯片洗脱容器中按照蒸馏水（或纯化水）:20×SSC:10%SDS=100:5:1配制洗脱液Ⅰ，洗脱液配制总体积应满足浸没芯片；6.2.1.2在芯片洗脱容器中按照蒸馏水（或纯化水）:20×SSC:10%SDS=400:1:4配制洗脱液Ⅱ，洗脱液配制总体积应满足浸没芯片；6.2.1.3洗脱液一次配制可连续使用15天，每个试剂盒中提供的洗脱液在一个月内用完。6.3样本处理6.3.1向采样管中加入1ml无菌生理氯化钠，充分震荡混匀，挤干棉拭子；6.3.2将全部液体转移至无菌1.5ml离心管中，12,000rpm离心5min；6.3.3弃上清，沉淀中加入无菌生理氯化钠1ml混匀，12,000rpm离心5min；6.3.4弃上清，沉淀中加入100μlDNA提取液，震荡混匀后100℃恒温处理10min（误差不超过1min）；6.3.5震荡混匀后12,000rpm离心5min，上清液为临床样本DNA；6.3.6取5μl阴性性参考品，加入50μlDNA提取液，震荡混匀后100℃恒温处理10min（误差不超过1min），震荡混匀后12,000rpm离心5min，上清液为参考品DNA。6.4PCR扩增及标记HPV检测按下表配制扩增-标记反应体系，按其循环参数在0.2mlPCR薄壁管中进行扩增和标记。反应体系循环参数组份加量（μl）95℃5min×1cycle;(94℃20s，57℃20s，65℃30s)×30cycles;(94℃20s,72℃30s)×5cycles;72℃5min×1cycle;95℃5min×1cycle.临床样本DNA或阴性参考品5.0PCR扩增试剂混合物12.5PCR扩增引物混合物7.5总体积25.06.5杂交6.5.1将恒温台或杂交箱开启升温恒定到42℃，用杂交模块将洗片固定好，预热10min。6.5.2将PCR产物加热至95℃（置于PCR仪中）变性5min,PCR产物变性完毕取出后，立即冰浴3min。6.5.3取75μl经50℃预热的杂交缓冲液和25μl临床样本扩增-标记产物充分混匀，将混合物全部滴加在芯片矩阵位置，（操作过程中禁止触碰到微阵列区，避免产生气泡）；6.5.4将保湿杂交盒水平放入42℃，恒温台上或恒温箱内杂交40min。6.6洗脱将芯片放入洗脱容器中，在25℃恒温水浴摇床100rpm震荡条件下进行洗脱。洗脱流程：洗脱液Ⅰ，5min；洗脱液Ⅱ，5min。洗脱完毕后，将芯片自然晾干或用专用的玻片离心机甩干即可进行扫描。6.7扫描及结果判定6.7.1将干燥后的芯片置于激光扫描仪中使用532nm波长激光扫描（按说明书操作），获得扫描数据及图谱；6.7.2按照说明书要求对检测数据进行分析，生成检测报告（为简化操作，数据判读可采用数据辅助分析软件进行）。【参考值】7判定值7.1.1芯片探针布局如图2所示，其中P为定位点，buffer为空白点，NC为阴性参考点，PC为阳性参考点，IC为提取对照点，HC为杂交对照点，6为人乳头状瘤病毒6亚型的检测探针；11为人乳头状瘤病毒11亚型的检测探针；16为人乳头状瘤病毒16亚型的检测探针等；7.1.2对于任意位点，其荧光值（荧光前景值-荧光背景值）≥2倍荧光背景值，判断该位点为“阳性”，否则该位点判断为“阴性”。注：数据分析时，荧光值数据采用其“中值”进行计算POSbuffer61116182631323334PCPOSbuffer61116182631323334PCPOSbuffer61116182631323334PCPOSbuffer61116182631323334PC353940424344455152535455353940424344455152535455353940424344455152535455353940424344455152535455IC56575859616266686970NCIC56575859616266686970NCIC56575859616266686970NCIC56575859616266686970NC717273818282/IS39838489bufferCTMG717273818282/IS39838489bufferCTMG717273818282/IS39838489bufferCTMG717273818282/IS39838489bufferCTMGHCMHNGTPUUHCMVT-RVTOCXHHV1HHV2bufferPOSHCMHNGTPUUHCMVT-RVTOCXHHV1HHV2bufferPOSHCMHNGTPUUHCMVT-RVTOCXHHV1HHV2bufferPOSHCMHNGTPUUHCMVT-RVTOCXHHV1HHV2bufferPOS图2.芯片探针布局7.2结果判读步骤7.2.1判断对照探针PC：若其4个重复位点中，满足“阳性”的位点数≥3，则继续进行第2.2步判读，否则判读结果为“失败”；7.2.2判断对照探针NC：若其4个重复位点中，满足“阴性”的位点数≥3，则继续进行第2.3步判读，否则判读结果为“失败”；7.2.3判断对照探针HC：若其4个重复位点中，满足“阳性”的位点数≥3，则继续进行第2.4步判读，否则判读结果为“失败”；7.2.4判断对照探针IC：若其4个重复位点中，满足“阳性”的位点数≥3，则判断对照探针IC为“阳性”，否则判断对照探针IC为“阴性”7.2.5判断病原体检测探针：例如，人乳头状瘤病毒6亚型检测探针6：若6探针的4个重复位点满足“阳性”的位点数≥3，则判为人乳头状瘤病毒6亚型检测结果为“阳性”；若某个探针的4个重复位点满足“阴性”的位点数≥3，则判该检测探针为“阴性”7.2.6重复第5步操作，对其它亚型等扫描数据进行判读；7.2.7整理判读结果，生成检测报告。8【检验结果的解释】8.1对阳性参考点PC不满足要求引起的判读“失败”，原因为扩增体系出现问题；8.2对阳性参考点HC不满足要求引起的判读“失败”，原因为杂交体系出现问题8.3对照探针IC判读为“阳性”，表明取样时取到人体脱落细胞；该探针判读为“阴性”，表明取样时未取到人体脱落细胞。若对照探针IC判读结果为“阴性”，且所有病原体检测探针均为“阴性”结果，建议重新取样检测。8.4阴性参考品检测反应中，若芯片判读结果出现某病原体探针“阳性”结果，则表示该次检测体系存在该探针污染。8.5阳性参考品检测反应中，若芯片判读结果出现某病原体探针“阴性”结果，则表示该次检测体系中该探针或对应检测反应失效。【检验方法的局限性】检测结果仅表示样本中是否有病原体DNA，不能区分活性病原体与非活性病原体。【产品性能指标】1本试剂盒可同时检测临床样本中人乳头状瘤病毒40种亚型，。2检测灵敏度：25基因拷贝/PCR反应管。3本试剂盒淋球菌检测探针与以下奈瑟菌属的其他奈瑟氏菌不存在交叉反应：脑膜炎奈瑟氏菌3株、微黄色奈瑟氏菌、乳糖奈瑟氏菌、深黄色奈瑟氏菌、灰色奈瑟氏菌、粘膜奈瑟氏菌、长型奈瑟氏菌、干燥奈瑟氏菌、多糖奈瑟氏菌。【注意事项】1本产品仅用于体外诊断，为一次性使用产品。2标本采集不当会导致检测结果错误。3实验室管理应严格按照PCR基因扩增试验室的管理规范，操作人员必须进行专业培训。4试剂使用前必须完全解冻，使用过程中应避免反复冻融。5在检测全程操作中，应遵循处理传染性物质和化学试剂操作的通用规范