新4ES胚胎干细胞课件

胚胎干细胞王锋王子玉逸夫楼308484395381南京农业大学动物(dòngwù)胚胎工程技术中心动物胚胎(pēitāi)工程之第一页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞内容个体发生过程干细胞的概念胚胎干细胞概念应用前景(qiánjǐng)面临的问题及解决办法第二页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞一、个体发生过程受精卵裂受精后72h受精后5-7天精子+卵子

合子卵裂球桑椹胚囊胚滋养层胎盘及胎儿附属结构囊胚内胚层消化道、呼吸道上皮和腺体；肝；胆；胰。内细胞群中胚层结缔组织；血液；肌肉；骨骼；泌尿生殖系统(shēnɡzhíxìtǒnɡ)外胚层体表结构；神经系统第三页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞第四页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞囊胚ICM第五页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞第六页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞二、干细胞的概念(gàiniàn)1、干细胞：具有自我复制的能力，在一定条件下能分化成各种功能(gōngnéng)细胞。第七页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞2、分类(fēnlèi)（1）全能干细胞，包括：胚胎干细胞（embryonicstemcells,ES细胞）生殖干细胞（embryonicgermcells,EG细胞）

具有全能性，能够分化成所有细胞类型，进一步形成机体的任何组织和器官。（2）多能(duōnénɡ)干细胞：具有分化成多种细胞和组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力。（3）专能干细胞：只能向一种或密切相关的两种类型的细胞分化。第八页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞第九页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞干细胞是一种能够分裂成与自身一致的细胞或几种特殊分化的细胞型的细胞。动物体内干细胞的正常作用是在发育的过程中可提供(tígōng)不同的细胞型,以生长成不同的组织和器官。它们也提供(tígōng)替代细胞以修复身体不同部分的损伤。第十页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞干细胞疗法就是利用已特殊分化的干细胞,通过特殊的途径提供细胞去替代那些在退行性过程和损伤(sǔnshāng)中失去的细胞。使用未分化干细胞也存在畸胎瘤和其他肿瘤形成的风险。第十一页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞目前人干细胞的主要来源或者潜在来源如下:①胚泡,可以提供多能干细胞;②胎儿组织(zǔzhī),可以提供多能或者专能干细胞;③脐带血,可以提供专能干细胞;④成人组织,可提供专能干细胞或单能干细胞。第十二页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞三、胚胎(pēitāi)干细胞1、概念胚胎干细胞(embryonicstemcells,ESC)是一种从早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞经分离(fēnlí)、体外培养、克隆等得到的具有发育全能性的细胞。ES细胞可不断保持增殖而不分化且在连续培养后仍能具有发育成三个胚层的潜能。这种细胞具有与早期胚胎相似的分化潜能和正常二倍体核型，因此兼有早期胚胎卵裂球及体细胞的某些特性。第十三页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞ES细胞的全能性（totipotenty），是指ES细胞在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力，即ES细胞发育成完整动物体的能力。其实质是细胞基因组中决定蛋白质编码的所有基因按一定的时空顺序依次(yīcì)表达。ES细胞是能在体外大量增殖的全能性细胞，可以为细胞的遗传操作和细胞分化研究提供丰富的实验材料。第十四页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞ES细胞全能性的检测方法是以胚胎干细胞进行细胞核移植。如果ES细胞能和去核的细胞融合发育成重构胚，而且经过胚胎移植，重构胚能发育形成(xíngchéng)个体，则表明ES细胞具有全能性。例如，将绵羊的类ES细胞注射到去核卵母细胞中，获得重构胚。重构胚经过胚胎移植，有活的羔羊产生，证明了绵羊的类ES细胞具有发育全能性。第十五页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞2、ES细胞(xìbāo)研究发展史1981年，英国剑桥大学的Evans和Kaufman用囊胚内细胞团(ICM)建立小鼠ES细胞系1998年美国Thomson从人的体外受精囊胚中分离得到了ES细胞。同年约翰霍普金斯大学的Shamblott等从人的PGC细胞中分离得到人的全能性干细胞。人ES细胞的分离成功给人类的基因治疗和器官移植打下了基础。其他动物(dòngwù)只获得了类ES细胞。第十六页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞1999年12月，美国《科学》杂志公布了当年世界科学进展的评定结果，干细胞的研究成果列在举世瞩目耗资巨大的人类基因组工程之前，名列十大科学进展首位。2002年3月，美国麻省理工学院的科学家宣布，他们首次利用人体胚胎干细胞培育出毛细血管，证明了胚胎干细胞技术在治疗心血管疾病等领域的应用潜力。目前已有报导ES细胞能在适当条件(tiáojiàn)下分化为心肌细胞，胰岛细胞，血管内皮细胞，肝细胞等。第十七页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞衍生自囊胚的内细胞团或原始外胚层的细胞；永生化(immortal)；能维持稳定的正常的二倍体染色体结构(jiégòu)；有稳定的发育潜能，能被诱导增殖或分化；能参与胎儿所有组织的发育过程；

3、胚胎(pēitāi)干细胞的性质第十八页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞4、胚胎干细胞系的建立(jiànlì)过程4.1概述(ɡàishù)第十九页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞第二十页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞第二十一页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞4.2胚胎干细胞的分离酶消化后培养免疫(miǎnyì)方法去处滋养层细胞流式细胞仪分离法第二十二页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞4.3培养条件：(1)特殊的培养液：用DMEM培养液，其中胎牛血清的浓度(nóngdù)和质量很重要，加非必须氨基酸；β-巯基乙醇。(2)以人或胚鼠的成纤维细胞为饲养层细胞。(3)必须加入LIF，抑制细胞分化。第二十三页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞早期(zǎoqī)胚胎及PGCs的培养将早期(zǎoqī)胚胎或PGCs置于饲养层或条件培养基上，在5%CO2、37－39度条件下进行培养。培养液一般为DMEEM+15%FCS。培养液中可添加多种细胞因子或分化抑制物，如LIF.EGF.IGF.3-巯基乙醇等。第二十四页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞传代进行体外培养(péiyǎng)时，当ICM增殖后或PGCs出现ES样克隆后即可传代。ESC的增殖速度很快，小鼠ESC每7－8h倍增一次;猪类ESC每20h倍增一次;羊类ESC，每40－50h倍增一次;牛类ESC每18－24h倍增一次。传代时一般是用胰酶EDTA消化，再用微吸管或拨针将其打散成单个细胞，然后移入新的饲养层上，培养几天后，即可出现新的克隆点，在其分化之前可以再进行传代。第二十五页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞

5.胚胎干细胞的鉴别

（1）细胞形态(xíngtài)与结构ES细胞形态表现为胞体小、泡状、核大(核质比高)、细胞聚集成集落生长（鸟巢状）、细胞排列紧密、无细胞界限、能连续稳定传代且不分化。（2）细胞功能（3）细胞表面的特殊标志：AKP阳性（4）细胞内特异基因的表达第二十六页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞第二十七页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞胚胎干细胞检测(jiǎncè)指标(1)细胞内碱性磷酸酶活性高(2)端粒酶活性高(3)不被Hoechst33342和Rhodamine123染色(4)细胞膜表面有特殊(tèshū)的标记：SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60,TRA-1-81。(5)能分化成三个胚层的细胞，将胚胎干细胞植入免疫缺陷小鼠皮下可产生畸胎瘤(6)可诱导分化为各种成体干细胞第二十八页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞ICM细胞EG细胞来源附置前早期胚胎内细胞团早期胎儿生殖嵴原始生殖细胞形态学直径一般为12～15μm直径一般15～18μm胰岛素样生长因子受体(Insulin-likereceptor,Igf2r)基因甲基化状态印记基因Igf2r包含1个母系甲基化位点和1个父系非甲基化位点印记基因Igf2r两个位点均处于非甲基化状态体内分化形成畸胎瘤不形成6.两种来源(láiyuán)的ES细胞的区别第二十九页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞7.ES细胞(xìbāo)的诱导分化第三十页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞第三十一页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞干细胞诱导分化(fēnhuà)的常用方法（1）加入诱导细胞分化的因子或化学物质，如VGEF、bFGF、DMSO和RA等（2）将ES细胞与特定的细胞共培养（3）将某种分化诱导因子的基因转入ES细胞内第三十二页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞四、ES细胞的应用(yìngyòng)前景胚胎干细胞（ES）成为当今生命科学和生物技术研究的热点。这与它具有“发育(fāyù)全能性”的神奇功能密切相关。干细胞是未分化的原始细胞。其中，全能干细胞能分化成人体200多种细胞类型，形成机体的任何细胞、组织和器官。第三十三页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞倘能掌握其分化发育的规律，在人工条件下定向分化为所需的细胞、组织乃至器官，就可以用来治疗目前(mùqián)还难以或无法治愈的帕金森氏病、早老性痴呆、白血病、糖尿病等顽症，并且解决十分紧缺的组织和器官移植的来源问题吗？进一步，与克隆技术相结合，运用体细胞核转移技术来得到ES，还能解决细胞治疗以及组织和器官移植的免疫排异难题。

第三十四页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞1.胚胎(pēitāi)干细胞研究的意义ES细胞特有的生物学特性(tèxìng),决定了其在生物学领域有着不可估量的应用价值。在进行ES细胞建系和定向分化的同时,以ES细胞为材料，在核移植、嵌合体、转基因动物研究等方面也进行了广泛的尝试,已经充分体现出ES细胞在加快良种家畜繁育、生产转基因动物、哺乳动物发育模型、基因和细胞治疗等方面有着广阔的应用前景。第三十五页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞近几年来，胚胎工程技术、基因工程技术、组织工程技术与ES细胞(xìbāo)研究的结合已经成为现实，将使相关的基础学科研究以及医药业、畜牧业等发生重大变化，走向一个新的时代。第三十六页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞2.胚胎(pēitāi)干细胞的用途为在细胞和分子水平研究研究哺乳动物早期胚胎发育规律(guīlǜ)提供了良好的材料和方法，是基因功能研究的有效手段。细胞分化机制，细胞癌变机理用于新药的发现、筛选及安全性实验：如药物机理及毒性实验重要的临床价值，可作为组织移植、细胞治疗和基因治疗的细胞来源：制造细胞、组织和器官；人ES定向诱导分化为人体器官；生产用于人类器官移植的动物器官：无免疫排斥；猪可以作为人异种器官移植的器官供体来源。第三十七页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞生产克隆动物：由于ES细胞(xìbāo)是具有全能性、未分化的细胞(xìbāo)，因此是制作克隆动物很好的核供体。生产转基因动物：建立转基因细胞系，抗病育种；药用蛋白第三十八页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞ES细胞可作为基因打靶的靶细胞，经打靶(dǎbǎ)引入定点整合外源基因，提高转基因动物的整合率和表达效果。ES细胞也可进行基因敲除，获得基因敲除动物，如猪可以作为人异种器官移植的器官供体来源。第三十九页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞在发育生物学基础研究中，利用ES细胞研究细胞分化的机埋，有助于阐明细胞分化调节的机制。ES细胞的多能性可以在一定培养条件下转化为特定的细胞。试验证明，体外诱导小鼠ES细胞的分化，可形成(xíngchéng)内脏卵黄囊、心肌层，也可以得到神经元样细胞和成纤维样的细胞。第四十页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞使人的ES细胞与猪等动物的胚胎结合，可得到人-猪嵌合体动物，由于ES细胞具有全能性，可分化形成不同胚层，包括(bāokuò)某些器官，这样的器官与人的器官具有相同的免疫特性，因此它不会对人产生排异反应。第四十一页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞人的ES细胞也可在体外定向诱导培养，生产人的肌肉、神经和造血细胞的细胞组织，在治疗人的某些疾病上有重要的应用价值。科学家们一直试图诱导各种(ɡèzhǒnɡ)干细胞定向分化为特定的组织来替代那些受损的体内组织，比如把产生胰岛素的细胞植入糖尿病患者体内。第四十二页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞科学家们已经能够使猪ES细胞转变为跳动的心肌细胞，使人ES细胞生成神经细胞和间充质细胞，并能使小鼠ES细胞分化为内胚层(pēicéng)细胞。这些结果为细胞和组织替代疗法开辟了道路。目前，科学家已成功分离到人ES细胞，而体细胞克隆技术为生产患者自身的ES细胞提供了可能。第四十三页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞治疗性克隆(kèlónɡ)：体细胞核移植（SCNT）去核卵细胞+体细胞核克隆囊胚分离内细胞群ES细胞第四十四页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞把患者(huànzhě)体细胞移植到去核卵母细胞中形成重组胚，把重组胚体外培养到囊胚，然后从囊胚内分离出ES细胞，获得的ES细胞使之定向分化为所需的特定细胞类型(如神经细胞、肌肉细胞和血细胞)，用于替代疗法。这种核移植法的最终目的是用于干细胞治疗，而非得到克隆个体，科学家们称之为“治疗克隆”。生殖性克隆第四十五页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞2.第四十六页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞ES细胞研究(yánjiū)的伦理问题ES研究也引发了当前最为激烈而敏感的伦理之争。主要围绕两个问题而展开：一是如何看待胚胎。ES主要有三个来源(láiyuán)：（1）（自然和人工）流产的胚胎；（2）辅助生殖剩余的胚胎；（3）通过体细胞核转移术得到的胚胎。第四十七页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞不管哪一个来源，提取ES必定会损毁胚胎。于是，胚胎是不是生命(shēngmìng)，是不是人，研究ES是不是“毁灭生命(shēngmìng)”、“杀人”，很自然地成为争论的焦点。国内认为：与“胚胎”的生命相比，“人”的生命具有优先权，可以杀死胚胎来救“人”的生命。第四十八页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞另一焦点在于，是否必然滑向生殖性克隆。2003年10月，联合国大会以80票赞成、79票反对、15票弃权的表决结果，将《禁止人的克隆生殖国际公约》推迟一年。世界各国都表示反对生殖性克隆，为什么这一国际公约通不过呢？因为79个国家认为治疗性克隆必然滑向生殖性克隆，主张二者同时禁止。治疗性克隆是ES研究的主要(zhǔyào)目的。封杀治疗性克隆，实际上就是要封杀ES研究。第四十九页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞ES细胞技术的发展(fāzhǎn)方向ES细胞维持自我更新和定向分化的分子机理ES细胞治疗技术的研究ES细胞作工具探讨基因功能和个体(gètǐ)的发生发育ES细胞治疗中的免疫排斥问题治疗型克隆技术分离ES细胞新途径的研究用ES细胞生产转基因家畜第五十页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞ES细胞具有可以无限地传代增殖，而且不改变其基因型和表现型的特点。

如果以ES细胞作为核供体进行核移植,可以在短时间内获得大量基因型和表现型完全相同的个体。

而且用ES细胞与胚胎进行嵌合克隆动物,可以解决哺乳动物远缘杂交的困难,生产(shēngchǎn)出珍贵的动物,也可以进行异种动物克隆,有助于保护珍惜野生动物。ES细胞(xìbāo)与动物克隆第五十一页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞尽管体细胞克隆与ES细胞克隆相比有着易于取材(qǔcái)的特点，但是体细胞克隆也存在着不少缺点，如生理和免疫缺陷，目前体细胞克隆还不能完全代替ES细胞克隆。第五十二页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞ES细胞作基因载体

目前常用的生产转基因动物的方法是向受精卵中注射DNA，外源基因的整合、表达和筛选(shāixuǎn)工作是在个体水平上进行的，不仅工作繁琐，周期长成功率低，产生的后代的遗传性状也常出现分离；

第五十三页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞而利用ES细胞作为基因载体，得到基因整合的细胞，将载体ES细胞直接进行(jìnxíng)核移植或者通过与胚胎嵌合获得嵌合动物，ES细胞在嵌合体中分化发育成全能性的生殖细胞，即可以得到携有目的基因的转基因动物。第五十四页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞因为一个优良的ES细胞系不仅可以用于各种目的基因转化，用各种方法将外源DNA导入细胞，而且外源基因的整合数目、位点、表达程序以及稳定性等都可以在细胞水平上进行加工，筛选，在很大程度(chéngdù)上加快了动物遗传工程的进程。第五十五页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞第五十六页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞改善ES细胞的体外培养条件，建立更有效更简便的获得ES细胞的方法。定向诱导分化成特定类型(lèixíng)细胞，用于临床疾病的治疗，并解决免疫排斥和潜在的致肿瘤的问题。成体干细胞的横向分化的能力以及与胚胎干细胞的比较，成体干细胞能否替代胚胎干细胞？第五十七页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞嵌合体实验和克隆(kèlónɡ)动物实验是将ES细胞与正常的胚胎融合制作嵌合体或将ES细胞作为核供体进行核移植，产生克隆动物后代。这两者是检验ES细胞的最有效、最有说服力的方法。第五十八页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞人的ES细胞可以高水平地表达端粒酶活性，二倍体的人体细胞不表达端粒酶，并且随着年龄(niánlíng)的增长端粒变短，而在组织培养达到一定增殖寿命时，就开始衰老。与此相反，端粒酶在生殖系和胚胎组织中都有很高的活性。ES细胞中的高水平端粒酶活性证实了它的寿命将超过体细胞。第五十九页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞ES细胞系的分离效率低ES细胞定向诱导(yòudǎo)分化的理论和技术水平低：随机的，运气。第六十页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞解决胚胎来源(láiyuán)有限的途径：未成熟卵的体外成熟第六十一页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞避免免疫排斥的方法（1）Knock-out胚胎(pēitāi)干细胞的组织相容性抗原（2）Knock-in受者的组织相容性抗原（3）与同一来源的造血干细胞一同移植（4）受者的体细胞核移植第六十二页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞第六十三页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞胚胎嵌合技术(jìshù)研究概况嵌合体(chimera)一词源于古希腊神话，其意是指狮头、羊身、龙尾等部分(bùfen)拼凑起来的怪兽。中国的“龙”：九似图腾在生物学上是指同一个体中，基因型相异的细胞或组织混合存在的状态。第六十四页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞天然(tiānrán)嵌合体？骡子(luózi)：不是。是杂种第六十五页，共七十六页。新4ES胚胎干细胞1.定义(dìngyì)嵌合体动物是指由两种或两种以上具有不同遗传性的细胞系组成的聚合胚发育成的个体。在卵裂期甚至受精卵期所形成的嵌合体为原发性嵌合体(成体中每个器官都有两种类型的细胞）。胚胎发育的晚期，通过(tōngguò)